转基因大豆深加工产品三重巢式pcr检测方法

专利名称：转基因大豆深加工产品三重巢式pcr检测方法
技术领域：
本发明是一种转基因成分的准确检测方法，具体地说是转基因大豆深加工产品进行定性检测和对产品中的GMO含量进行定量检测以便标识的方法。
背景技术：
随着各国有关转基因生物(genetically modified organism，GMO)标签法的建立和不断完善，转基因成分的准确检测也显得日趋重要，很多国家不但要求对转基因产品进行定性检测，还需要对产品中的GMO含量进行定量检测，以便标识。欧盟等国家和地区先后出台转基因产品的标签制度，出入境产品必须出具是否含有转基因成分的检测报告。近年来，我国大量进口转基因大豆用于加工，由于市场标识不够，使我国加工产品出口贸易遭受损失。为了加强对农业转基因生物的安全管理，保障人体健康，规范转基因产品的销售行为，引导和保护消费者的知情权，农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，该办法规定了在中国境内需要标识的第一批转基因生物及其产品，即大豆、玉米、油菜、棉花和番茄等5类17种产品。目前国内的相关标准较为混乱，出现了一些技术标准不一致、法规滞后、与国际惯例不接轨等现象，致使某些产品实行国际、国内市场“双重标准”，没有依照中国有关转基因食品的规定贴上相关标识，侵害了中国消费者的利益。
大豆深加工制品已越来越多，如卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆油等食品，其加工呈现复杂化和多元化的特点，在国内外仍然没有适合的标准依据进行检测。“乐之事件”以及“雀巢食品含转基因”事件都表明，我国在转基因市场的管理上确实存在漏洞，对转基因食品的监督力度不足，造成了企业有法律空子可钻。要完善、健全我国的转基因产品管理制度，首要问题是要解决我国尚未统一的检测标准问题，同时要提高转基因检测的精确度，以保证我国消费者的利益。
目前，欧盟率先倡导并实行转基因标识并要求产品成分中转基因含量大于1％时必须进行标识，因此其检测技术早已经成熟，检测下限达0.1％。国内一些机构，尤其进出口检疫局也相继建立检测实验室，技术趋于成熟，但还只限于对转基因原料的检测，在深加工产品的检测技术的研究上还很不成熟，没有统一的检测标准，检测结果不稳定。深加工产品转基因检测所需的DNA提取技术在国外尚处于研究阶段，并没有形成系列化技术，商品化的提取试剂盒种类单一。由于深加工产品种类繁多，生产工艺复杂，而深加工品DNA提取技术应该是一系列技术，提取试剂盒也应该是多样化，不同产品采用不同试剂盒，因此，缺乏针对不同深加工转基因产品的DNA提取技术。

发明内容
本发明目的是公开一种转基因大豆深加工产品三重巢式PCR检测方法。其检测方法为1.DNA提取将大豆标准品粉末及其它待检样品根据WizardMagnetic DNAPurification System for Food试剂盒操作说明分别进行DNA提取，并稍做改动。
2.DNA样品浓度检测DNA浓度通过核酸蛋白分析仪和电泳-EB染色的荧光强度双重测定。
3.引物设计利用Primer Premier V5.0软件进行三重巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物。引物所扩增目的片段及扩增产物大小为。
(1)第一轮三重PCR所用引物引物名称Lec EF 序列(5′→3′)cgccgcttccttcaacttLec ER 序列(5′→3′)gctggtggaggcatcatag位置Lectin内源基因外引物扩增片段大小310
引物名称SC EF 序列(5′→3′) gacgcacaatcccactatccSC ER 序列(5′→3′)ctgtagccactgatgctgaaa位置35S启动子与CTP接合区域外引物扩增片段大小357引物名称EN EF 序列(5′→3′)cgtgatgaacggtctggaaEN ER 序列(5′→3′) caggcagccttcgtatcg位置CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域外引物扩增片段大小421(2)第二轮三重PCR所用引物引物名称Lec EF 序列(5′→3′)caagtcgtcgctgttgagtLec IR 序列(5′→3′)gtcgttttgatggatctgatag位置Lectin内源基因内引物扩增片段大小101引物名称SC IF 序列(5′→3′)cgcacaatcccactatcctSC IR 序列(5′→3′)agcttgtcagcgtgtcctc位置35S启动子与CTP接合区域内引物扩增片段大小82引物名称EN IF 序列(5′→3′)aaaaccctgtcacggtggaEN IR 序列(5′→3′)caggcagccttcgtatcg位置CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域内引物扩增片段大小1154.三重巢式PCR反应体系4-1.第一轮三重PCR反应体系及反应条件在第一轮三重PCR反应体系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR缓冲液，引物混合液I 10μL，DNA聚合酶4U，补水至50μL。扩增条件为95℃预变性10min；95℃变性40s，54℃退火45s，65℃延伸60s，共30个循环；最后65℃延伸10min。
4-2.第二轮三重PCR反应体系及反应条件取第一轮多重PCR产物1μL作为模板，进行三重巢式PCR第二轮扩增。反应体系加引物混合液II 10μL，DNA聚合酶3U，其余同前。扩增条件为95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火45s，65℃延伸45s，共38个循环；最后65℃延伸5min。
5.扩增产物检测两轮扩增产物用琼脂糖电泳检测。琼脂糖胶浓度为3％，胶中溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，电泳缓冲液为1×TAE，以50bp ladder DNA和DL 2000DNA做分子质量标准，电泳条件为以10V/cm电压，电泳1h。
6.结果6-1DNA提取所选材料均是大豆深加工产品，使用WizardMagnetic DNAPurification System for Food试剂盒可以满足三重巢式PCR扩增的需要，但实际测量所提取DNA样品的OD260值低于0.1以及OD260/OD280也小于1.5，进行电泳检测时也观察不到DNA条带，说明所提取DNA样品浓度很低。
6-2第一轮扩增结果第一轮扩增结果见图1，仅阴性对照和阳性对照能够观察到扩增条带，其它泳道未看到扩增结果。阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为310bp、357bp和421bp。阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除RR大豆转基因成分污染的可能；阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；空白对照无扩增条带说明PCR反应体系无污染。
6-3第二轮扩增结果第二轮扩增结果，阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为101bp、82bp和115bp。卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出三条特异性条带；大豆粗油仅扩增出Lectin基因；大豆精炼油和大豆色拉油未检出任何条带。
6-4外引物扩增灵敏度分析第一轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.5％RR大豆标准品利用三对外引物能够同时扩增出三个目的基因，0.05％标准品只能扩增出Lectin和EPSPS-NOS基因，说明第一轮三重PCR的灵敏度为0.5％。
6-5内引物扩增灵敏度分析第二轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.005％RR大豆标准品利用三对内引物能够同时扩增出较为清晰的三个目的基因，0.0005％标准品只能扩增出Lectin和35S-CTP基因，说明第二轮三重PCR的灵敏度为0.005％。
本发明提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对豆油等转基因深加工食品进行DNA检测，具有实际意义。


图1为本发明三重巢式PCR各引物间位置关系示意图；图2为本发明外引物扩增结果的电泳图；图3为本发明内引物扩增结果的电泳图；图4为本发明第一轮扩增检测灵敏度分析；图5为本发明第二轮扩增检测灵敏度分析。
具体实施例方式图1为三重巢式PCR各引物间位置关系；第一轮扩增结果；第一轮扩增结果见图1，仅阴性对照和阳性对照能够观察到扩增条带，其它泳道未看到扩增结果。阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为310bp、357bp和421bp。阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除RR大豆转基因成分污染的可能；阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；空白对照无扩增条带说明PCR反应体系无污染。
图2为外引物扩增结果的电泳图，其中M1，DL 2000分子质量标准；1，卵磷脂；2，大豆蛋白质粉；3，巧克力饮品；4，婴儿米粉；5，大豆粗油；6，大豆精炼油；7，大豆色拉油；8，阴性对照；9，阳性对照；10，空白对照；M2，50bp DNA ladderDNA分子质量标准。
第二轮扩增结果第二轮扩增结果见图2，阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为101bp、82bp和115bp。卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出三条特异性条带；大豆粗油仅扩增出Lectin基因；大豆精炼油和大豆色拉油未检出任何条带。
图3为内引物扩增结果的电泳图，其中M1，DL 2000分子质量标准；1，卵磷脂；2，大豆蛋白质粉；3，巧克力饮品；4，婴儿米粉；5，大豆粗油；6，大豆精炼油；7，大豆色拉油；8，阴性对照；9，阳性对照；10，空白对照；M2，50bp DNA ladderDNA分子质量标准外引物扩增灵敏度分析第一轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.5％RR大豆标准品利用三对外引物能够同时扩增出三个目的基因，0.05％标准品只能扩增出Lectin和EPSPS-NOS基因，说明第一轮三重PCR的灵敏度为0.5％。
图4为第一轮扩增检测灵敏度分析为M1，DL 2000分子质量标准；1-7RR大豆含量分别为5％、5×10-1％、5×10-2％、5×10-3％、5×10-4％、5×10-5％、5×10-6％；8，阴性对照；9，阳性对照；10，空白对照；M2，50bp DNA ladder分子质量标准M1，DL 2000Marker 1-7The content of RR soy is 5％，5×10-1％，5×10-2％，5×10-3％，5×10-4％，5×10-5％，5×10-6％，respectively；8，negative control；9，positive control；10，blank control；M2，50bp DNA ladder Marker
内引物扩增灵敏度分析第二轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.005％RR大豆标准品利用三对内引物能够同时扩增出较为清晰的三个目的基因，0.0005％标准品只能扩增出Lectin和35S-CTP基因，说明第二轮三重PCR的灵敏度为0.005％。
图5为第二轮扩增检测灵敏度分析，其中M1，DL2000分子质量标准；1-7RR大豆含量分别为5％、5×10-1％、5×10-2％、5×10-3％、5×10-4％、5×10-5％、5×10-6％；8，阴性对照；9，阳性对照；10，空白对照；M2，50bp DNAladder分子质量标准M1，DL 2000Marker 1-7The content of RR soy is 5％，5×10-1％，5×10-2％，5×10-3％，5×10-4％，5×10-5％，5×10-6％，respectively；8，negative control；9，positive control；10，blank control；M2，50bp DNA ladder Marker本发明检测方法的用途多重巢式PCR技术是十分有效的基因检测技术，在国内外刚刚兴起，因此建立有效的多重巢式PCR技术对于深加工制品的检测技术研究具有重要的意义。本研究将在国内外率先建立大豆深加工制品的有效检测技术，技术具有快捷、准确、灵敏、经济的诸多优点，将切实解决大豆深加工制品的检测技术难题，本研究成果将成为大豆深加工制品转基因检测的行业标准，在大豆深加工制品转基因检测中发挥重要的作用。
本检测方法的适用范围标准品RR大豆，非转基因大豆，待检深加工产品卵磷脂、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆蛋白质粉、大豆粗油、大豆精炼油和大豆色拉油。
实验试剂WizardMagnetic DNA Purification System for Food试剂盒；TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液(含MgCl2)、50bp ladder DNA和DLDNA2000分子质量标准；特异引物。
仪器设备离心机(上海安亭，TDL-40B)、PCR仪(德国Biometra，BiometraTgradient)、核酸电泳仪(杭州大合，GE-100)、紫外分光光度仪(美国BECKMAN，DU640)、凝胶成像系统(美国UVP，G8000)。
本发明检测方法的优点多重巢式PCR是近几年兴起的检测技术，它结合了巢式PCR的灵敏度高和多重PCR的操作简单、特异性高的特点，这两种方法的结合不但可以减少假阳性的出现，可以同时检测多个目的片段，而且可以使检测的下限下降几个数量级。多重PCR技术多应用在疾病诊断和病毒鉴定具有快速、灵敏、专一、可靠等特点，可以代替传统的诊断方式。目前为止该技术还未应用在转基因加工产品的检测中。
多重巢式PCR的检测，提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对豆油等转基因深加工食品进行DNA检测，具有实际意义。
权利要求
1.一种转基因大豆深加工产品三重巢式PCR检测方法，其检测方法为(1).DNA提取将大豆标准品粉末及其它待检样品根据WizardMagneticDNA Purification System for Food试剂盒操作说明分别进行DNA提取，并稍做改动；(2).DNA样品浓度检测DNA浓度通过核酸蛋白分析仪和电泳-EB染色的荧光强度双重测定；(3).引物设计利用Primer Premier V5.0软件进行三重巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物；引物所扩增目的片段及扩增产物大小为；(3-1)第一轮三重PCR所用引物引物名称Lec EF 序列(5′→3′)cgccgcttccttcaacttLec ER 序列(5′→3′)gctggtggaggcatcatag位置Lectin内源基因外引物扩增片段大小310引物名称SC EF 序列(5′→3′)gacgcacaatcccactatccSC ER 序列(5′→3′)ctgtagccactgatgctgaaa位置35S启动子与CTP接合区域外引物扩增片段大小357引物名称EN EF 序列(5′→3′)cgtgatgaacggtctggaaEN ER 序列(5′→3′)caggcagccttcgtatcg位置CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域外引物扩增片段大小421(3-2)第二轮三重PCR所用引物引物名称Lec EF 序列(5′→3′)caagtcgtcgctgttgagtLec IR 序列(5′→3′)gtcgttttgatggatctgatag位置Lectin内源基因内引物扩增片段大小101引物名称SC IF 序列(5′→3′)cgcacaatcccactatcctSC IR 序列(5′→3′)agcttgtcagcgtgtcctc位置35S启动子与CTP接合区域内引物扩增片段大小82引物名称EN IF 序列(5′→3′)aaaaccctgtcacggtggaEN IR 序列(5′→3′)caggcagccttcgtatcg位置CP4-EPSPS外源基因与NOS接合区域内引物扩增片段大小115(4).三重巢式PCR反应体系(4-1).第一轮三重PCR反应体系及反应条件在第一轮三重PCR反应体系中，加DNA模板1μL(500ng)，dNTP各0.2mmol/L，2×PCR缓冲液，引物混合液I 10μL，DNA聚合酶4U，补水至50μL；扩增条件为95℃预变性10min；95℃变性40s，54℃退火45s，65℃延伸60s，共30个循环；最后65℃延伸10min；(4-2).第二轮三重PCR反应体系及反应条件取第一轮多重PCR产物1μL作为模板，进行三重巢式PCR第二轮扩增；反应体系加引物混合液II 10μL，DNA聚合酶3U，其余同前；扩增条件为95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火45s，65℃延伸45s，共38个循环；最后65℃延伸5min；(5).扩增产物检测两轮扩增产物用琼脂糖电泳检测；琼脂糖胶浓度为3％，胶中溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，电泳缓冲液为1×TAE，以50bp ladder DNA和DL 2000 DNA做分子质量标准，电泳条件为以10V/cm电压，电泳1h；(6).结果(6-1)DNA提取所选材料均是大豆深加工产品，使用WizardMagnetic DNAPurification System for Food试剂盒可以满足三重巢式PCR扩增的需要，但实际测量所提取DNA样品的OD260值低于0.1以及OD260/OD280也小于1.5，进行电泳检测时也观察不到DNA条带，说明所提取DNA样品浓度很低；(6-2)第一轮扩增结果第一轮扩增结果，仅阴性对照和阳性对照能够观察到扩增条带，其它泳道未看到扩增结果；阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为310bp、357bp和421bp；阴性对照结果表明实验过程中无假阳性结果，排除RR大豆转基因成分污染的可能；阳性对照结果说明扩增体系正常，可以扩增出目的基因；空白对照无扩增条带说明PCR反应体系无污染；(6-3)第二轮扩增结果第二轮扩增结果，阳性对照的Lectin，35S-CTP，EPSPS-NOS基因扩增片段大小分别为101bp、82bp和115bp；卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉扩增出三条特异性条带；大豆粗油仅扩增出Lectin基因；大豆精炼油和大豆色拉油未检出任何条带；(6-4)外引物扩增灵敏度分析第一轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.5％RR大豆标准品利用三对外引物能够同时扩增出三个目的基因，0.05％标准品只能扩增出Lectin和EPSPS-NOS基因，说明第一轮三重PCR的灵敏度为0.5％；(6-5)内引物扩增灵敏度分析第二轮三重PCR灵敏度分析实验中，0.005％RR大豆标准品利用三对内引物能够同时扩增出较为清晰的三个目的基因，0.0005％标准品只能扩增出Lectin和35S-CTP基因，说明第二轮三重PCR的灵敏度为0.005％。
全文摘要
本发明公开一种转基因大豆深加工产品三重巢式PCR检测方法。其检测方法为1.DNA提取；2.DNA样品浓度检测；3.引物设计；4.第一、二轮三重巢式PCR反应体系及反应条件；5.扩增产物检测；6.结果计算和灵敏度分析。本发明提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对豆油等转基因深加工食品进行DNA检测，具有实际意义。
文档编号C12Q1/68GK1772919SQ20051001051
公开日2006年5月17日 申请日期2005年11月11日 优先权日2005年11月11日
发明者高学军, 张明辉, 于艳波, 敖金霞, 曲波, 刘营 申请人:高学军, 张明辉, 于艳波, 敖金霞, 曲波, 刘营