一种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法及其在育种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗病育种技术领域，具体涉及一种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法及 其在大豆育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 由大豆疫霉（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)引起的大豆疫病是大豆 生产中的一种毁灭性土传病害。该病已在我国多个省份都有发生。大豆疫霉在大豆所有生 育期均可以侵染大豆，引起根腐、茎腐、植株矮化、枯萎和死亡，一般田块减产10% -30%， 严重地块可达60% -90%，甚至造成绝产。目前全世界每年因大豆疫病造成的经济损失大 约为10亿美元（Tyler，2007)。
[0003]目前，研究人员一般通过下胚轴创伤接种法鉴定大豆对大豆疫病的抗性。采用下 胚轴接种法，只能在幼苗期进行，且接种后感病材料死亡，导致后续实验无法开展。这一缺 点在杂合大豆抗疫病植株F2群体的鉴定中尤为明显，会造成群体的损失，并无法进行重复 鉴定。鉴于此，有必要发展研究新的方法以鉴定大豆对大豆疫病的抗性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了提高大豆对大豆疫病抗性的鉴定效率，及避免传统鉴定方法 会造成杂合抗病植株F2群体损失的缺陷，而提供一种新的鉴定大豆对大豆疫病抗性的方 法及其在大豆育种中的应用。本发明的鉴定方法操作简便，成本低廉，节约时间，且可以进 行重复实验，同时不会损失待鉴定的实验材料，避免传统方法会造成实验材料群体性丢失 的弊端。
[0005] 本发明提供的技术方案之一是：一种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法，其包括如 下步骤：
[0006] (1)接种体的制备：将大豆疫霉（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)菌 株接种于CA培养基、V8培养基或利马豆培养基，暗培养使菌株复壮，之后将富含菌体的培 养基处理碎，即得接种体；
[0007] ⑵接种大豆植株材料：将步骤⑴所得的接种体盛装于检测容器中，选取待检大 豆植株刚刚平展的绿色带柄叶片，将叶柄插入所述检测容器中的接种体中；
[0008] (3)暗培养：将步骤⑵中接种了大豆材料的检测容器置于湿润的密闭空间中 暗培养后判断结果，所述密闭空间的温度为22~27°C，所述密闭空间的相对湿度为90~ 100%;所述判断结果的判断标准为，当培养3~5天后，若叶片和叶柄保持绿色或叶柄上病 斑的长度小于等于1. 5cm，则待检大豆植株为抗病植株，若叶柄上病斑的长度大于1. 5cm， 则待检大S?植株为感病植株。
[0009] 本发明中，步骤（1)为接种体的制备。
[0010] 其中，所述大豆疫霉菌株为本领域常规所述的大豆疫霉菌株，包括各种不同毒力 基因型的菌株，如PsMCl、Ps41-l和PsUSAR2等。
[0011] 所述的CA培养基为本领域常规所述，其具体配方为：以1L体积计，其中包括200g 胡萝卜和20g琼脂。
[0012] 所述的V8培养基为本领域常规所述，其具体配方为：以1L体积计，其中含有果汁 200g，CaC033g，琼脂20g，其余为蒸馏水，pH5. 8。
[0013] 所述的利马豆培养基为本领域常规所述，其配制方法为：以1L体积计，取利马豆 粉60g，加水1000ml，在60°C水浴lh，双层纱布过滤去渣，上清液补足至1000ml，加入琼脂 20g，煮沸后持续沸腾数分钟，冷却即得。
[0014] 在将大豆疫霉菌株接种于CA培养基之前，较佳地还包括对所述大豆疫霉菌株进 行分离和纯化的步骤（S):将大豆疫霉菌株在CA培养基上暗培养7~10d，培养温度为22~ 27°C(优选25°C)，之后接种感病大豆品种的幼苗恢复毒力，在植株发病后进行病原菌的分 离和纯化，将得到的大豆疫霉菌株用于后续接种。
[0015] 步骤（1)中所述暗培养的温度较佳地为22~27°C(优选25°C);所述暗培养的 时间较佳地为7~10天。
[0016] 步骤（1)中所述的将富含菌体的培养基处理碎指采用本领域任何常规可行的方 法将富含大豆疫霉菌菌体的CA培养基处理碎（最好至均匀）即可，如可以搅拌至细碎均 匀，也可以捣碎。较佳地，所述处理为使用豆浆机将富含菌体的培养基处理碎。
[0017] 本发明中，步骤（2)为接种大豆植株材料。
[0018] 其中，所述的检测容器可以是本领域任何常规的容器，如EP管、小试管、离心管等 均可，优选2~5mL的离心管。
[0019] 所述的待检大豆植株刚刚平展的绿色带柄叶片可以是植株合适部位的任意叶片， 只要其健康、幼嫩且呈绿色即可，优选具有长度大于4cm的叶柄的绿色复叶。如本领域常 规，所述绿色带柄叶片在接种前，叶柄部位一般需要进行外植体消毒，以防杂菌感染。较佳 地，所述绿色复叶在接种前，去掉部分小叶（优选去掉侧生小叶，保留中间小叶）。
[0020] 在叶柄插入所述检测容器中的接种体中后，较佳地，使用湿脱脂棉在容器口对叶 柄进行固定，所述固定同时将去掉小叶形成的创口隔绝空气。
[0021] 本发明中，步骤（3)为暗培养。
[0022] 其中，所述密闭空间可以是本领域常规的无菌空间，如可以选用规格较大的塑料 盒。在具体操作中，则可以先将步骤（2)接种有大豆植株材料的检测容器（如离心管）置 于冷冻盒，再将冷冻盒放置在大塑料盒中，最后将大塑料盒置于高温高湿环境（优选25°C， 90~100%RH)进行暗培养。
[0023] 所述鉴定方法的一较佳实例包括如下步骤：
[0024] (1)接种体的制备：将大豆疫霉菌株在CA培养基上暗培养7~10d，培养温度为 25°C，之后接种感病大豆品种的幼苗恢复毒力，在植株发病后进行病原菌的分离和纯化，将 纯化得到的大豆疫霉菌株接种于CA培养基，暗培养7~10d，之后将富含菌体的培养基用豆 浆机打碎至均匀，即得接种体；
[0025] (2)接种大豆植株材料：将步骤⑴所得的接种体盛装于2mL去盖离心管中，选取 待检大豆植株具有长度大于4cm的叶柄的刚刚平展的绿色复叶，将所述复叶两侧的小叶去 除，将叶柄插入所述离心管中的接种体中，用湿润的脱脂棉在离心管口对叶柄进行固定同 时将去除小叶形成的创口隔绝空气；
[0026] (3)暗培养：将步骤（2)中接种了大豆材料的离心管放入冷冻盒中，将所述冷冻盒 放置在底部铺有湿润海绵的密封塑料盒中，将所述密封塑料盒置于25°C暗培养4天判断结 果，所述判断结果的判断标准为，当培养4天后，若叶片和叶柄保持绿色或叶柄上病斑的长 度小于等于1. 5cm，则待检大豆植株为抗病植株，若叶柄上病斑的长度大于1. 5cm，则待检 大S?植株为感病植株。
[0027] 本发明提供的技术方案之二是：前述鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法在大豆育种 中的应用。
[0028] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0029] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0030] 本发明的积极进步效果在于：
[0031] 本发明的鉴定方法有下述优势：1)不影响大豆植株的生长；2)操作简便，成本低 廉；3)实验条件可控性高，实验所占空间很小，耗时短；4)可以在大豆绝大部分生育期进行 鉴定实验，能够进行重复实验；5)能够同时开展对多个大豆疫霉菌株的鉴定；6)不会损失 待鉴定的实验材料，避免传统方法会造成实验材料群体性丢失的弊端。因此，本发明的鉴定 方法在大豆育种中具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0032] 图1为实施例1中选取的绿色带柄复叶将两侧小叶去除后的示意图，以及将去除 了小叶后的叶柄插入接种体后的示意图。
[0033]图2为实施例1在接种叶柄暗培养4天后观察感病或抗病情况的示意图，其中，左 边叶片为已确定是抗病的植株的状态，右边叶片为已确定是感病的植株的状态。
【具体实施方式】
[0034] 以下实施例用于说明本发明，但并不用来限制本发明的范围。本发明中，除特殊说 明的之外，所有设备、试剂和材料均为常规市售可得。
[0035]实施例1一种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法[0036] (1)大豆疫霉接种体的制备
[0037] 大豆疫霉菌株（ATCCX_ 52696?)保存在CA培养基上，实验时将菌株转入含 有15ml1. 5 %琼脂的CA培养基的培养皿中，25 °C黑暗培养7-10天，培养环境相对湿度 为 90 ~100 %。接种感病品种Williams(该品种在"GeneticAnalysisofSoybean PlantIntroducti