onswithResistancetoPhytophthorasojae，GordonSG，et al.Phytopathology, 2007Jan;97 (1) : 106-12"中有披露，为常规大豆感病品种）幼苗恢复 毒力，植株发病后进行病原菌的分离和纯化，用于接种。接种前一周，将菌株转入含有15ml 的含有1. 5 %琼脂的CA培养基的培养皿中，25 °C黑暗培养7-10天，培养环境相对湿度为 90~100%。接种时，用九阳豆浆机将含有菌丝的培养基打碎配制接种体，分装到5ml的注 射器中，接种备用。
[0038] (2)接种大豆植株材料：剪取大豆植株上部一个健康幼嫩复叶，留4cm叶柄，将两 边的小叶剪去（如图1所示）。
[0039] ⑶暗培养
[0040] 用注射器在去盖的2ml离心管底部注入0. 5ml的接种体，将大豆叶片的叶柄插入 接种体中，在离心管口处，用湿润的棉花包裹叶柄（如图1所示），起固定和保湿作用。然后 将离心管放入100格的冷冻盒中。将冷冻盒放入底部铺有湿润海绵的大塑料盒中，盒上部 用一层塑料布密封紧，放入25°c培养室保湿培养4天后进行病情调查（如图2所示）。记 录叶片和叶柄状态，若叶柄已感染，记录叶柄上病斑的长度。
[0041] 选取13个大豆品系（如表1所示）进行上述实验，前期的下胚轴创伤接种法 (Schmitthenner,A.F. , &Bhat,R.G. (1994).UsefulmethodsforstudyingPhytophthora inthelaboratory.SpecialCircular-OhioAgriculturalResearchandDevelopment Center, (143))表明，其中7个品系对3个大豆疫霉菌株均表现出抗性，豫豆25对PsUSAR2 和PsMCl表现出抗性，而新黄豆只对PsMCl表现出抗性，还有4个品系为对3个大豆疫霉菌 株均表现出感病，叶柄接种法的鉴定结果与之相符。统计学分析后，得出如下判断感病和抗 病的标准为：在步骤（3)暗培养4天后，若叶片和叶柄均保持绿色，或叶柄病斑长度不超过 1. 5cm则为抗病植株（R);若叶柄变褐变软，且病斑长度大于1. 5cm则为感病植株（S)。
[0042] 表1各大豆品系以下胚轴创伤接种法和叶柄接种法进行鉴定的结果
[0043]
[0044]
[0045] 实施例2 -种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法
[0046] (1)大豆疫霉接种体的制备
[0047] 大豆疫霉菌株保存在胡萝卜汁琼脂（CA)培养基上，实验时将菌株转入含有15ml 的1. 5%琼脂的CA培养基培养皿中，22°C黑暗培养7-10天，接种感病品种Williams幼苗恢 复毒力，植株发病后进行病原菌分离和纯化，用于接种。接种前一周，将菌株转入含有15ml 的含有1. 5%琼脂的CA培养基的培养皿中，27°C黑暗培养7-10天。接种时，用九阳豆浆机 将含有菌丝的培养基打碎配制接种体，分装到5ml的注射器中，接种备用。
[0048] (2)接种大豆植株材料：剪取大豆植株上部一个健康幼嫩复叶，留4cm叶柄，将两 边的小叶剪去。
[0049] ⑶暗培养
[0050] 用注射器在去盖的2ml离心管底部注入0. 5ml的接种体，将大豆叶片的叶柄插入 接种体中，在离心管口处，用湿润的棉花包裹叶柄，起固定和保湿作用。然后将离心管放入 1〇〇格的冷冻盒中。将冷冻盒放入底部铺有湿润海绵的大塑料盒中，盒上部用一层塑料布密 封紧，放入25°C培养室保湿培养4天后进行病情调查。记录叶片和叶柄状态，若叶柄已感 染，记录叶柄上病斑的长度。
[0051] 根据实施例1得出的判断感病和抗病的标准判断结果，在这些植株生长一段时间 后采样进行重复实验，结果表明重复实验的结果和前期的检测结果一致，同实施例1中同 样地，这些被测植株在前期以下胚轴创伤接种法测得的结果和在本实施例中以叶柄接种法 所得结果一致。这表明本发明的鉴定方法及其判断标准准确可靠。
[0052] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易 见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护 的范围。
【主权项】
1. 一种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法，其特征在于，其包括如下步骤： (1) 接种体的制备：将大豆疫霉（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)菌株接 种于CA培养基、V8培养基或利马豆培养基，暗培养使菌株复壮，之后将富含菌体的培养基 处理碎，即得接种体； (2) 接种大豆植株材料：将步骤（1)所得的接种体盛装于检测容器中，选取待检大豆植 株刚刚平展的绿色带柄叶片，将叶柄插入所述检测容器中的接种体中； (3) 暗培养：将步骤（2)中接种了大豆材料的检测容器置于湿润的密闭空间中暗培养 后判断结果，所述密闭空间的温度为22~27°C，所述密闭空间的相对湿度为90~100% ; 所述判断结果的判断标准为，当培养3~5天后，若叶片和叶柄保持绿色或叶柄上病斑的长 度小于等于I. 5cm，则待检大豆植株为抗病植株，若叶柄上病斑的长度大于I. 5cm，则待检 大S?植株为感病植株。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将大豆疫霉菌株接种于CA培养基、V8 培养基或利马豆培养基之前，还包括对所述大豆疫霉菌株进行分离和纯化的步骤（S):将 大豆疫霉菌株在CA培养基上暗培养7~10d，培养温度为22~27 °C，之后接种感病大豆品 种的幼苗恢复毒力，在植株发病后进行病原菌的分离和纯化，将得到的大豆疫霉菌株用于 步骤⑴接种。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述暗培养的温度为22~ 27°C;所述暗培养的时间为7~10天。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述的将富含菌体的培养基处 理碎为使用豆浆机将富含菌体的培养基处理碎。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测容器为2~5mL的离心管。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中所述的绿色带柄叶片为具有长 度大于4cm的叶柄的绿色复叶。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述绿色复叶在接种前，去掉部分小叶。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，在叶柄插入所述检测容器中 的接种体中后，使用湿脱脂棉在容器口对叶柄进行固定。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其包括如下步骤： (S)大豆疫霉菌株的分离和纯化：将大豆疫霉菌株在CA培养基上暗培养7~10d，培养 温度为25°C，之后接种感病大豆品种的幼苗恢复毒力，在植株发病后进行病原菌的分离和 纯化，得到纯化的大豆疫霉菌株； (1) 接种体的制备：将纯化得到的大豆疫霉菌株接种于CA培养基，暗培养7~10d，之 后将富含菌体的培养基用豆浆机打碎成匀浆，即得接种体； (2) 接种大豆植株材料：将步骤（1)所得的接种体盛装于2mL去盖离心管中，选取待 检大豆植株上刚刚平展的具有长度大于4cm的叶柄的绿色复叶，将所述复叶两侧的小叶去 除，将叶柄插入所述离心管中的接种体中，用湿润的脱脂棉在离心管口对叶柄进行固定同 时将去除小叶形成的创口隔绝空气； (3) 暗培养：将步骤（2)中接种了大豆材料的离心管放入冷冻盒中，将所述冷冻盒放置 在底部铺有湿润海绵的密封塑料盒中，将所述密封塑料盒置于25°C暗培养4天判断结果， 所述判断结果的判断标准为，当培养4天后，若叶片和叶柄保持绿色或叶柄上病斑的长度
【专利摘要】本发明提供一种鉴定大豆对大豆疫病抗性的方法及其在育种中的应用。所述方法包括步骤：将大豆疫霉菌株接种于CA培养基、V8培养基或利马豆培养基，暗培养使菌株复壮，之后将富含菌体的培养基处理碎，即得接种体；(2)接种大豆植株材料：将步骤(1)所得的接种体盛装于检测容器中，选取待检大豆植株刚刚平展的绿色带柄叶片，将叶柄插入所述检测容器中的接种体中；(3)暗培养：将步骤(2)接种了大豆材料的检测容器置于湿润的密闭空间中暗培养后判断结果。本发明的鉴定方法操作简便，成本低廉，节约时间，且可以进行重复实验，同时不会损失待鉴定的实验材料，避免传统方法会造成实验材料群体性丢失的弊端。
【IPC分类】A01H3/04, A01H3/00
【公开号】CN105165604
【申请号】
【发明人】朱振东
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月15日