专利名称：检测美澳型核果褐腐病菌的引物、探针、试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，具体地说，涉及一种对美澳型核果褐腐病菌 (Monilinia fructicola(Winter)Honey)进行简单、快速、特异、灵敏地探针实时荧光PCR 检测方法及其试剂盒；适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
背景技术：
美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola (Winter) Honey)已列入我国 2007 年5月公布的“中华人民共和国进境植物检疫危险性病虫杂草名录”，同时也列入欧盟检疫 性有害生物名录。该病原菌为害李子、杏、桃、油桃、樱桃、梅李、苹果、梨和葡萄等多种水果 以及木瓜属、山楂属、枇杷属等寄主，引起果腐、花腐和叶枯等。它既能在果园中引起危害， 又能为害储藏期 果实，还可在果实中潜伏侵染。该病菌在世界分布于北美洲、大洋洲、欧洲、 亚洲、非洲、中美及加勒比海地区的许多国家，我国的北京部分桃园和台湾也有报道。我国 从美国等国家进口大量李子、苹果等水果，美澳型核果褐腐病菌随贸易性水果进入我国风 险极大，对我国的农业生产构成潜在威胁，因此，需要在口岸检疫部门严格加强检疫工作， 防止该病原真菌的传入。由于美澳型核果褐腐病菌与该属的另外两个种核果褐腐病菌(M. Iaxa)和欧洲种 仁果褐腐病菌(M. fructigena)在病原菌形态特征、培养性状、危害症状等方面相似，用形 态学方法不易区分，需要丰富的鉴定经验，一般需要经验丰富的真菌鉴定专家。而且需要分 离培养，费时较长。实时荧光PCR检测方法是一种在定性PCR基础上于1996年才发展起来的一种检 测方法，该方法因为在PCR的同时加入了一段TaqMan探针，从而可以较有效地避免定性PCR 无法避免的非特异性扩增和假阳性现象，该方法在医学上得到较广泛的应用，近几年该方 法又应用于转基因产品的定量检测。在国外，实时荧光PCR首次应用于植物真菌病害检测 领域是在2000年。在我国，章桂明、程颖慧等人首次于2001年将实时荧光PCR检测方法应 用于小麦印度腥黑穗病菌及其近似种的检测中。TaqMan MGB探针方法是在TaqMan方法之后产生的更新的方法，MGB的全称为 Minor Groove Binder，在2001年被推出。与TaqMan探针相比，其原理是TaqMan MGB探针 一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标 记；二是探针的3’端另结合了 Minor Groove binder结合物，使探针的Tm值提高，大大增 加了探针的杂交稳定性。但是，将TaqMan MGB探针的实时荧光PCR检测方法应用于病原真菌的检测，无论 在国外，还是在国内，还是刚刚起步，需要做更多的探索研究工作。
发明内容
本发明的目的意在于提出快速、可靠、灵敏度高、特异性强和价格便宜地检测美澳 型核果褐腐病菌的引物、探针、试剂盒及实时荧光PCR检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了一条引物，其序列为SEQ ID NO 1 =SZMfc-F 5， -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3，。还提供了另一条引物，其序列为SEQ ID NO 2 SZMfc-R 5， -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3，。 又提供了 一条寡核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO :3: 5，-FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，，其中 FAM 为荧光分子，MGB 指另结合了 Minor Groove binder结合物。还提供了用于美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测的引物及寡核苷酸探针，所 述寡核苷酸探针包括特异性检测美澳型核果褐腐病菌的TaqManMGB探针和特异结合的寡 核苷酸序列。优选地，所述引物具有如下的核酸序列SZMfc-F :5，-CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3，SEQ ID NO 1SZMfc-R :5，-CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3，SEQ ID NO :2。优选地，所述寡核苷酸探针具有如下的核酸序列SZMfc-Pb :5，-FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ ID NO :3。本发明另提供了一种用于美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测的试剂盒，所述 试剂盒包含上述的引物和寡核苷酸探针。本发明还提供了一种美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测方法，包括如下步 骤(1)先对美澳型核果褐腐病菌、核果褐腐病菌和欧洲种仁果褐腐病菌内转录间隔 区(ITS)进行序列测定及比较分析，分别找出美澳型核果褐腐病菌不同于其它近似种的独 有的碱基位点；(2)设计美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测的引物和寡核苷酸探针；(3)对所设计的探针进行筛选及反应体系和反应条件的优化，筛选出优化的引物 和探针，并优化出合适的反应体系和反应条件；(4)加入上述的引物、探针进行美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR反应。采用该检测方法的结果判定标准是1)若定量PCR仪检测到以美澳型核果褐腐病 菌DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有 荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，则表示所检测的真菌是美 澳型核果褐腐病菌；2)若定量PCR仪检测到以美澳型核果褐腐病菌DNA为模板的阳性对 照报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品 的检测结果是报告荧光也没有荧光信号增长，则表示所检测的真菌不是美澳型核果褐腐病 菌。采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于1、设计出了针对适用于美澳型 核果褐腐病菌实时荧光PCR快速检测的引物、寡核苷酸探针和试剂盒，克服了现有的形态 学鉴定方法检测周期长、需要丰富经验的缺点，也克服了现有的分子检测方法操作复杂或 检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等缺点。2、本发明适合美澳型核果褐腐病菌 的检测，而且也适合水果寄主传带的美澳型核果褐腐病菌的检测。3、由于本发明检测快速、 特异性强，特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。
综上所述，采用本发明能对实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行美澳 型核果褐腐病菌分子生物学鉴定或检测，其意义重大。
图1是本发明具体实施方式
实施例2中特异性引物探针扩增结果，右边为检测样 品的编号；812672为美澳型核果褐腐病菌M. fructicola菌株，816263为美澳型核果褐腐 病菌M. fructicola菌株，815702为美澳型核果褐腐病菌M. fructicola菌株，MFC-nb为美 澳型核果褐腐病菌M. fructicola菌株，P4236-nb为美澳型核果褐腐病菌Μ. fructicola 菌株，10923为美澳型核果褐腐病菌M. fructicola菌株，10921为核果褐腐病菌M. Iaxa菌 株，10922为欧洲种仁果褐腐病菌M. fructigena菌株，Pd-I为棕榈疫霉病菌Phytophthora palmivora
具体实施例方式下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。实例例1美澳型核果褐腐病菌TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测及试剂盒一种用于美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)实时荧光PCR检测的引 物、寡核苷酸探针及试剂盒，用于美澳型核果褐腐病菌的特异性检测。所述引物具有如下的核酸序列SZMfc-F :5，-CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3，SEQ ID NO 1SZMfc-R :5，-CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3，SEQ ID NO :2，所述寡核苷酸探针具有如下的核酸序列SZMfc-Pb :5，-FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ IDNO :3。所述试剂盒为应用上述引物和寡核苷酸探针制成的用于美澳型核果褐腐病菌检 测的实时荧光PCR检测试剂盒。实施例2利用美澳型核果褐腐病菌TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测方法对进 口鲜李中美澳型核果褐腐病菌的检疫鉴定所用引物和寡核苷酸探针是实施例1中的引物和寡核苷酸探针。其检测反应的体系总体积为IOyL,各成分为实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix 5 μ L (ABI 公司，产品型号 4304437)，引物0. 9 μ M，探针0. 2 μ M， DNA 模板 1 μ L (模板浓度 IO-IOOng/ μ L)。其检测反应条件见表1。 表 1从进口美国鲜李中发现可疑病果，按照上述的方法和条件进行检测，实时荧光PCR 检测结果为以美澳型核果褐腐病菌DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，阴 性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而来自进口鲜李中DNA模板的检测结果 为阳性(检测结果如图1所示)。表明所检测的进口鲜李携带美澳型核果褐腐病菌。采用本发明的方法检测美澳型核果褐腐病菌比传统形态学方法更加快速、准确， 且易于推广应用。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
权利要求
一条引物，其序列为SEQ ID NO15’-CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’。
2.一条引物，其序列为SEQ ID NO 2 5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’。
3.一对引物，其序列为SZMfc-F :5’ -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2。
4.一条寡核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO 3 5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3’。
5.一对引物和一条寡核苷酸探针，所述一对引物的序列为 SZMfc-F :5’ -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2， 所述一条寡核苷酸探针的序列为SZMfc-Pb :5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ IDN0 :3。
6.用于美澳型核果褐腐病菌检测的一对引物和一条寡核苷酸探针。
7.根据权利要求6的用于美澳型核果褐腐病菌检测的一对引物和一条寡核苷酸探针， 所述引物序列为SZMfc-F :5’ -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2。
8.根据权利要求6的用于美澳型核果褐腐病菌检测的一对引物和一条寡核苷酸探针， 所述寡核苷酸探针序列为SZMfc-Pb :5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ IDN0 :3。
9.一种用于美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包含一对引 物和一条寡核苷酸探针，所述一对引物的序列为SZMfc-F :5’ -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2， 所述一条寡核苷酸探针的序列为SZMfc-Pb :5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ IDN0 :3。
10.一种大豆真菌病害实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤(1)先对美澳型核果褐腐病菌、核果褐腐病菌和欧洲种仁果褐腐病菌内转录间隔区进 行序列测定及比较分析，分别找出美澳型核果褐腐病菌不同于其它近似种的独有的碱基位占.(2)设计美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测的引物和寡核苷酸探针，所述一对引 物的序列为SZMfc-F 5' -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2， 所述一条寡核苷酸探针的序列为SZMfc-Pb :5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3’ SEQ IDN0 3 ；(3)加入上述的引物、探针进行美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR反应。
全文摘要
本发明公开了一种用于美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola (Winter)Honey)实时荧光PCR检测的引物、寡核苷酸探针、试剂盒及检测方法。所述引物含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列，所述寡核苷酸探针含有SEQ ID NO3的序列，所述检测方法使用所述引物和寡核苷酸探针进行实时荧光PCR来检测美澳型核果褐腐病菌。采用本发明能对实际检疫和田间调查过程中所发现的病组织进行美澳型核果褐腐病菌的简单、快速、特异、灵敏地鉴定或检测，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
文档编号G01N21/64GK101857894SQ20091010653
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月10日 优先权日2009年4月10日
发明者王颖, 程颖慧, 章桂明, 陈枝楠 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心