专利名称：一个与原发高血压相关联的易感基因及其应用的制作方法
技述领域本发明涉及一个与原发高血压相关联的易感基因及其应用，属生命科学技术领域。
背景技术：
原发性高血压(essential hypertension，EH)是指原因不明的高血压病，约占高血压病患者人群的95％。我国是高血压大国，据1991年全国高血压抽样调查结果表明，诊断标准为SBP≥140mmHg或DBP≥90mmHg，我国15岁以上高血压患病率为11.26％，我国2000-2001年有27.2％的35～74岁中国成人患有高血压，无论男女各年龄段高血压患病较1991年呈升高趋势，目前估计全国约有1.3亿患者。原发性高血压在我国和世界大部分地区是常见病、多发病。原发性高血压发病后，可在动脉系统、脑、心、肾等器官引起不同程度的病理性损害，是目前造成人类心脑血管疾病死亡的主要原因之一。因此，确定原发性高血压的病因，建立有效的防治方法，已成为、医学界乃致整个社会需迫切解决的问题。
目前认为原发性高血压是由多基因和环境因素共同作用导致的。遗传因素对血压的变化影响占30％-50％。随着分子生物学技术方法的广泛应用，寻找其易感性基因已成为近年来研究的重点。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在血压调节中起重要作用，该系统中候选基因多态性(例如血管紧张素原基因M235T，血管紧张素II类I型受体A1166C和血管紧素转化酶插入/缺失(I/D))与高血压相关性研究一直是人们关注的重点之一。醛固酮为RAAS的重要成份，有保钠排钾，使交感神经激活儿茶酚胺增多，动脉血压增高，在血压调节中起着重要作用。在体内，胆固醇经碳链裂解酶、3-β羟甾类脱氢酶、21-羟化酶及醛固酮合酶催化，由孕烯酮、黄体酮最后生成醛固酮。醛固酮合酶是体内合成醛固酮中最后一步生化反应的催化酶，具有11-β羟化酶、18-羟化酶和18-氧化酶的活性。它是一种线粒体内细胞色素P450氧化酶，主要分布在肾上腺皮质球状带，相应的基因CYP11B2基因位于8q24.3，包含9个外显子(Genebank Accessinon No.D13752)，全长6910bp，是原发性高血压一个重要候选基因。
发明内容
本发明的目的是通过CYP11B2基因遗传特异性的研究，提出一个可作为在判定原发性高血压的易感人群的方法中应用的易感基因，以利于指导高血压的预防和治疗。
一、易感基因的特征及获得方法本发明的一个与原发高血压相关联的易感基因，通过NCBI数据库，按常规方法获得，应该易感基因是序列长度为6910bp的CYP11B2基因；该基因的单核苷酸多态性是rs1799998，rs1799998位于启动子-344位(C-344T)；rs1799998碱基为T突为C；CYP11B2基因启动子区域序列为caggaggaga ccccatgtga ctccaggacc ctggttgata acaacgtatc gagattcctc 60acatggaacc agtgcgctcc tgtggtggag ggtgtacctg tgtcagggca gggggtacgt 120ggacattttc tgcagttttt gatcaatttt gcaatgaact aaatctgtgg tataaaaata 180aagtctatta aaagaatcca aggctccctc tcatctcacg ataagataaa gtccccatcc 240attttactcc tctcagccct ggagaaagga gaggccaggt cccaccacct tccaccagca 300tggaccccca gtccagaccc cacgcctttt ctcagcatcc tcagaccagc aggacttgca 360gcaatgggga attaggcacc tgacttctcc ttcatctacc tttggctggg ggcctccagc 420cttgaccttc gctctgagag tctcaggcag gtccagagcc agttctccca tgacgtgata 480tgtttccaga gcaggttcct gggtgagata aaaggatttg ggctgaacag ggtggagg 538本发明通过NCBI数据库，获得CYP11B2基因序列的具体步骤如下通过http//www.ncbi.nlm.gov/snp数据库，在CYP11B2基因上选择含有限制酶切位的单核苷酸多态性rs1799998。rs1799998位于启动子-344位(C-344T)。依据相应的碱基序列合成引物5’-CAG GAG GAG ACC CCA TGT GAC-3’(SEQ ID 2)和5’-CCT CCACCC TGT TCA GCC C-3’(SEQ ID 3)。PCR反应体系(15μl)1.5μl 10×TaqBuffer，1μl 2mM dNTP，1μl 25mMMgCl2，0.3μl 10mM Primer，1μl模板DNA(50ng)，0.5uTaq，用ddH2O补足15μl。PCR反应条件94℃3min；94℃30sec，67℃30sec，72℃30sec(35个循环)；72℃5min。扩增产物产物为538bp(参见SEQ ID 1)，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测。
PCR产物加入适量的N HaeIII内切酶及其酶切缓冲液，置37℃温箱3小时。酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察电泳带并摄片，根据酶切图谱判断基因型。如个体为TT型纯合子，酶切产生274bp、138bp和126bp三种片断，如为CC型纯合子酶切产生203bp、138bp、126bp和71bp四种片断，CT型杂合子酶切后产生274bp、203bp、138bp，126bp，71bp五种片段(参见图1)。
本发明的研究结果表明CYP11B2基因是与原发高血压相关联的易感基因，rs1799998碱基为C个体原发性高血压易感性高，CYP11B2基因可作为在判定原发性高血压的易感人群的方法中的应用。
二、易感基因的应用本研究以538份云南省哈尼族和彝族边远山区人群为研究对象(表1)，原发性高血压患者271例，其中哈尼族172例，彝族99例；入选标准收缩压≥140mmHg和舒张压≥90mmHg，排除继发性高血压及其它心血管疾病。正常对照组267例，其中哈尼族133例，彝族134例；入选项标准收缩压≤120mmHg和/或舒张压≤80mmHg，无高血压、糖尿病史及家族史，测量血压三次取平均值。
根据“知情同意”的原则，538受试者均由外周静脉抽取血2-5ml，加入ACD抗凝剂，采用常规酚氯仿法提取其DNA，-70℃保存。
病例-对照组研究结果显示哈尼族对照组(133人)和原发性高血压组(EH)(172人)rs1799998位点基因型TT、CT+CC分别为0.729、0.271和0.610、0.390；彝族正常对照组(134人)和EH组(99人)rs1799998多态性基因型TT、CT+CC分别为0.612、0.388和0.475、0.525，基因分型符合Hard-Weinberg平衡。经SPSS统计软件卡方检验，哈尼和彝族EH组CT+CC基因型频率均显著高于对照组(P＜0.05)(表2)。CYP11B2基因rs1799998碱基为C个体原发性高血压易感性高。
根据本发明由CYP11B2基因碱基突变特异性判定高血压的易感人群的方法，可对未表现高血压临床症状的人群进行如下所示方法的筛查，rs1799998碱基为C的个体为高血压易感人群。对高血压易感人群在日常生活中应尽量减少诱发因素，可降低高血压的发病率。
表1正常对照组和高血压组血压特征
*P＜0.001Table 2基因型分布与等位基因频率
根据本发明，可根据患者的基因型决定使用合适的降压药物或采用如基因敲除等基因工程方法有针对性的基因治疗。CYP11B2基因的碱基突变，可能造成蛋白质表达及功能异常。
本发明的CYP11B2基因及其编码蛋白对阐明原发性高血压遗传学机制及建立基因诊断方法，指导高血压预防、开发新型治疗药物具有重要作用。
图1显示多态性位点rs1799998的酶切图，其中，M为DNA分子量标准，1为PCR产物，2为TT纯合子，3为CC纯合子，4为CT杂合子。
具体实施例方式通过提取受试者基因组DNA进行单核酸多态性rs1799998的基因分型，其rs1799998碱基为C的个体为高血压的易感人群。具体作法是1.基因组DNA的提取受者均由外周由外周静脉抽取血2-5ml，加入ACD抗凝剂，采用常规酚氯仿法提取其DNA，-70℃保存。
2.PCR扩增目的片段用以下引物5’-CAG GAG GAG ACC CCA TGT GAC-3’(SEQ ID 2)和5’-CCT CCA CCCTGT TCA GCC C-3’(SEQ ID 3)进行PCR扩增。PCR反应体系(15μl)1.5μl10×TaqBuffer，1μl 2mM dNTP，1μl 25mMMgCl2，0.3μl 10mM Primer，1μl模板DNA(50ng)，0.5uTaq，用ddH2O补足15μl。PCR反应条件94℃3min；94℃30sec，67℃30sec，72℃30sec(35个循环)；72℃5min。扩增产物产物为538bp(参见SEQID 1)，用2.0％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测。
3.限制性内切酶酶切鉴定基因型酶切的反应体系为20μl，其中PCR产物10μl、HaeIII内切酶10U、酶切缓冲液2μl。置37℃温箱3小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察电泳带并摄片。如个体为TT型纯合子，酶切产生274bp、138bp和126bp三种片断，如为CC型纯合子酶切产生203bp、138bp、126bp和71bp四种片断，CT型杂合子酶切后产生274bp、203bp、138bp，126bp，71bp五种片段(见图1)。
4.结果判定rs1799998碱基为C的个体为原发性高血压易感人群。rs1799998碱基为T的个体为不易发高血压。
肖春杰CYP11B2序列表-改2SEQUENCE LISTING<110>云南大学<120>一个与原发高血压相关联的易感基因及其应用<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>538<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>promoter<222>(1)..(538)<400>1caggaggaga ccccatgtga ctccaggacc ctggttgata acaacgtatc gagattcctc 60acatggaacc agtgcgctcc tgtggtggag ggtgtacctg tgtcagggca gggggtacgt 120ggacattttc tgcagttttt gatcaatttt gcaatgaact aaatctgtgg tataaaaata 180aagtctatta aaagaatcca aggctccctc tcatctcacg ataagataaa gtccccatcc 240attttactcc tctcagccct ggagaaagga gaggccaggt cccaccacct tccaccagca 300tggaccccca gtccagaccc cacgcctttt ctcagcatcc tcagaccagc aggacttgca 360gcaatgggga attaggcacc tgacttctcc ttcatctacc tttggctggg ggcctccagc 420cttgaccttc gctctgagag tctcaggcag gtccagagcc agttctccca tgacgtgata 480tgtttccaga gcaggttcct gggtgagata aaaggatttg ggctgaacag ggtggagg538<210>2<211>21<212>DNA<213>artificial<220>
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权利要求
1.一个与原发高血压相关联的易感基因，通过NCBI数据库，按常规方法获得，其特征在于易感基因是序列长度为6910bp的CYP11B2基因；该基因的一单核苷酸多态性是rs1799998，rs1799998位于启动子-344位(C-344T)；rs1799998碱基为T突为C；CYP11B2基因启动子区域序列为caggaggaga ccccatgtga ctccaggacc ctggttgata acaacgtatc gagattcctc 60acatggaacc agtgcgctcc tgtggtggag ggtgtacctg tgtcagggca gggggtacgt 120ggacattttc tgcagttttt gatcaatttt gcaatgaact aaatctgtgg tataaaaata 180aagtctatta aaagaatcca aggctccctc tcatctcacg ataagataaa gtccccatcc 240attttactcc tctcagccct ggagaaagga gaggccaggt cccaccacct tccaccagca 300tggaccccca gtccagaccc cacgcctttt ctcagcatcc tcagaccagc aggacttgca 360gcaatgggga attaggcacc tgacttctcc ttcatctacc tttggctggg ggcctccagc 420cttgaccttc gctctgagag tctcaggcag gtccagagcc agttctccca tgacgtgata 480tgtttccaga gcaggttcct gggtgagata aaaggatttg ggctgaacag ggtggagg 538
2.权利要求1所述的易感基因，其特征在于该易感基因作为在判定原发性高血压的易感人群的方法中的应用。
全文摘要
本发明涉及一个与原发高血压相关联的易感基因及其应用，属生命科学技术领域。本发明的易感基因通过NCBI数据库，按常规方法获得，该易感基因是序列长度为6910bp的CYP11B2基因；该基因的单核苷酸多态性是rs1799998，rs1799998位于启动子－344位(C－344T)；rs1799998碱基为T突为C。该易感基因作为在判定原发性高血压的易感人群的方法中的应用。当rs1799998碱基为C个体原发性高血压易感性高、rs1799998碱基为T的个体为不易发高血压。本发明的CYP11B2基因及其编码蛋白对阐明原发性高血压遗传学机制及建立基因诊断方法，指导高血压预防、开发新型治疗药物具有重要作用。
文档编号C12Q1/68GK1786166SQ20051001107
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月19日 优先权日2005年10月19日
发明者肖春杰, 唐文如, 周旭红, 陈穗云, 武红艳 申请人:云南大学