专利名称：一段丙型肝炎病毒特异性cDNA序列的确定及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一段丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)特异性cDNA序列的确定及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
丙型肝炎是一种由输血或者血液制品引起的严重传染疾病，可引发肝脏损伤及肝癌等严重后果，准确的诊断是进行及时而可靠的治疗的依据，目前只能对丙型肝炎的诊断主要依靠血清学和免疫学方法。PCR和基因芯片诊断是一种快速而准确的检测方法。而这一类的诊断方法依赖于获得特异的核酸序列。
发明内容
本发明在于通过生物信息学和分子生物学技术，确定了一段丙型肝炎病毒特异核苷酸序列及其PCR引物。该序列和相应的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法进行丙型肝炎病毒的诊断。
本发明的技术方案为本发明通过NCBI数据库，按常规方法确定了长度为222bp的一段丙型肝炎病毒特异cDNA序列及其PCR引物，用引物进行PCR扩增，其序列如下caagcaccct atcaggcagt accacaaggc ctttcgcgac ccaacactac tcggctagtg60atctcgcggg ggcacgccca aatttctggg tattgagcgg gttattccaa gaaaggaccc120ggtcacccca gcgattccgg tgtactcacc ggttccgcag accactatgg ctctcccggg180agggggggtc ctggaggctg cacgacactc gtactaacgc ca 222引物序列为1.5’-caagcaccctatctggcagt-3’2.5’-tggcgttagtacgagtgtcg-3’上述丙型肝炎病毒的特异cDNA序列，可作为基因芯片诊断的探针、及PCR扩增临床丙型肝炎的检测试剂盒及相关产品开发、或直接用于PCR诊断的应用。
用本发明建立的临床检测技术所使用的方法具有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
图1为临床标本的PCR扩增图谱。1道为标准分子量标记；2，3，4，为阴性样本，没有扩增产物；5位阳性样本，扩增产物大小与预计的一致.
图2是测序图。其中图2是测定的序列图谱。
图3是用Blast软件对PCR扩增产物的测序结果与预计序列的比较分析。
图4-A、图4-B、图4-C、图4-D是基因数据库中Blast搜索结果。
图5为基因芯片杂交结果。
具体实施例方式1、首先以丙型肝炎病毒为关键词，在基因数据库中搜索丙型肝炎病毒的核苷酸序列。共获得数条关系较密切的核苷酸序列，将这些核苷酸序列用NCBI网上的Blast在线使用软件比对基因数据库中的核苷酸序列(nr)，排出非特异性的核苷酸序列，获得了丙型肝炎特异性的核苷酸序列。
2、以这段序列设计了30余对PCR引物，以临床标本提取RNA并逆转录成cDNA，进行PCR扩增，筛选到一对适合进行PCR扩增的序列及引物，PCR扩增获得的产物与预计大小一致(见图1)；采用临床阴性标本作为模板，没有扩增产物；采用临床阳性标本作为模板，可以得到很纯的扩增产物，大小222左右，与预计大小一致(见图1)。
3、PCR扩增产物用T-vector进行克隆，并测序(测序结果见图2)、通过Blast软件比对预计序列，显示与预计的序列一致(见图3)；序列用NCBI网站的Blast搜索基因数据库的DNA/cDNA序列，该序列只与丙型肝炎病毒的cDNA序列一致，而与其它的物种序列没有同源性(见图4)。
4、用这一序列标记后作为探针与含有3种血液传染类疾病感染病原物的15个基因位点的基因芯片杂交，只有本发明序列与此有杂交信号，而其它所有序列与此无杂交信号(见图5)，图中每个检测基因位点有四个重复，芯片共有15个不同的基因位点和3个对照位点。杂交结果表明只有本序列有特异信号，而其它均无杂交信号，表明该序列为丙型肝炎病毒的特异序列。
发明人将上述丙型肝炎病毒的特异cDNA序列，用作基因芯片诊断的探针、及PCR扩增临床丙型肝炎的检测试剂盒及相关产品开发、或直接用于PCR诊断的应用。
发明人使用云南省三家三甲医院提供的96例经多种临床检测方法确诊的丙型肝炎血样，以基因芯片检测的方法对本发明的该序列进行验证，总阳性符合率100％；采用丙型肝炎病毒以外的20种病原物及微生物样本以基因芯片检测的方法对该序列进行验证，总阴性符合率100％。
实际应用表明用本发明建立的临床检测技术所使用的方法确有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
SEQUENCE LISTING<110>云南大学<120>一段丙型肝炎病毒检测cDNA序列的确定及其应用<130>
<140>
<141>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>222<212>DNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)<220>
<221>gene<222>(1)..(222)<223>
<400>1caagcaccct atcaggcagt accacaaggc ctttcgcgac ccaacactac tcggctagtg60atctcgcggg ggcacgccca aatttctggg tattgagcgg gttattccaa gaaaggaccc120ggtcacccca gcgattccgg tgtactcacc ggttccgcag accactatgg ctctcccggg180agggggggtc ctggaggctg cacgacactc gtactaacgc ca 22权利要求
1.一段丙型肝炎病毒特异cDNA序列性的确定，通过NCBI数据库，按常规方法获得，其特征在于该段丙型肝炎病毒特异cDNA序列的长度为222bp，其cDNA序列及其PCR扩增引物如下caagcaccct atcaggcagt accacaaggc ctttcgcgac ccaacactac tcggctagtg 60atctcgcggg ggcacgccca aatttctggg tattgagcgg gttattccaa gaaaggaccc120ggtcacccca gcgattccgg tgtactcacc ggttccgcag accactatgg ctctcccggg180agggggggtc ctggaggctg cacgacactc gtactaacgc ca 222引物序列为引物15’-caagcaccctatctggcagt-3’引物25’-tggcgttagtacgagtgtcg-3’
2.权利要求1所述的丙型肝炎病毒特异cDNA序列，可作为作为基因芯片诊断的探针、及PCR扩增临床丙型肝炎的检测试剂盒及相关产品开发的应用。
全文摘要
本发明涉及一段丙型肝炎病毒特异性cDNA序列的确定及其应用，属于生物医学技术领域。本发明通过基因数据库资料的搜寻和分析，确定了一段丙型肝炎病毒特异性cDNA序列及PCR扩增引物，该序列长度为222bp。通过对人类生殖道丙型肝炎病毒感染标本的PCR扩增，克隆，获得该序列，测序证明与预计序列一致。再经生物信息学方法分析，基因芯片杂交分析，结果证实了该序列对于丙型肝炎病毒的特异性。丙型肝炎病毒特异性cDNA序列可作为诊断丙型肝炎病毒的基因芯片的探针序列，并通过上述的引物序列进行PCR扩增，标记后进行杂交检测或直接用于PCR诊断。用本发明建立的临床检测技术所使用的方法具有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
文档编号C12Q1/68GK1789423SQ20051001108
公开日2006年6月21日 申请日期2005年10月27日 优先权日2005年10月27日
发明者谭德勇, 余敏, 任永富, 马明星 申请人:云南大学