专利名称：大豆检疫性真菌病害多重实时荧光pcr检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测大豆疫病菌、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌四种中一种或多种大豆真菌病害的简单、快速、特异、灵敏 的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
背景技术：
大豆(Glycine max)是我国重要的油料作物和粮食作物，也是世界上食用油和植 物蛋白的主要来源，在我国国民经济中占有重要地位。目前我国大豆产量居世界第四位，但 仍然不能满足国内植物油及饲料蛋白加工的需要。随着我国进口大豆的数量逐年递增，各 种危害大豆生产的病害传入的风险也逐渐增大。其中本发明涉及的四种大豆真菌病害是目 前严重影响大豆生产及贸易的真菌病害，具有重要的检疫重要性和经济重要性。大豆疫病菌(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann,简称 PS)是大豆生产上 的毁灭性病害之一，主要引起大豆疫霉根腐病(SoybeanPhytophthora Root Rot)。该病害 在加拿大、阿根廷、巴西、澳大利亚、日本、中国等20多个国家均有发病报道，造成严重的经 济损失。1989-1991年间在美国大豆主产区的28个州，由该病害造成的年平均损失就达 1.88亿美元。目前全世界每年因大豆疫霉根腐病造成的损失达10多亿美元。大豆疫霉菌 在大豆的各个生长发育期均可侵染和危害，引起寄主根、茎、枝和种子腐烂，严重时造成绝 产，是危害极其严重的土传病害。由于疫霉菌的形态特征和生物学特性具有较大的变异，采 用传统的方法，难以区分形态和习性相似的种，而传统的检测方法检测时间长、工作量大， 无法满足快速检疫的需要。近年来国内外对该病的快速检测方法主要集中在常规PCR和实 时荧光PCR方法。大豆拟茎点霉种子腐烂病菌(Phomopsis longicolla，简称PL)造成种子皱缩、变 长、皮裂，并出现白垩。感病的种子经常不能萌发或者萌发延迟。种子感病导致出苗前后的 猝死，在恶劣条件下，严重影响大豆的产量和品质。感病的作物残体和土壤是初侵染的主要 侵染源。带病植株也是该病原长距离传播的一个重要因素。大豆豆荚在其形成后的任何时 间都可能被侵染，给大豆的生产带来严重的影响。PL的寄主范围很广，除大豆外，还危害三 叶草、绿豆、利马豆、豌豆、花生、大蒜、洋葱、辣椒、番茄、三裂叶豚草、苍耳、小地锦草、皱叶 酸模等。DPC、DPM、DPS、PL共同引起间座壳-拟茎点综合症，产生的危害超过其中任何单一 真菌病害，而PL是其中最常被分离到和最为重要的一种。目前主要有PCR-RFLP等方法检 测。大豆茎溃疡病(Soybean Stem Canker，简称SSC)是大豆生产上的一种重要病 害，病原菌分别为大豆北方莲馈荡病菌(Diaporthe phaseolorum(Cookeet Ell) Sacc. var. caulivora Athow et Caldwell,简称 DPC)禾口 大豆南方莲馈荡病菌(Diaporthe phaseolorum (Cooke et Ell. ) Sacc. var. meridionalis F. A. Fernandez,简禾尔 DPM),这两禾中 病原菌都是我国重点关注进境植物检疫对象。该病菌侵染植株后迅速发展形成茎杆环状损伤，并可导致正在生长的植株死亡。发病严重的田块有80%的植株受到侵染，产量损失高 达50 %，造成严重的经济损失。近年来该病害发展迅速，在美国、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉 圭、意大利、前南斯拉夫、克罗地亚等欧洲部分国家及地区有发生报道，是国外大豆生产上 的重要病害。目前我国尚没有DPM的发生报道。总的来说，目前对于四种真菌病害的检测方法存在诸多不足。比如形态学检测周 期长、需要丰富经验，有的真菌采用形态学鉴定还存在较大的争议或难以区分其近似形态 的种属；而现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好 等。并且，目前尚未有能对四种检疫性大豆真菌病害同时进行检测的多重检测方法。随着我国对进口大豆需求的增加，各种大豆病害传入的风险也不断增加，对我国的大豆生产构成巨大的潜在威胁。因此，在口岸检疫部门采用简单、快速、特异、灵敏的检测 方法对其中具有严重影响的病害进行检测，对保护我国大豆生产，防止其重要检疫性病原 真菌的传入具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提出快速、可靠、灵敏度高、特异性强和价格便宜的检测大豆疫 病菌、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌四种大豆大 豆真菌病害重要病害的引物、寡核苷酸探针、试剂盒及多重实时荧光PCR检测方法。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案本发明提供了一种用于大豆真菌病害实时荧光PCR检测的引物和寡核苷酸探针， 至少包括选自表1两组以上大豆真菌病害的一对引物和对应的寡核苷酸探针。表1大豆真菌病害多重实时荧光PCR检测各种大豆真菌病害对应各组的引物和寡 核苷酸探针一览表 上表中探针5，和3，端标记的SAT、URA、JUP、MAR为荧光自淬灭基团，即其5'禾口 3'标记的是同一基团，通过寡核酸连接进行荧光谐振能量传递。在扩增反应中，由于扩增酶的5'外切酶作用将与模板匹配的探针切割，使两个基团分开；在一定激发光条件下，荧光基团发出自身波长的光子。不同的荧光信号标记类型其需要的激发光条件不同，能够被 收集到的荧光信号也有所不同，从而实现多重检测。本发明又提供了一种用于大豆真菌病害实时荧光PCR检测的试剂盒，至少包括根 据表1所述的两组以上的大豆真菌病害的一对引物和对应的寡核苷酸探针。本发明再提供了一种大豆真菌病害实时荧光PCR检测方法采用的技术方案，包括 如下步骤步骤一设计检测选自大豆疫病菌、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌、大豆南方茎溃疡 病菌、大豆北方茎溃疡病菌中两种以上大豆真菌病害的引物和寡核苷酸探针；步骤二 将步骤一中设计的两种以上大豆真菌病害的引物和寡核苷酸探针同时进 行实时荧光PCR反应，并优化出合适的反应体系和反应条件；步骤三根据荧光信号类型判定检测样品的大豆真菌病害。采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于(1)设计出了同时检测大豆上 四种重要大豆真菌病病害的多重实时荧光PCR快速检测的引物、寡核苷酸探针和试剂盒， 克服了现有的分子检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等 缺点。(2)本发明的多重实时荧光PCR检测方法能同时检测大豆上的四种重要大豆真菌病 害，在国内外大豆检疫性真菌病害的检测中尚属先例。(3)本发明适合大豆上四种重要病害 的多重检测。(4)由于本发明检测快速、特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求特别 强的场合使用。综上所述，采用本发明，能对实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行大 豆疫病菌、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌、大豆南方茎溃疡病菌以及大豆北方茎溃疡病菌四 种大豆真菌病害进行分子生物学鉴定或检测，其意义重大。
图1四重实时荧光PCR特异性检测结果1为大豆南方茎溃疡病菌DPM组特异扩增结果，2为大豆北方茎溃疡病菌DPC组特 扩增结果，3为大豆拟茎点霉种子腐烂病菌PL组特异扩增结果，4为大豆疫病菌P. sojae组 特异扩增结果
具体实施例方式下面通过具体的实施例并对本发明作进一步详细的描述。实例1大豆上四种重要真菌病害四重实时荧光PCR检测及试剂盒一种用于大豆上四种重要检疫性真菌病害四重实时荧光PCR检测的引物、寡核苷 酸探针及试剂盒，用于大豆上四种重要检疫性真菌病害的特异性检测。分别先对大豆疫病菌、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆 北方茎溃疡病菌四种大豆真菌病害的核糖体内转录区(rDNAITS区)和翻译延伸因子Ia片 段进行测序、比对分析，找出各检测靶标序列独有的碱基位点。设计出的所述引物具有如下 的核酸序列 设计出的寡核苷酸探针具有如下的核酸序列 应用上述引物和寡核苷酸探针可制成用于大豆上四种重要检疫性真菌病害四重 实时荧光PCR检测试剂盒。实施例2利用四重实时荧光PCR检测方法对四种检疫性真菌病害的分离培养物中 提取的DNA进行检测所用引物和寡核苷酸探针是实施例1中的引物和寡核苷酸探针。其检测反应的体系见表2其检测反应条件见表3。表2四重实时荧光PCR检测反应体系(20 μ 1)试剂组分(初始浓度)加入量(μ I)
实时荧光反应混合液2Χ PCRmixΙΟμΙ (ABI公司，产品型号4304437)
DPM 组引物探针 ΜΙΧ(5μ Μ)0.25μ 1P.sojaee 组引物探针 ΜΙΧ(5μΜ)2μ1
DPC组引物探针ΜΙΧ(5μ Μ)2μ 1
PL组引物探针ΜΙΧ(5μ Μ)2μ 1
待检样品DNA5个拷贝~100ng
ddH20补至20 μ 1体积
-\表3检测反应条件扩增程序 以含四种病原菌DNA的模板为阳性对照，以其近似种DNA模板为阴性对照，并设置 水空白对照。按照表1提供的探针标记信息对实时荧光PCR进行相应荧光收集设置。实时荧光PCR检测结果为定量PCR仪检测到阳性对照报告荧光有明显信号增长， 阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而检测样品的报告荧光信号有明显增 长，则根据检测样品的荧光信号类型判定检测样品属于哪种病原菌(见图1)。采用本发明的方法检测大豆上的四种检疫性真菌病害比传统形态学方法更加快 速、准确，且易于推广应用。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属 技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
权利要求
一种对大豆真菌病害实时荧光PCR检测的方法，包括如下步骤步骤一设计检测选自大豆疫病菌、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌中两种以上大豆真菌病害的引物和寡核苷酸探针；步骤二将步骤一中设计的两种以上大豆真菌病害的引物和寡核苷酸探针同时进行实时荧光PCR反应；步骤三根据荧光信号类型判定检测样品的大豆真菌病害。
2.根据权利要求1所述的对大豆真菌病害实时荧光PCR检测的方法，其特征在于所 述大豆疫病菌的一对引物是P. S0JAE-1F :5’ -TGGTTTGGGTCCTCCTCGT-3，SEQ ID NO 1P. S0JAE-1R :5’ -TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’ SEQ ID NO :2，所述大豆拟茎点霉种子腐烂病菌的一对引物是PL-1F :5’ -AGCATCACTTTCATTCCCACTT-3，SEQ ID NO 3PL-1R 5' -GGCTGTGTAGAAAGAGTCAGCAT-3，SEQ ID NO :4，所述大豆南方茎溃疡病菌的一对引物是DPM-1F :5’ -CCAGAAACCCTTTGTGAACTC-3‘ SEQ ID NO 5DPM-1R 5' -TGTTTTTTGCTCAGAGTTTCG-3，SEQ ID NO :6，所述大豆北方茎溃疡病菌的一对引物是DPC-1F :5，-GCTTGGTGTTGGGGCACT-3’ SEQ ID NO 7DPC-1R 5' -TACGCTCGGGGTCCTGG-3，SEQ ID NO :8。
3.根据权利要求1或2所述对大豆病害实时荧光PCR检测的方法，其特征在于 所述大豆疫病菌的寡核苷酸探针是P. S0JAE-1Q :5’ -SAT-ACCCATTCTTAAATACTGAA-SAT-3’ SEQID NO :9，所述大豆拟茎点霉种子腐烂病菌的寡核苷酸探针是PL-Q :5’ -URA-TCTGCTCCAGAGAGCTT-URA-3‘ SEQ ID NO :10，所述大豆南方茎溃疡病菌的寡核苷酸探针是DPM-1Q :5，-JUP-ACAAGAGTTGGCTTGGC-JUP-3，SEQ IDN0 :11，所述大豆北方茎溃疡病菌的寡核苷酸探针是DPC-1Q :5’ -MAR-TGAAATTCATTGGCGAGCT-MAR-3‘ SEQ IDN0 :12。
4.根据权利要求1所述对四种大豆真菌病害实时荧光PCR检测的方法，其特征在于 所述检测四种大豆真菌病害的引物和寡核苷酸探针为所述大豆疫病菌的一对引物是P. S0JAE-1F :5’ -TGGTTTGGGTCCTCCTCGT-3，SEQ ID NO 1 P. S0JAE-1R :5’ -TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’ SEQ ID NO :2， 所述大豆拟茎点霉种子腐烂病菌的一对引物是 PL-1F :5’ -AGCATCACTTTCATTCCCACTT-3，SEQ ID NO 3 PL-1R 5' -GGCTGTGTAGAAAGAGTCAGCAT-3，SEQ ID NO :4， 所述大豆南方茎溃疡病菌的一对引物是 DPM-1F :5’ -CCAGAAACCCTTTGTGAACTC-3‘ SEQ ID NO 5 DPM-1R 5' -TGTTTTTTGCTCAGAGTTTCG-3，SEQ ID NO :6，所述大豆北方茎溃疡病菌的一对引物是 DPC-1F :5，-GCTTGGTGTTGGGGCACT-3’ SEQ ID NO 7 DPC-1R 5' -TACGCTCGGGGTCCTGG-3，SEQ ID NO :8，所述大豆疫病菌的寡核苷酸探针是P. S0JAE-1Q :5’ -SAT-ACCCATTCTTAAATACTGAA-SAT-3’ SEQID NO :9，所述大豆拟茎点霉种子腐烂病菌的寡核苷酸探针是PL-Q :5’ -URA-TCTGCTCCAGAGAGCTT-URA-3‘ SEQ ID NO :10，所述大豆南方茎溃疡病菌的寡核苷酸探针是DPM-1Q :5，-JUP-ACAAGAGTTGGCTTGGC-JUP-3，SEQ IDN0 :11，所述大豆北方茎溃疡病菌的寡核苷酸探针是DPC-1Q :5’ -MAR-TGAAATTCATTGGCGAGCT-MAR-3‘ SEQ IDN0 :12。
5.根据权利要求4所述的大豆真菌病害实时荧光PCR检测方法，其步骤二中所述反应 体系为实时荧光反应混合液2XPCR mix为10 iil，5 iiM的DPM组引物和寡核苷酸MIX为 0.25iil，5iiM&P. 80」36组引物和寡核苷酸肌1为2111，511|1的0 (组引物和寡核苷酸 MIX为2 ill，5 ii M的PL组引物和寡核苷酸MIX为2 ill，待检样品DNA为5个拷贝约lOOng， 加双蒸水将总体系补至20 u 1体积。
6.一种用于大豆真菌病害实时荧光PCR检测的引物，至少包括选自如下两对以上大豆 真菌病害的引物一对用于检测大豆疫病菌的引物是 P. S0JAE-1F :5’ -TGGTTTGGGTCCTCCTCGT-3，SEQ ID NO 1 P. S0JAE-1R :5’ -TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’ SEQ ID NO :2， 一对用于检测大豆拟茎点霉种子腐烂病菌的引物是 PL-1F :5’ -AGCATCACTTTCATTCCCACTT-3，SEQ ID NO 3 PL-1R 5' -GGCTGTGTAGAAAGAGTCAGCAT-3，SEQ ID NO :4， 一对用于检测大豆南方茎溃疡病菌的引物是 DPM-1F :5’ -CCAGAAACCCTTTGTGAACTC-3‘ SEQ ID NO 5 DPM-1R 5' -TGTTTTTTGCTCAGAGTTTCG-3，SEQ ID NO :6， 一对用于检测大豆北方茎溃疡病菌的引物是 DPC-1F :5，-GCTTGGTGTTGGGGCACT-3’ SEQ ID NO 7 DPC-1R 5' -TACGCTCGGGGTCCTGG-3，SEQ ID NO :8。
7.一种用于大豆真菌病害实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，至少包括选自如下寡核 苷酸探针中的两条以上一条用于检测大豆疫病菌的寡核苷酸探针是 P. S0JAE-1Q :5’ -SAT-ACCCATTCTTAAATACTGAA-SAT-3’ SEQID NO :9， 一条用于检测大豆拟茎点霉种子腐烂病菌的寡核苷酸探针是 PL-Q :5’ -URA-TCTGCTCCAGAGAGCTT-URA-3‘ SEQ ID NO :10， 一条用于检测大豆南方茎溃疡病菌的寡核苷酸探针是 DPM-1Q :5，-JUP-ACAAGAGTTGGCTTGGC-JU-3‘ SEQ IDN0 :11， 一条用于检测大豆北方茎溃疡病菌的寡核苷酸探针是DPC-1Q :5’ -MAR-TGAAATTCATTGGCGAGCT-MAR-3‘ SEQ IDN0 :12。
8.一种用于大豆真菌病害实时荧光PCR检测的引物和寡核苷酸探针，至少包括选自如 下两组以上大豆真菌病害的一对引物和对应的寡核苷酸探针第一组一对用于检测大豆疫病菌的引物P. S0JAE-1F :5’ -TGGTTTGGGTCCTCCTCGT-3，SEQ ID NO 1P. S0JAE-1R :5’ -TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’ SEQ ID NO :2，一条用于检测大豆疫病菌的寡核苷酸探针P. S0JAE-1Q :5’ -SAT-ACCCATTCTTAAATACTGAA-SAT-3’ SEQID NO :9，第二组一对用于检测大豆拟茎点霉种子腐烂病菌的引物 PL-1F :5’ -AGCATCACTTTCATTCCCACTT-3，SEQ ID NO 3 PL-1R 5' -GGCTGTGTAGAAAGAGTCAGCAT-3，SEQ ID NO :4， 一条用于检测大豆拟茎点霉种子腐烂病菌的寡核苷酸探针 PL-Q :5’ -URA-TCTGCTCCAGAGAGCTT-URA-3‘ SEQ ID NO :10， 第三组一对用于检测大豆南方茎溃疡病菌的引物 DPM-1F :5’ -CCAGAAACCCTTTGTGAACTC-3‘ SEQ ID NO 5 DPM-1R 5' -TGTTTTTTGCTCAGAGTTTCG-3，SEQ ID NO :6， 一条用于检测大豆南方茎溃疡病菌的寡核苷酸探针 DPM-1Q :5，-JUP-ACAAGAGTTGGCTTGGC-JUP-3，SEQ IDN0 :11， 第四组一对用于检测大豆北方茎溃疡病菌的引物 DPC-1F :5，-GCTTGGTGTTGGGGCACT-3’ SEQ ID NO 7 DPC-1R 5' -TACGCTCGGGGTCCTGG-3，SEQ ID NO :8， 一条用于检测大豆北方茎溃疡病菌的寡核苷酸探针 DPC-1Q :5’ -MAR-TGAAATTCATTGGCGAGCT-MAR-3‘ SEQ IDN0 :12。
9.一种用于大豆真菌病害实时荧光PCR检测的试剂盒，至少包括两组以上根据权利要 求8所述的大豆真菌病害的一对引物和对应的寡核苷酸探针。
10.一种用于大豆真菌病害实时荧光PCR检测的试剂盒，包括四组根据权利要求7所述 的大豆真菌病害的一对引物和对应的寡核苷酸探针。
全文摘要
本发明涉及一种同时检测大豆疫病菌、大豆拟茎点霉种子腐烂病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌四种中一种或多种大豆真菌病害的简单、快速、特异、灵敏的实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
文档编号G01N21/64GK101857905SQ20091010661
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月10日 优先权日2009年4月10日
发明者王颖, 程颖慧, 章桂明, 陈枝楠 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心