大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6及其应用的制作方法

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本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因——GmPK6及其应用。

背景技术：

土壤盐渍化是一个全球性的生态问题，对农业生产带来了极大的负面影响，在干旱和半干旱地区土壤盐渍化已成为限制植物生长发育以及造成农作物减产的重要原因。现今，已有约7.6％的土壤发生了盐渍化，而中国盐碱地的面积为0.27亿hm2，约占我国耕地面积的10％。高盐环境会对作物造成多方面的分子损伤，如植物体水分缺失、高渗透压力、内稳态的破坏以及植物细胞内离子的失衡和毒害等。

大豆(Glycine max(L.)Merill)是一种传统的可食用豆科作物，也是公认的重要双子叶植物，种子为人类提供了丰富的蛋白、高质量的植物油、矿物质和维生素等资源。另外，大豆异黄酮、皂角苷、磷脂酰胆碱等也作为重要的功能化合物存在于大豆种子中。根据高盐胁迫下植物正常生长的比率对植物进行盐胁迫耐受性分级，分级结果显示栽培大豆是一种中度耐盐的农作物。

蛋白激酶(protein kinases)，又称为蛋白质磷酸化酶(protein phosphakinase)，负责催化体内蛋白质的磷酸化反应，与催化蛋白质脱磷酸化反应的蛋白质脱磷酸化酵素(protein phosphatases)的功能相反。蛋白激酶通过对底物蛋白质进行磷酸化而调控其活性，磷酸基团的供体是ATP或GTP的γ-磷酸，磷酸基团的受体是底物蛋白质的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上，不同激酶的受体不同，但大多发生在丝氨酸残基上，从而改变蛋白质、酶的构象和活性。在细胞信号传导和细胞周期调控途径中，蛋白激酶形成复杂有序的网络并且发挥着化学修饰的作用，并且涉及诸多过程的调控，例如：细胞生长，胞间互作和信号级联反应等。植物蛋白激酶与植物的抗逆性存在紧密联系，也会受到多种因素的调控，例如：发育阶段，脱水信号和脱落酸(ABA)。

根据已有的研究表明，蛋白激酶在植物逆境耐受如干旱胁迫、高盐胁迫等环境胁迫时会发挥较为重要的功能。但截止到目前为止，整个过程具体的分子保护机制还没有进行大量的实验证明，大多理论只限于推测之中，尤其是大豆中LAMMER家族蛋白激酶及其应用还未见报道。

技术实现要素：

针对目前的技术状况，本发明的目的是提供一种大豆(Glycine max(L.)Merr)圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因——GmPK6及其应用。

本发明所述的大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因，其特征在于：所述基因命名为大豆LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为表达载体pK2GW7::GmPK6，该表达载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。或者是，一种含有上述大豆圣豆9号中LAMMER型蛋白激酶基因的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为表达载体pB2GW7::GmPK6，该表达载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明所述的大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6在提高植株抗旱、耐盐性中的应用。

其中：所述植株优选是大豆或拟南芥。进一步的，所述拟南芥是Col-0野生型，大豆品种是潍6823。

本发明中，申请人从圣豆9号中分离得到LAMMER型蛋白激酶基因—GmPK6，将该基因转到模式植物拟南芥中证明其功能，结果得到了抗旱、耐盐性提高的转基因拟南芥植株。

具体的，大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6在拟南芥植株中表达GmPK6应用的例证。

申请人首先在圣豆9号植株中克隆到了LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6；利过Gateway系统将GmPK6基因通过BP反应连接到pDONR221载体上(见图1)，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmPK6连接到表达载体pK2GW7(见图2)或pB2GW7上，并在大肠杆菌DH5α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株GV3101中。将转化农杆菌菌株转入模式植物拟南芥，结果得到了抗旱、耐盐性提高的转基因拟南芥植株，验证表达了基因GmPK6的功能。

本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因并在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的干旱及高盐胁迫耐受性的能力。充分证明了本发明所述的大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6在提高植株在干旱及盐胁迫中具有重要的作用，预示本发明所述的基因可广泛用于培育抗旱、耐盐的植物品种。

附图说明

图1为入门载体pDONR221图谱。

图2为植物表达载体pK2GW7图谱。

图3为圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6的CDS全长克隆电泳图

其中：M为Marker，泳道1、2为基因的CDS全长克隆。

图4为35S::GmPK6转基因的拟南芥纯系筛选。

其中：左图为转GmPK6基因拟南芥T1代种子筛选，中间为转GmPK6基因拟南芥T2代种子筛选，右图为转GmPK6基因拟南芥T3代纯系种子筛选。

图5为圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6在转基因拟南芥中RT-PCR表达分析。

图6为35S::GmPK6转基因拟南芥植株耐盐表型分析

其中：A图为转基因植株在0,50,100,150 200mmol/L NaCl条件下的种子萌发率分析，B图为转基因植株在0,50,100,150 200mmol/L NaCl条件下的根长变化分析，C图为不同浓度NaCl处理条件下的种子萌发率统计数据，D图为不同浓度NaCl处理条件下的根长统计数据。

图7为35S::GmPK6转基因拟南芥植株抗旱表型分析

其中：A图为转基因植株在100,150，200，250mmol/L mannitol条件下的种子萌发率分析，B图为转基因植株在100,150，200，250mmol/L mannitol条件下的根长变化分析，C图为不同浓度mannitol处理条件下的种子萌发率统计数据，D图为不同浓度mannitol处理条件下的根长统计数据。

图8为圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6转潍6823的PCR检测图

其中：上图为35S-F/R引物进行PCR扩增的结果，下图为35S-F+GmPK6-R引物进行PCR扩增的结果。

泳道M为Marker，泳道阳性对照为阳性质粒对照；泳道阴性对照为阴性植株对照；上图中：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9均为转GmPK6转基因阳性植株。下图中：泳道1、4、6、8为转GmPK6转基因阳性植株。

图9为35S::GmPK6转基因拟南芥植株非生物胁迫处理1,3,6,12,24h下表达量变化，其中ABA处理浓度为100umol/L，NaCl处理浓度为200mmol/L，mannitol处理浓度为300mmol/L。

图10为35S::GmPK6转基因大豆株T1代再生植株。

图11为圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6转潍6823的Southern blot分析图，其中：泳道M为Marker，泳道“+”为阳性质粒对照；泳道“-”为阴性植株对照；泳道“L1、L2、L3”均为GmPK6转基因阳性植株。

图12为35S::GmPK6转基因大豆植株的耐盐性分析

其中：WT为阴性植株对照，L1、L2、L3为转基因阳性植株。

上图为0mM NaCl处理下的表型，下图为150mM NaCl处理下的表型。

具体实施方式

实施例1、GmPK6的克隆

1.1大豆圣豆9号总RNA的提取

(1)将圣豆9号植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于-80℃超低温冰箱保存备用)；

(2)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，8,000rpm，离心5min；

(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。

1.2RNA的反转录

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：

(2)轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向离心管中依次加入下列物质

(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。

1.3GmPK6基因克隆

GmPK6OX-F：5’-AAAAAGCAGGCTCGTACCACAATGGTTATTTCATGA-3’

GmPK6OX-R：5’-AGAAAGCTGGGTTGATGCAGAGAACTACGAAAACTT-3’

(1)高保真酶Primer Star进行Gateway系统的第一步扩增的反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)

1)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管并称凝胶重量，加入3倍体积的溶胶液，60℃溶胶10min，溶胶期间不断的翻转；

2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；

3)室温，12000rpm，离心30Sec，弃溶液；

4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

6)空柱，12000rpm，离心2min；

7)回收柱开盖晾干1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水或者EB缓冲液，放置2min；

8)12000rpm离心1min，所得溶液即为回收片段。

(3)高保真酶Primer Star进行Gateway系统的第二步扩增。

attb引物序列：

attb-F：5’-G GGG ACAAGT TTG TAC AAAAAA GCA GGC T-3’

attb-R：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3’

反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，见图3。

1.4克隆基因片段的BP反应

BP反应(Gateway系统)体系如下：

注：pDONR221购置于Invitrogen(上海)商贸有限公司。

25℃反应8小时-过夜。

1.5大肠杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取DH5α菌种接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；

(2)按1:100接种于50ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养1小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)将菌液放置在冰上30min；

(4)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入10ml预冷的0.1M的CaCl₂悬浮菌体；

(5)将菌液放置在冰上10min；

(6)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入2ml预冷的0.1M的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积30％甘油经液氮速冻后-80℃保存备用。

1.6大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将1-5μl质粒DNA或者连接产物加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)42℃，温水浴热激90sec，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml LB培养基，37℃培养40-50min；

(4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。

1.7大肠杆菌PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8DNA测序

挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Kan(25mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

经过序列分析，上述cDNA序列与大豆Willms82的核苷酸同源100％，三次实验证明得到的就是Willms82LAMMER型蛋白激酶基因，命名为GmPK6，所述基因GmPK6的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

1.9大肠杆菌质粒DNA的提取

(1)挑取单克隆接种于10ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养8h；

(2)室温，12,000rpm，离心1min，收集菌体；

(3)弃上清，加入100μl低温预冷的溶液I，振荡悬浮菌体；

(4)加200μl新鲜配制的溶液II，快迅翻转混匀，冰浴5min；

(5)溶液澄清后加入150μl低温预冷的溶液III，轻轻混匀后冰浴5min；

(6)4℃，12000rpm，离心10min，吸取上清至新的1.5ml离心管中；

(7)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，振荡混匀；

(8)室温，12,000rpm，离心10min，转移上层水相于另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，再抽提一次，振荡混匀；

(9)室温，12,000rpm，离心10min，转移上层水相于另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀并于-20℃放置30min；

(10)室温，12,000rpm，离心10min，弃上清保留沉淀。

(11)用75％乙醇洗涤沉淀两次，真空干燥5min，溶于40μl灭菌水，放至-20℃保存备用。

1.10克隆基因片段的LR反应

LR反应(Gateway系统)体系如下：

注：pK2GW7、pB2GW7购置于Invitrogen(上海)商贸有限公司。

25℃反应8小时。

1.11大肠杆菌感受态的制备和质粒转化(同1.5、1.6)

1.12大肠杆菌PCR验证(同1.7)

1.13大肠杆菌质粒DNA的提取(同1.9)

验证转入pK2GW7载体的阳性pK2GW7::GmPK6质粒的克隆区域核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

验证转入pB2GW7载体的阳性pB2GW7::GmPK6质粒的克隆区域核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

1.14农杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取农杆菌GV3101菌种接种于10ml YEP液体培养基中，28℃摇床培养过夜；

(2)按1：50接种于50ml YEP液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)4℃，4,200rpm，离心10min，收集菌体；

(4)弃上清，加入10ml预冷的0.15mol/L的NaCl悬浮菌体；

(5)重复步骤3；

(6)弃上清，加入2ml预冷的20mmol/L的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积7％DMSO经液氮速冻后-80℃保存备用。

1.15农杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将10μl质粒DNA加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)液氮速冻1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml YEP培养基，28℃培养2-4h；

(4)室温，4,000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的YEP培养平板上，28℃倒置培养48h。

1.16转化农杆菌的PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2、在拟南芥中表达大豆LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6的功能验证

2.1花侵染法转化拟南芥

(1)拟南芥(Col-0野生型)生长至抽苔1cm时，将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；

(2)在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌GV3101加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀约为1.0-1.2；

(3)室温，4,200rpm,离心10min，收集菌体，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重悬菌体，使OD₆₀₀约为0.8；

(4)用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染，待所有花序都被侵染后，将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

(5)用保鲜袋覆盖花序，至于20-22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。

2.2拟南芥种子的表面消毒

将适量待灭菌的拟南芥中子放入1.5ml离心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％体积比的TritonX-100)震荡消毒1min，再用70％的乙醇震荡消毒1min(两次)，最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入培养基中。

2.3转基因植株的筛选

对收获的T0代种子进行表面消毒，然后后均匀涂布于1/2MS平板上(含相应的抗生素Baste)。春化处理3d后移入人工气候室生长。萌发约10天，子叶深绿色的植株为转基因植株，而子叶发浅绿甚至黄化的植株为非转基因植株。将转基因植株转入土中生长直至收获得到T1代转基因种子，T1代植株单株收种子，每株收取的种子继续筛选，将后代分离比为3∶1(阳性∶阴性)的阳性植株移栽后生长至收获T2代转基因种子，单株收种后，每株收取的种子经筛选可以得到纯系T2代转基因种子为T3代，见图4。

2.4植物RNA的提取

(1)将植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于-80℃超低温冰箱保存备用)；

(2)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，8,000rpm，离心5min；

(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。

2.5RNA的反转录

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：

(2)轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向离心管中依次加入下列物质

(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。

2.6转基因植株的RealTime-PCR检测

PCR法筛选转基因阳性植株：将具有抗性的植株的cDNA用GmPK6基因RT-PCR引物进行PCR检测。

GmPK6基因RT-PCR引物序列：

GmPK6RT-F：5’-CCCCAAGGCTCAGGTAG-3’

GmPK6RT-R：5’-TTGCCTCCTTTATCGTGTT-3’

普通Taq酶进行RealTime-PCR扩增的反应如下(15μl体系)：

扩增条件如下：

注：内标基因选用GmTUB。

结果见图5。

2.7NaCl、mannitol、ABA处理下GmPK6在不同组织器官内的表达量分析

(1)将Col-0植株在200mmol/L NaCl处理0h,1h,3h,12h,24h后分别取其根提取RNA(方法同2.4)，将RNA分别反转为cDNA(方法同2.5)，进行RealTime-PCR检测(方法同2.6)。

(2)将Col-0植株在300mmol/L maninitol处理0h,1h,3h,12h,24h后分别取其根提取RNA(方法同2.4)，将RNA分别反转为cDNA(方法同2.5)，进行RealTime-PCR检测(方法同2.6)。

2.8甘露醇和NaCl处理拟南芥

(1)拟南芥种子的表面消毒(同2.2)。

(2)甘露醇和NaCl处理

将灭了菌的Col-0、GmPK6-1、GmPK6-2、GmPK6-3种子分别均匀涂布于1/2MS平板上(含相应的抗生素Baste)。春化处理3天后移入人工气候室生长。萌发约4d，根长至1cm左右，将拟南芥小苗移至添加不同浓度的甘露醇(0、100、150、200、250mmol/L)或NaCl(0、50、100、150、200mmol/L)的1/2MS培养基平板上。待小苗长至11d，观察小苗根长生长状况。

结果见图6、图7。

实施例3、在大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6的功能验证

3.1大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化法转化大豆

(1)种子消毒及预培养处理

将大豆种子用70％乙醇消毒5min，去净乙醇后用0.1％HgCl₂消毒10min，无菌水冲洗5-6遍，在25℃-28℃下无菌水浸种12h。

将浸种后胚膨大萌动的大豆放入预培养培养基，28℃、光培养1d，其中所述预培养培养基配方为：MS+3.0mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

(2)种子胚膨大萌动后经切割，暴露或损伤萌动胚部位

当预培养的大豆胚整体膨大、胚根长至0.5±0.1mm，未突破种皮时，剥去种皮，切去胚根，保留胚芽、胚轴及1/2的子叶，同时用解剖针在胚芽尖处刺针，使针眼布满胚芽尖。

(3)真空渗透辅助法将含有目的基因的农杆菌侵染萌动胚

将4℃保存的带有植物表达载体的农杆菌在添加了50mg/L利福平的YEP固体培养基上划线，28℃黑暗培养3天后挑取单菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液体培养基，黑暗下28℃、200r/min振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16h。将菌液置于灭菌的离心管中，5,000rpm离心5分钟收集菌体，用侵染液重悬菌体，调整至OD₆₀₀值为0.6，加入30mg/L乙酰丁香酮备用。其中所述侵染液配方为：0.1MS大量+0.1MS微量+B5维生素+0.5MES+1％葡萄糖+2％蔗糖，pH5.4。

将步骤(2)的大豆浸入农杆菌菌液中，抽真空并维持0.05MPa压力5-8min，黑暗下28℃、200r/min振荡培养，侵染15-20min。

(4)共培养

将步骤(3)的大豆取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下置于共培养培养基上，25℃-28℃下暗培养4天。其中所述共培养培养基配方为：MS+30mg/L乙酰丁香酮+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

(5)丛生芽再生、筛选及小苗生根、筛选

将共培养后的大豆用无菌水清洗4次，再用无菌滤纸吸干，转接至丛生芽诱导培养基上，在25℃、且每日光照14h条件下，每两周换至新的培养基，连续培养20±2d，分化出丛生芽。其中所述丛生芽诱导筛选培养基配方为：MS+3.0mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.2mg/LIAA(吲哚乙酸)+0.125μL/mL Baste+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

选筛选后长至1-2cm的丛生芽，将小芽单独剪下，转移到生根筛选培养基上，在25℃、且每日光照14±1h条件下，连续培养14d。其中所述生根筛选培养基配方为：MS+0.4mg/LIBA(乙哚丁酸)+0.125μL/mL Baste+200mg/L头孢噻肟钠+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

(6)小苗壮苗及移栽

选根系生长良好的小苗转移到壮苗培养基上，在25℃且每日光照14小时条件下，培养7-10d。当小苗经筛选存活、且根系生长良好后，将其不伤及根部取出，除去残存培养基移入土壤，用薄膜覆盖花盆以提高湿度。其中所述壮苗培养基配方为：MS+2.0mg/L KT(激动素)+0.4mg/L NAA(α-萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，见图8。

3.2CTAB法提取转基因植株基因组DNA

称取0.5g的再生植株叶片，剪碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl预热至65℃的2xCTAB提取缓冲液及0.1％的疏基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，然后置于65℃水浴保温2h，不时颠倒混匀。混合物冷却至室温后加入等体积的酚：氛仿：异戊醇(25：24∶1)，4℃下10,000g离心10min。将水相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，4℃下10000g离心10min。将水相转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10,000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100ul TE液溶解，37℃水浴30min。加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。4℃下10,000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40μl无菌水溶解DNA，4℃保存待用。

3.3PCR和Sothern blot检测转基因植株

3.3.1PCR法检测阳性转基因植株

抗性植株总DNA分别用35S启动子引物、GmPK6基因引物和连有GmPK6基因片段和植株表达载体片段的序列引物进行PCR检测。

35S片段启动子引物序列：

35S-F：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’

35S-R：5’-GACGATCTACCCGAGCAA-3’

GmPK6基因引物序列：

Gm PK6-F：5’-AAAAAGCAGGCTCGTACCACAATGGTTATTTCATGA-3’

Gm PK6-R：5’-AGAAAGCTGGGTTGATGCAGAGAACTACGAAAACTT-3’

35S启动子F+GmPK6基因R引物序列：

35S-F：5’-GCAGAGGCATCTTCAACG-3’

GmPK6-R：5’-AGAAAGCTGGGTTGATGCAGAGAACTACGAAAACTT-3’

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，见图8。

3.3.2Sothern blot杂交验证

选取3株阳性植株(GmPK6-L1、GmPK6-L2、GmPK6-L3)进行Sothern blot杂交验证。步骤如下：

(1)CTAB法提取阳性植株，野生型植株DNA

(2)EcoRI酶切阳性植株和野生型植株DNA，电泳

(3)转膜

①碱变性：室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。变性液：0.5mol/L NaOH；1.5mol/L NaCl。

②中和：将凝胶转移到中和液15min。中和液：1mol/L Tris-HCl(pH 7.4)；1.5mol/L NaCl；

③转移：按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。进行转移。(转移过程一般需要8-24h，每隔数小时换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物)转移液(20×SSC)：NaCl 175.3g；柠檬酸三钠82.2g，NaOH调pH至7.0，加ddH2O至1,000ml。

④转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数分钟，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80℃烘2h，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。

(4)按照Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II说明书标记GmPK61，并进行杂交及检测。

检测发现所选的GmPK6转基因植株(GmPK6-L1、GmPK6-L2、GmPK6-L3)的基因组均整合了目的基因，见图11。

3.4转基因大豆植株的耐盐性分析

T2代转基因大豆种子与对照种子经浸种催芽后，分别移栽到种子萌发袋(1/2Hogland液体培养基)中，在室温25℃条件下，使其生长2周后，长至两叶一心期用含有NaCl 50rnmol/L的1/2Hogland液体培养基浇灌，为避免盐冲击效应，浓度以每天递增25rnrnol/L的方式加盐，直至处理预定浓度150rnmol/L，对转基因植株与野生型植株表型进行观察。见图12。1/2Hogland液体培养基配方：

序列表

<110> 山东大学

<120>大豆圣豆9号LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6及其应用

<141> 2016-11-22

<160> 3

<210> 1

<211> 1419

<212> cDNA

<213> 大豆(Glycine max?(L.) Merr)

<221>大豆圣豆9号中LAMMER型蛋白激酶基因GmPK6

<222>（1）…（1419）

<400>1

atggagatgg aacgcgtctt cgagtttcct cacactcaca tggatcggcg cccgagaaag 60

agagcgagat tgggctggga catccctgag gtccccaagg ctcaggtagg attgttttgt 120

ggacaagatg ttgggactat ttcaagcttt gctccttcaa ggggtccctc agaaaatacc 180

actagttctc tatttgttaa gccagttgct cgaaatggtt ctcccccttg gcgagatgat 240

gacaaagatg ggcattacat gtttgcgctt ggagaaaatt taacttctcg ctataagata 300

catagcaaaa tgggtgaagg aacttttggg caggtcttag aatgctggga tagagaaagg 360

aaggaaatgg ttgccgtaaa aattgtccgt ggtattaaga agtatcgaga agcagccatg 420

atagaaattg aggtgttgca acagcttggt aaacacgata aaggaggcaa tcgttgtgtg 480

caaatacgga actggtttga ctatcgtaat catatctgta ttgtgtttga gaaacttgga 540

ccaagcttat acgattttct tcggaaaaac aattatcgct catttcccat tgatcttgtc 600

cgtgagattg gcagacaact attggaatgt atagcattca tgcatgactt gcgcatgatt 660

catactgacc tgaagcctga aaacatacta ctagtttcac cagagtatgt caaagttcct 720

gactacaaga gttcatctag atcaccaagt tcctatttca agagagttcc caaatcaagt 780

gctataaagg ttattgattt tggcagcacc acttatgagc gagaagatca gaattacatt 840

gtatcaactc gtcattatag ggctcctgaa gttatccttg gtatatatac atactgtaaa 900

tgctgtggaa agaatgcctg tctaactgtg ttttgcatgt tgacacatga caatcatgag 960

aagggctata tgcaagctaa agttgatttt ggcaatgatg ttttaggact tggctggagc 1020

tatccatgtg atatctggag tgtgggatgt atcttggttg agttatgcac gggcggagct 1080

ttgtttcaga ctcacgaaaa tttggagcat cttgccatga tggaaagggt acttggtcca 1140

ttaccacagc ccatgttgaa gagagtcgac cgacatgctg agaagtatgt tagaaggggt 1200

agattggact ggcctgaggg tgcaacctca agggagagta tcaaagctgt aatgaagctt 1260

cctaggcttc agaaccttgt aatgcagcat gtagatcatt cagctggcga tctcatacat 1320

ctcttgcagg ggttacttag atatgacccc tctgaaagac ttacagccaa ggaagctctt 1380

agacattcct tctttatgag agatcaattt agaagataa 1419

<210> 2

<211> 10907

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 含有基因GmPK6的植物表达载体pK2GW7:: GmPK6

<222>（1）…（10907）

<400>2

ctcccatatg gtcgactaga gccaagctga tctcctttgc cccggagatc accatggacg 60

actttctcta tctctacgat ctaggaagaa agttcgacgg agaaggtgac gataccatgt 120

tcaccaccga taatgagaag attagcctct tcaatttcag aaagaatgct gacccacaga 180

tggttagaga ggcctacgcg gcaggtctca tcaagacgat ctacccgagt aataatctcc 240

aggagatcaa ataccttccc aagaaggtta aagatgcagt caaaagattc aggactaact 300

gcatcaagaa cacagagaaa gatatatttc tcaagatcag aagtactatt ccagtatgga 360

cgattcaagg cttgcttcat aaaccaaggc aagtaataga gattggagtc tctaagaaag 420

tagttcctac tgaatcaaag gccatggagt caaaaattca gatcgaggat ctaacagaac 480

tcgccgtgaa gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga 540

aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata 600

cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc 660

tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag 720

gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg 780

ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 840

ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 900

acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 960

tggagaggac tccggtattt ttacaacaat accacaacaa aacaaacaac aaacaacatt 1020

acaatttact attctagtcg acctgcaggc ggccgcacta gtgatatcgg ggacaagttt 1080

gtacaaaaaa gcaggctatg gagatggaac gcgtcttcga gtttcctcac actcacatgg 1140

atcggcgccc gagaaagaga gcgagattgg gctgggacat ccctgaggtc cccaaggctc 1200

aggtaggatt gttttgtgga caagatgttg ggactatttc aagctttgct ccttcaaggg 1260

gtccctcaga aaataccact agttctctat ttgttaagcc agttgctcga aatggttctc 1320

ccccttggcg agatgatgac aaagatgggc attacatgtt tgcgcttgga gaaaatttaa 1380

cttctcgcta taagatacat agcaaaatgg gtgaaggaac ttttgggcag gtcttagaat 1440

gctgggatag agaaaggaag gaaatggttg ccgtaaaaat tgtccgtggt attaagaagt 1500

atcgagaagc agccatgata gaaattgagg tgttgcaaca gcttggtaaa cacgataaag 1560

gaggcaatcg ttgtgtgcaa atacggaact ggtttgacta tcgtaatcat atctgtattg 1620

tgtttgagaa acttggacca agcttatacg attttcttcg gaaaaacaat tatcgctcat 1680

ttcccattga tcttgtccgt gagattggca gacaactatt ggaatgtata gcattcatgc 1740

atgacttgcg catgattcat actgacctga agcctgaaaa catactacta gtttcaccag 1800

agtatgtcaa agttcctgac tacaagagtt catctagatc accaagttcc tatttcaaga 1860

gagttcccaa atcaagtgct ataaaggtta ttgattttgg cagcaccact tatgagcgag 1920

aagatcagaa ttacattgta tcaactcgtc attatagggc tcctgaagtt atccttggta 1980

tatatacata ctgtaaatgc tgtggaaaga atgcctgtct aactgtgttt tgcatgttga 2040

cacatgacaa tcatgagaag ggctatatgc aagctaaagt tgattttggc aatgatgttt 2100

taggacttgg ctggagctat ccatgtgata tctggagtgt gggatgtatc ttggttgagt 2160

tatgcacggg cggagctttg tttcagactc acgaaaattt ggagcatctt gccatgatgg 2220

aaagggtact tggtccatta ccacagccca tgttgaagag agtcgaccga catgctgaga 2280

agtatgttag aaggggtaga ttggactggc ctgagggtgc aacctcaagg gagagtatca 2340

aagctgtaat gaagcttcct aggcttcaga accttgtaat gcagcatgta gatcattcag 2400

ctggcgatct catacatctc ttgcaggggt tacttagata tgacccctct gaaagactta 2460

cagccaagga agctcttaga cattccttct ttatgagaga tcaatttaga agataagggg 2520

accactttgt acaagaaagc tgggtgatat cccgcggcca tgctagagtc cgcaaaaatc 2580

accagtctct ctctacaaat ctatctctct ctatttttct ccagaataat gtgtgagtag 2640

ttcccagata agggaattag ggttcttata gggtttcgct catgtgttga gcatataaga 2700

aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt ctaattccta 2760

aaaccaaaat ccagtgacct gcaggcatgc gacgtcgggc ccaagcttag cttgagcttg 2820

gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg 2880

cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa 2940

aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc 3000

aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc 3060

agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca agtcctaagt tacgcgacag gctgccgccc 3120

tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg 3180

actagaaccg gagacattac gccatgaaca agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg 3240

cccgcgtcag caccgacgac caggacttga ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg 3300

gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg 3360

ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc 3420

tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg 3480

gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt 3540

tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga 3600

gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg tgaagtttgg cccccgccct accctcaccc 3660

cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg 3720

cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga ccctgtaccg cgcacttgag cgcagcgagg 3780

aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg tgaggacgca ttgaccgagg 3840

ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga acaagcatga aaccgcacca 3900

ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc 3960

cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc 4020

cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga 4080

gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc 4140

tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc 4200

gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc 4260

gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc 4320

cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg 4380

acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg 4440

ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg 4500

gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc tggtggagct ggttaagcag 4560

cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa 4620

ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt 4680

gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt 4740

cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt 4800

aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc 4860

taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag 4920

acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc ggaggatcac accaagctga 4980

agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc 5040

agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat gaattttagc ggctaaagga 5100

ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga 5160

ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgtct gccggccctg caatggcact 5220

ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat 5280

cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg 5340

gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat 5400

ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa 5460

gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag 5520

tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga 5580

ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat 5640

ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat 5700

gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc 5760

ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga 5820

aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa 5880

cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa 5940

gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga 6000

gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac cccgattact ttttgatcga 6060

tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc 6120

cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt 6180

ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga 6240

ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga 6300

agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg caaattgccc tagcagggga 6360

aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac attgggaacc caaagccgta 6420

cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggtcaca 6480

catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa 6540

acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc 6600

cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc 6660

gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct 6720

accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc cggcgcccac atcaaggcac 6780

cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 6840

cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 6900

cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt 6960

atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg 7020

tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc 7080

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 7140

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 7200

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 7260

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 7320

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 7380

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 7440

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 7500

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 7560

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 7620

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 7680

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 7740

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 7800

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 7860

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgcatgatat 7920

atctcccaat ttgtgtaggg cttattatgc acgcttaaaa ataataaaag cagacttgac 7980

ctgatagttt ggctgtgagc aattatgtgc ttagtgcatc taatcgcttg agttaacgcc 8040

ggcgaagcgg cgtcggcttg aacgaatttc tagctagaca ttatttgccg actaccttgg 8100

tgatctcgcc tttcacgtag tggacaaatt cttccaactg atctgcgcgc gaggccaagc 8160

gatcttcttc ttgtccaaga taagcctgtc tagcttcaag tatgacgggc tgatactggg 8220

ccggcaggcg ctccattgcc cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt ttgccggtta 8280

ctgcgctgta ccaaatgcgg gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg ccagcccagt 8340

cgggcggcga gttccatagc gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga tcctgttcag 8400

gaaccggatc aaagagttcc tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta tgttctcttg 8460

cttttgtcag caagatagcc agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag atacctgcaa 8520

gaatgtcatt gcgctgccat tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga taacgccacg 8580

gaatgatgtc gtcgtgcaca acaatggtga cttctacagc gcggagaatc tcgctctctc 8640

caggggaagc cgaagtttcc aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt gtttcatcaa 8700

gccttacggt caccgtaacc agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg ccgccatcca 8760

ctgcggagcc gtacaaatgt acggccagca acgtcggttc gagatggcgc tcgatgacgc 8820

caactacctc tgatagttga gtcgatactt cggcgatcac cgcttccccc atgatgttta 8880

actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt gctgctccat aacatcaaac 8940

atcgacccac ggcgtaacgc gcttgctgct tggatgcccg aggcatagac tgtaccccaa 9000

aaaaacatgt cataacaaga agccatgaaa accgccactg cgccgttacc accgctgcgt 9060

tcggtcaagg ttctggacca gttgcgtgac ggcagttacg ctacttgcat tacagcttac 9120

gaaccgaacg aggcttatgt ccactgggtt cgtgcccgaa ttgatcacag gcagcaacgc 9180

tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg 9240

cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac 9300

aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt 9360

tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt 9420

aaacaaattg acgcttagac aacttaataa cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat 9480

taacgccgaa ttgaattatc agcttgcatg ccggtcgatc tagtaacata gatgacaccg 9540

cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt 9600

ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa taacgtcatg cattacatgt 9660

taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg 9720

caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt tgaacgatct gcttgactct 9780

agctagagtc cgaaccccag agtcccgctc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg 9840

cgatgcgctg cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt 9900

cgccgccaag ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg 9960

ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat 10020

tcggcaagca ggcatcgccg tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atccgcgcct 10080

tgagcctggc gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct 10140

gatcgacaag accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt 10200

ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga 10260

tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc 10320

ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa 10380

cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ttggagttca ttcagggcac 10440

cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg 10500

cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc 10560

aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat catgcctcga tcgagttgag 10620

agtgaatatg agactctaat tggataccga ggggaattta tggaacgtca gtggagcatt 10680

tttgacaaga aatatttgct agctgatagt gaccttaggc gacttttgaa cgcgcaataa 10740

tggtttctga cgtatgtgct tagctcatta aactccagaa acccgcggct gagtggctcc 10800

ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc ttgtcccgcg tcatcggcgg 10860

gggtcataac gtgactccct taattctcat gtatgataat tcgagct 10907

<210> 3

<211> 10654

<212> DNA

<213> 人工序列

<221>含有基因GmPK6的植物表达载体pB2GW7:: GmPK6

<222>（1）…（10654）

<400>3