专利名称：一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶基因及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
植物寄生线虫对农作物、林木和食用菌等都可造成严重危害。由于传统的轮作与化学防治的局限性和弊端，使植物寄生线虫的生物防治成了植物线虫病害综合治理研究的前言和热点。蛋白酶能有效地降解线虫体壁，协助杀线虫生物完成侵染过程，是线虫侵染的重要毒力因子，但至今没有从杀线虫细菌中获得可降解线虫体壁的蛋白酶基因。所以在实验细菌中，新的可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶基因发现与克隆为运用基因工程技术进行线虫生防的遗传改良奠定重要基础。
发明内容
本发明人在开展杀线虫细菌研究中，获得一株具有杀线虫功能的食线虫芽孢杆菌Bacillus nematocidus B16，B16菌株已于2004年4月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏登记入册的编号CGMCC No.1128。
本发明通过分离纯化、性质鉴定、简并引物设计等技术，从B16菌株中分离、纯化出一种新的可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶，并克隆出相应的基因。该基因全长约1163 bp DNA序列，共编码382个氨基酸残基。其中15-104bp为信号肽编码序列，105-335bp为前肽编码序列，336-1160bp为成熟肽编码序列。应用该基因所编码的碱性丝氨酸蛋白酶作用活体线虫P.redivius，作用24小时后，可以观察到90％以上的线虫死亡；48小时后，大多数死亡线虫体壁降解；而用作阴性对照的缓冲溶液PBS以及经煮沸后的酶液处理线虫24小时后，线虫死亡率在10％以下。同时利用该基因编码的蛋白酶处理纯化的线虫体壁，在解剖显微镜下可以观察到大量的不完整的线虫体壁碎片，表明该碱性丝氨酸蛋白酶对线虫体壁具有明显的降解作用。
本发明通过分析验证实验，证实该基因所编码的蛋白酶能有效地降解线虫体壁。所以，该基因可以用来研究蛋白酶在侵染线虫过程中的生化本质，并作为获得高效生防菌株的靶基因。
附表1食线虫芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶对活体线虫P.redivivus的毒杀作用
图1为本发明基因所编码的碱性蛋白酶的纯化以及SDS-PAGE电泳结果。图中A.疏水层析结果。其中洗脱峰1具有蛋白酶和杀线虫活性；B.阳离子交换层析结果。图中所标注的洗脱峰同时兼备蛋白酶和杀线虫活性；C.蛋白酶的SDS-PAGE电泳结果。泳道1为标准分子量；泳道2、3为疏水层析后的穿透峰；泳道4为疏水层析后的洗脱峰2；泳道5、6为疏水层析后获得的兼备蛋白酶、杀线虫活性的洗脱峰1；泳道7为阳离子交换层析后的穿透峰；泳道8为阳离子交换层析后获得的洗脱峰，即目标碱性蛋白酶。本发明基因所编码的目标碱性蛋白酶分子量为28kDa。
图2为本发明基因所编码的碱性蛋白酶处理活体线虫P.redivius24、36、48小时后，线虫死亡以及体壁降解情况(D、E为为阴性对照)。
图3为本发明基因的编码产物在24小时内对纯化的线虫体壁的水解作用(B，C为阴性对照)。
具体实施例方式1、将B16菌株采用LB培养基按常规液体发酵方法扩大培养后，收集发酵液，离心获得上清液，将上清液用(NH4)2SO4饱和盐析出粗蛋白酶液并透析后，作用于线虫，确认了该蛋白酶具有降解线虫体壁的毒杀功能。
2、将菌株的发酵上清液首先用40％-70％的(NH4)2SO4分级盐析，离心，将沉淀用pH7.5的磷酸缓冲液溶解，上疏水离子层析柱HiPrep 16/10分离纯化蛋白酶，收集洗脱峰，获得同时具有蛋白酶活性与杀线虫活性的组分。调节目的组分溶液pH到6.0并透析，再上阳离子交换柱Source 15Q PE4.6/100分离纯化，收集洗脱峰部分得到电泳纯蛋白酶(见图1)。
3、将纯化的蛋白酶加入到活体腐生线虫P.redivius，每12小时观察碱性蛋白酶对线虫生存率的影响(见图2)。
4、将纯蛋白酶液加入纯化的线虫体壁中，每12小时用光学显微镜观察线虫体壁变化，由此再次确定其蛋白酶降解线虫体壁的功能(见图3)。
5、纯化的碱性丝氨酸蛋白酶性质鉴定1)SDS-PAGE检验出其分子量约28kDa，水解生色底物(azocoll)的最适反应温度为50℃，最适pH为10，在碱性pH范围内有最大酶活性。
2)PMSF能够完全抑制纯化蛋白酶活力，表明该蛋白酶对作用于巯基的试剂敏感，其活性中心含有丝氨酸残基，属于丝氨酸蛋白酶类。
3)底物特异性实验表明该蛋白酶的底物范围较宽，专一性不高，不但能降解普通蛋白酶底物，如酪蛋白，明胶等，而且能有效地降解线虫体壁，破坏其完整性。
6、采用水浴式电印迹法转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上进行氨基末端序列分析，HPLC洗脱曲线的PTH氨基酸峰鉴定为NH2-A-Q-S-V-P-Y-G-V-S-Q。
7、本N末端序列在GenBank数据库进行BLAST，与其序列完全一致的是来自Bacillus.amyloliquefaciens的Subtilisin BPN’序列，序列号为GI14252，由此选取启始密码与终止密码附近同源性较高的片段设计兼并引物。
8、用PCR方法克隆基因，测序结果用看图软件Chromas校读、经初步分析排除错误碱基。以本序列在GenBank数据库进行BLAST，与B.amyloliquefaciens的Subtilisin BPN’的基因序列有93％的同源性，同时与B.Subtilis的Subtilisin有92％的同源性。
根据上述的研究结果，该基因编码一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶，该蛋白酶能使线虫在24小时内死亡率达90％，并使纯线虫体壁在24小时内被破坏，该基因是目前唯一明确报道的来自细菌、其产物可以降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶基因。因此该基因能用来研究蛋白酶在侵染线虫过程中的生化本质，可应用于植物寄生线虫生物防治。
SEQUENCE LISTING<110>云南大学<120>一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶基因及其应用<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1163<212>DNA<213>Bacillus sp.
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1.一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶基因，其特征在于1.1该基因克隆于食线虫芽孢杆菌(Bacillus nematocidus)B16，B16菌株已于2004年4月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏登记入册的编号CGMCC No.1128；1.2该基因全长约1163bp DNA序列，共编码382个氨基酸残基，其中15-104bp为信号肽编码序列，105-335bp为前肽编码序列，336-1160bp为成熟肽编码序列。
2.权利要求1所述的可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶基因的应用，其特征在于该基因能用来研究蛋白酶在侵染线虫过程中的生化本质，并可应用于植物寄生线虫生物防治。
全文摘要
本发明涉及一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶基因及其应用，属于生物技术领域。该基因克隆于食线虫芽孢杆菌(Bacillus nematocidus)B16，基因全长1163bp DNA序列，共编码382个氨基酸残基，其中15－104bp为信号肽编码序列，105－335bp为前肽编码序列，336－1160bp为成熟肽编码序列。本发明基因所编码的蛋白酶通过降解线虫体壁而对线虫具有效好的毒杀作用，可应用于植物寄生线虫生物防治上。
文档编号C12N15/57GK1683539SQ200510010688
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者黄晓玮, 牛秋红, 周薇, 张克勤 申请人:云南大学