离、感病家系的分离比，研究早熟18对大豆疫病的抗性遗传规律。
[0026] (2)基因DNA的提取和抗、感池的构建
[0027] 采用CTAB法提取2个亲本及75个F3家系的基因组DNA。每个F3家系分别取20 个单株叶片样品，等量混合提取DNA。按照Michelmore等（1991)方法取10个抗病、感病家 系构建用于分离群体分组分析（BulkSegregationAnalysis,BSA)的抗病、感病池。
[0028] (3)利用SSR标记定位早熟18的抗病基因
[0029] 根据姚海燕（2010)定位结果，在http://soybase.org下载SSR标记Sat_069和 Sat_183之间的基因序列。根据基因序列设计开发SSR标记以及利用该区间内已经公布的 SSR标记，在早熟18和Wi11iams之间，抗病、感病池之间进行PCR扩增和多态性筛选。将在 亲本和抗病、感病池之间具有多态性的SSR标记进行群体验证。对F3群体抗性分离及SSR 标记在F3家系中的分离模式进行X2检验。用mapmaker3. 0软件分析SSR标记与抗病基因 的连锁关系。使用MapDraw软件构建遗传连锁图谱，获得新的定位区间。PCR反应体系为 1〇μ1，含有 2XTaqPCRMasterMix(Tiangen)4y1，上、下游引物各 0· 2ymol/L，模板DNA 浓度为2ng/μ1，用ddH20补足至10μ1。
[0030] PCR反应扩增程序：95 °C预变性3分钟；94°C变性45秒，55 °C退火45秒，72 °C延伸 45秒，共35个循环；72°C10分钟，10°C保存。扩增产物在8-12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电 泳和分析。
[0031] (4)候选基因的预测和共分离标记的发现
[0032] 在http://soybase.org中查找新的定位区间中注释基因的信息，发现基因 Glyma. 02g246000为具有典型抗病基因结构的Ser/Thr蛋白激酶类型。将早熟18和 Williams中基因Glyma. 02g246000对应的位点进行测序。对比基因Glyma. 02g246000位点 在抗、感亲本中的测序结果，通过差异位点开发Indel标记ZCindel246000。将Indel标记 进行群体验证，发现其为共分离标记。Glyma. 02g246000很可能为控制早熟18抗性的候选 基因模型。
[0033] 大豆疫病是大豆生产过程中的一种毁灭性病害。本发明利用SSR和Indel分子标 记方法，对大豆抗疫病基因RpsZSIS进行精细定位，并发现其共分离和紧密连锁的分子标 记。该抗病基因对大豆疫霉具有广谱抗性，可有效控制我国大豆疫病的发生，减轻该病害造 成的产量损失。利用与该基因共分尚的Indel分子标记ZCIndel246000,可有效应用到分子 标记辅助育种中，克服常规育种方法所需周期长的缺点；基于PCR技术，在室内对大豆资源 进行抗性分析；同时为克隆该基因奠定基础，这对进一步了解该基因的分子遗传学机理具 有重要意义，在大豆生产实践、育种工作和抗病理论研究中具有重要的价值。
[0034] 本发明的优点在于：
[0035] ( -）本发明首次对2号染色体上发现的大豆抗疫病基因RpsZSIS进行了精细定 位。该基因对我国大豆疫霉具有广谱抗性，可有效控制我国大豆疫病的发生，减轻该病害造 成的产量损失。
[0036] (二）本发明提供的与抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记ZCindel246000,是 在早熟18及其抗性稳定的杂交后代家系中获得的分子标记。可用于抗大豆疫病资源鉴定 和抗大見疫病后代的分子标记辅助育种。
[0037] (三）本发明提供的与抗疫病基因RpsZS18共分离的分子标记ZCindel246000,为 该基因的克隆和测序奠定基础，从而明确该序列信息的结构特征。另外，根据共分离的分子 标记和大豆基因组序列信息，进行该基因的单倍型分析，有望克隆获得新的抗病基因。
【附图说明】
[0038] 图1为本发明实施例1中早熟18(左3)和Williams(右3)接种大豆疫霉菌株 PsUSAR2后4天病情调查结果。
[0039] 图2为本发明实施例1中大豆抗疫病基因RpsZS18遗传连锁图谱。
【具体实施方式】
[0040] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0041] 实施例1大豆抗疫病基因RpsZSIS的候选基因及其共分离的分子标记 ZCindel246000 的获得
[0042] 1、早熟18的抗性遗传分析
[0043] 以抗病品种早熟18为父本，感病品种Williams(rps)作为母本，杂交产生Fi代， Fi代自交产生F2代，F2代自交产生的75个F3家系的抗性遗传分析、抗病基因鉴定及作图 群体。采用下胚轴创伤接种方法，将每个家系鉴定20-25个植株对大豆疫霉菌株PsUSAR2 的反应进行抗性遗传分析。接种后在24°C，湿度为100 %的条件下，保湿48小时，然后传 入温室培养，4天后进行病情调查（图1)。参照Gordon等（2006)方法评价标准，规定植株 死亡率小于20 %的家系为纯和抗病家系，死亡率大于80 %的为纯和感病家系，而死亡率为 21-79%的家系为抗性分离家系，调查F3家系的抗、分离、感病家系的分离比，研究早熟18 对大豆疫病的抗性遗传规律。
[0044] 75个Williams与早熟18杂交组合衍生的F3家系对菌株PsUSAR2的抗性鉴定结 果表明，纯和抗病家系为18个，纯和感病家系为14个，杂合型家系为43个。经X2检验符 合期望的1:2:1的分离比例。
[0045] 2、大豆基因组DNA的提取和抗感池构建
[0046] 采用CTAB法提取2个亲本及75个F3家系的基因组DNA。每个F3家系分别取20 个单株叶片样品，等量混合放入2. 0ml的离心管中。至于液氮中研磨成粉末，向离心管中加 入800μ1 65°C预热的CTAB提取缓冲液，混匀后于65°C水浴中保存30-50分钟；取出离心 管，冷却至室温，加入800μ1酚：氯仿：异戊醇（体积比25:24:1)，提取10分钟，轻轻摇荡， 使其充分混匀，12000rpm离心10分钟；取上清液到另一 1. 5ml离心管中，加入等体积的氯 仿：异戊醇（体积比24:1)，充分混匀10分钟后，12000离心10分钟；取上清液到另一 1. 5ml 离心管中，加入0. 8倍体积预冷的异丙醇，缓慢混匀，与-20°C下放置30-60分钟，使DNA以 沉淀析出；挑出DNA沉淀转移至1. 5ml离心管中，用75%酒精洗涤2次，最后用无水乙醇脱 7K，吹干，家如适量灭菌的超纯水。DNA溶解后，用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性 和紫外分光光度法检测DNA样品的浓度。
[0047] 按照Michelmore等（1991)等方法构建用于分离群体分组分析（Bulk SegregatingAnalysis,BSA)的抗、感池。各取1μ1的10个抗病家系的DNA混合于一个新 的离心管中，构建成抗池。感池构建方法参照抗池构建方法。
[0048] 3、利用SSR标记定位早熟18的抗病基因
[0049] 根据姚海燕（2009)定位结果，从http://soybase.org下载SSR标记Sat_069和 Sat_183之间的基因序列。根据基因序列设计开发176对SSR标记以及利用该区间内已经 公布的23对SSR标记，在早熟18和Williams之间，抗、感池之间进行PCR扩增和多态性筛 选。将在亲本和抗、感池之间具有多态性的SSR标记进行群体验证。对？3群体抗性分离及 SSR标记在F3家系中的分离模式进行X2检验。用mapmaker3. 0软件分析SSR标记与抗病 基因的连锁关系。使用MapDraw软件构建遗传连锁图谱，获得新的定位区间。PCR反应体系 为1〇μ1，含有2XTaqPCRMasterMix4μ1，上、下游引物各0.2ymol/L，模板DNA浓度为 2ng/y1，用ddH20 补足 10μ1。
[0050] PCR反应扩增程序：95 °C预变性3分钟；94°C变性45秒，55 °C退火45秒，72 °C延伸 45秒，共35