与大豆抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术工程和农作物抗病遗传育种领域，具体地说，涉及一种 与大見抗疫病基因RpsZS18共分尚的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 由大豆疫霉（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)引起的大豆疫病是大豆 生产中的一种毁灭性病害。该病已在我国黑龙江省、安徽、福建、吉林、新疆等省份发生。大 豆疫霉在大豆所有生育期均可以侵染大豆，引起根腐、茎腐、植株矮化、枯萎和死亡，一般田 块减产10-30%，严重地块可达60-90%，甚至造成绝产。目前全世界每年因大豆疫霉病造 成的经济损失大约为10亿美元（Tyler，2007)。
[0003] 防治大豆疫病最为经济、有效且环境安全的方法是种植抗病品种。目前，国外 已经在大豆基因组上的8个基因座上鉴定了 17个抗性基因。分别为RpsUBernardet al. , 1957) >Rps2(Kilenetal. , 1974) >Rps3(Muelleretal. , 1978) >Rps4(Athowet al.，1980)、Rps5(Buzzell和Anderson.，1981)、Rps6(Athow和Laviolette.，1982)、 Rps7(Anderson和Buzzell.，1992)、Rps8(Gordonetal.，2006;Sandhuetal.，2005)、 大豆品种Waseshiroge的Rpsgene(Sugimotoetal.，2011)、RpsUNl和RpsUN2(Lin etal.，2013)。在Rpsl位点上共有 5 个等位基因（Rpsla，lb，lc，ld，lk)(Bernardet al·，1957;Buzzell和Anderson, 1992;Muelleretal·，1978)，在Rps3 位点上共有 3 个 等位基因（Rps3a, 3b和 3c)(Muelleretal·，1978;Ploperetal·，1985)。Rpsl、Rps7、 Waseshiroge的Rpsgene和RpsUNl被定位在3号染色体上；Rps2和RpsUN2被定位在第16 号染色体上。Rps3和Rps8被定位在第13号染色体上；Rps4、Rps5和Rps6被定位在第18 号染色体上。
[0004] 迄今，我国已经鉴定了 9个大豆抗疫病基因，即RpsYB30、RpsYD25、RpsZS18、 RpsSN10、Rps9、RpsSu、RpsYD29、Rpsl0 和RpsJS。抗病基因RpsYB30 被定位在了大豆第 19 号染色体（朱振东，2007)。RpsYD25被定位大豆第3号染色体（范爱颖等，2009) ;RpsZS18 被定位在了大豆第2号染色体上（姚海燕，2010) ;RpsSN10被定位于大豆第13号染色体上 (于安亮，2010) ;Rps9被定位在大豆第3号染色体上（Wuetal.，2011)。RpsSu被定位在 了大豆第10号染色体上（武晓玲等，2011)。RpsYD29被定位在第3号染色体（Zhanget al·，2013a)。RpslO被定位在大豆第17号染色体上（Zhangetal·，2013b)。最新发现的 RpsJS定位在18号染色体上（Sunetal·，2013)。
[0005] 大豆疫霉群体结构复杂，容易产生新的毒力型。一般认为大豆抗疫病基因的使用 寿命为10-15年，但是新的抗病基因被淘汰的速度正在加快。因此有必要大力挖掘和利用 新的抗性资源并不断地进行抗病基因的累加，培育抗性持久的大豆品种。
[0006] 随着分子标记开发技术不断发展，不同类型的分子标记不断被应用到基因的发掘 和作图中，实现更精细的定位。SSR标记由于其数量大，多态性高，操作简单等特点，为目前 应用范围最为广泛的一种分子标记。但随着测序技术的发展，SNP和Indel等多态性更强 的分子标记被开发并且应用到基因的定位中。大豆全基因组测序的完成为大豆基因的精细 定位、克隆以及功能标记的开发提供了便利。通过大豆基因组的序列信息，设计和利用SSR 和SNP标记，已经广泛应用到大豆基因的定位、功能标记的开发。
[0007] 大豆品种早熟18是中国科学院遗传研究所1982年用7902(克拉克63X诱变30) 为母本，7821 (耐阴黑豆X诱变31)为父本进行复合杂交选育而成；早熟18号高抗花叶病 毒病、灰斑病和紫斑病。抗倒伏，抗裂荚。朱振东等（2006)发现早熟18对大見疫霉具有广 谱抗性。姚海燕等（2010)在早熟18中鉴定一个抗疫病基因RpsZS18,并将该基因定位在大 豆2号染色体（LGDlb)SSR标记Sat_069和Sat_183之间。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一个与大豆抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记及其应 用。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明的一个与大豆抗疫病基因RpsZSIS共分离的分子 标记ZCindel246000,所述分子标记位于大豆2号染色体的SSR标记ZCSSR33(0. 7cM)和 ZCSSR46(2. 8cM)之间，用于特异性PCR扩增分子标记ZCindel246000的引物对为：
[0010] 上游引物F: 5 ' -CAGATAGAGTTTTCCTACACAGG-3 ' 和
[0011] 下游引物R: 5 ' -AGTAGAAGCAAAGAGGGACT-3 '。
[0012] 分子标记ZCindel266000与基因RpsZS18的遗传距离为OcM。
[0013] PCR扩增使用的退火温度为58. 4°C，扩增产物大小为279bp(序列1)。
[0014] 本发明还提供所述分子标记ZCindel266000在鉴定抗疫病大豆品种中的应用，包 括以下步骤：
[0015] 1)提取待测大?的基因组DNA;
[0016] 2)以待测大豆的基因组DNA为模板，利用上述引物F和R，进行PCR扩增反应；
[0017] 3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出279bp的产物，则判定待测大豆为抗疫病品 种。
[0018] 其中,PCR扩增反应使用的扩增体系以10μ1计为：大豆基因组DNA模板浓度2ng/ μ1，2XPCRMasterMix(Tiangen)4y1，引物F和R各 0.2ymol/L，用ddH20 补足至 10μ1。
[0019] PCR扩增反应使用的反应条件为：95°C3分钟；94°C45秒，58. 4°C45秒，72°C45 秒，共35个循环；72°C10分钟。
[0020] 本发明还提供用于PCR检测抗疫病大豆的试剂盒，所述试剂盒中含有上述用于特 异性PCR扩增分子标记ZCindel246000的引物对。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的一种或多种。
[0021] 本发明进一步提供所述分子标记ZCindel266000在大見抗疫病分子育种中的应 用。
[0022] 具体地，本发明的与大豆抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记通过如下方法获 得：
[0023] 利用Wi11iams和早熟18杂交组合衍生的F3为作图群体，根据抗疫病基因 RpsZSIS的初定位结果，在该定位区间内设计开发新的SSR标记以及利用定位区间内已经 公布的SSR标记，筛选在亲本和抗、感池上都具有多态性的分子标记，将具有多态性的SSR 标记进行群体验证构建新的连锁图谱，实现精细定位。在新的定位区间内预测候选基因，对 早熟18和Williams的候选基因位点进行测序，开发Indel标记，并进行群体验证，获得与 基因RpsZS18共分离的标记。从而为大豆抗疫病育种提供辅助选择，提高育种效率，加速抗 疫病育种工作进程。 具体实施方案：
[0024] (1)早熟18的抗性遗传分析
[0025] 以抗病品种早熟18为父本，感病品种Williams(rps)作为母本，杂交产生Fi代，Fi 代自交产生F2代，F2代自交产生的75个F3家系的抗性遗传分析、抗病基因鉴定及作图群 体。采用下胚轴创伤接种方法，每个家系鉴定20-25个植株对大豆疫霉菌株PsUSAR2的反 应进行抗性遗传分析。接种后在24°C，湿度为100%的条件下，保湿48小时，然后传入温室 培养，4天后进行病情调查。参照Gordon等（2006)方法评价标准，调查F3家系的抗病、分