专利名称：Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及染色体缺失检测领域，尤其涉及一种Y染色体微缺失实时荧光定量 PCR检测试剂盒。
背景技术：
世界范围内有15%的育龄夫妇患有不孕不育症，其中男性不育的因素约占50%， 在这50%的男性不育患者中，35%以上是由于遗传学异常引起的。Y染色体微缺失是导 致男性不育的主要遗传学因素之一，因此检测Y染色体微缺失具有重要的临床参考价值。 1976年，Ti印lolo和Zuffardi发现无精症患者有Y染色体长臂(Yqll)缺失，故称该部位 为无精子因子(azoospermia factor，AZF)。目前认为控制精子生长的基因位于Y染色体长 臂远侧的常染色质区，该部位有无精子因子AZF，现已明确至少有3个精子生成部位(AZFa、 AZFb、AZFc)，分别位于Yqll的近端、中间和远端。Y染色体微缺失发生在Y染色体上与AZF 相关的多个基因上。虽然由于各实验室检测对象的选择标准不同，检出率有比较大的差异， 但各区的缺失频率基本稳定AZFc占总缺失率的79%，AZFb占9%，AZFa+b占6%，AZFa占 3%，AZFa+b+c占3%。这些区域的微缺失将导致精子发生障碍，少精，弱精，甚至无精。
AZFa、AZFb、AZFc 3个区域的STS位点模式图如图1所示。 本发明中的试剂盒分别针对其中3个STS位点，即sY86、sY127和sY255设计特异 的引物对进行SYBR Green I实时荧光定量PCR检测，同时提供sY86、sY127和sY2553个位 点的阳性对照样品，确保检测结果的准确性。 Y染色体微缺失是一种常见的染色体异常疾病，主要是生殖细胞减数分裂过程中 染色体分离不平衡的结果。该疾病可以从正常的带微缺失的精子传递下来，也可以通过正 常精子受精后在胚胎发育过程中发生Y染色体的微缺失。随着现代辅助生殖技术的进展， 卵细胞胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)技术被认为是男性不 育症治疗上的一次革命。然而该技术可能将携带染色体畸形、缺失或基因突变的精子注入 到卵胞浆内，使卵子受精，从而将上述各种遗传缺陷传给下一代。因此，为了确定是否需要 治疗，临床医生建议所有精子浓度< 5X 106/mL的男性原则上都要进行Y染色体微缺失的 分子诊断。从1999年开始，欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控协作网(EMQN)为提 高诊断质量，出版了Y染色体微缺失分子诊断指南，并提供了客观的质量评价实验方法。最 新版的实验室指南是根据2003年10月在佛罗伦萨举行的"Best Practice Meeting"的成 果，在1999年版的基础上修订而成。对于Y染色体微缺失的筛查，1999年版的指南被证明 是准确、灵敏和易于操作的。根据Y染色体序列和微缺失机制的最新研究进展，1999年版的 指南能够满足准确诊断的需要，实践证明是非常有效和合适的。 Y染色体微缺失的分子检测方法主要有Southern blot印迹杂交、聚合酶链式反 应(polymerase chain reaction, PCR)结合电泳检测技术等，其中常规PCR电泳技术是目 前各研究中最常用、最简单和最有效的方法。然而影响常规PCR技术临床应用的巨大障碍
3是扩增产物污染的问题，其结果易出现假阴性和假阳性。尽管采取优化PCR条件和设立对 照安全保证(如使用女性DNA作为阴性对照)等多个严格质量控制措施，PCR的扩增仍可 能会失败。 中国专利200410043918. 0公开了特异性扩增Y染色体微缺失基因STS中的sY87 和sY143的两对引物序列；中国专利200710074317. X公开了特异性扩增Y染色体微缺失基 因AZF的30条引物和特异性扩增男性特有SRY基因的2条引物。以上两个专利都是采用 常规PCR方法进行扩增反应，该方法的不足之处是采用电泳检测，易引起PCR产物的交叉感 染，增加了假阳性结果的可能性。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可稳定、高效检测Y染色体微缺失 的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案 —种Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包 括 特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY86序列的引物，其碱基序列如SEQID NO : 1和2 所示；Y染色体AZFa亚区sY86位点阳性对照样品用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所
示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒作为阳性参考品；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY127序列的引物，其碱基序列如SEQ ID N0:3和
4所示；Y染色体AZFb亚区sY127位点阳性对照样品用SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所 示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒作为阳性参考品；
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY255序列的引物，其碱基序列如SEQ ID N0:5和 6所示；Y染色体AZFc亚区sY255位点阳性对照样品用SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所
示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒作为阳性参考品。 所述试剂盒进一步包括SYBR Green I荧光染料。 所述试剂盒进一步包括MgCl2、 dNTPs和PCR反应缓冲液。 所述MgCl2反应终浓度为4mM。 所述dNTPs反应终浓度为0. 2mM。 本发明的第二个目的在于提供SYBR Green I实时荧光定量PCR在Y染色体微缺 失检测中的应用。 实时荧光定量PCR (real time fluorescence quantitative PCR)是一种新的基 因检测技术，它通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起 始模板定量及定性的分析。该技术在PCR基础上提高了检测特异性；扩增与自动分析一体 化，操作方便、简单、快速；闭管操作，无需电泳，可降低PCR产物污染可能性；实验结果为实 时检测所得动态曲线，较终点检测可靠等。基于以上优点，实时荧光定量PCR技术呈现出取 代常规PCR技术的趋势。
4
SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其 荧光大大增强。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用 荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔解曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚 体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个PCR产 物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I 与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的 假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的 影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreen I得到的定量结果。
本发明首次提供了 Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂盒， 该试剂盒具有如下优点 1)检测时间短，速度快，高通量，可在4-6小时完成96个样品的定量分析。
2)操作过程简单，从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大 大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率。 3)对标本DNA获取的质量要求较低，无论是石蜡组织还是新鲜组织，都能取得理 想的检测结果。 4)荧光定量PCR法结果的判读在阈值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本， 结果判读简单、明确、直观，若需要亦可对结果进行定量分析。 5)检测的灵敏度高，荧光PCR检测技术是综合了 PCR技术、荧光标记技术、激光技 术、数码显像技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。 6)利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔解曲线分析识别特异性产 物和非特异性产物，降低引物二聚体、单链二级结构以及错误扩增引起的非特异性产物的 影响，保证检测结果的准确性。
图1是AZFa、 AZFb、AZFc 3个区域的STS位点模式图； 图2是阳性对照样品Y染色体AZFa亚区sY86位点、Y染色体AZFb亚区sY127位
点、Y染色体AZFc亚区sY255位点的FQ-PCR图； 图3、图4、图5是三名临床正常已育男性样本的FQ-PCR图； 图6、图7、图8是三名待检测男性基因组DNA样本的FQ-PCR图； 图9是pUCm-T-sY86质粒图谱； 图10是pUCm-T-sY127质粒图谱； 图11是pUCm-T-sY255质粒图谱。 附图标号说明S表示样本，P表示阳性对照，N表示阴性对照。
具体实施方式
—、材料
1、仪器 实时荧光定量PCR仪，移液器，离心机。
本发明设计了 3对PCR引物分别特异的扩增AZF STSs序列，引物序列如下所示。 表l引物列表
引物名称序号扩增对象
sY86-F sY86-RSEQIDNO :1 SEQIDNO :2特异性扩增Y染色 体AZFa亚区sY86序列
sY127-F sY127-RSEQIDNO :3 SEQIDNO :4特异性扩增Y染色 体AZFb亚区sY127序列
sY255-F sY255-RSEQIDNO :5 SEQIDNO :6特异性扩增Y染色 体AZFc亚区sY255序列 3、阳性对照重组质粒pUCm-T-sY86、 pUCm-T_sY127和pUCm-T_sY255。
4、试剂 10XPCR buffer、MgCl2、Taq酶、dNTPs、 1000X SYBR Green I荧光染料。
二、方法 1、人类基因组DNA的提取 用蛋白酶K裂解和酚_氯仿抽提法或市售试剂盒从人类抗凝外周血白细胞中提取
基因组DNA，分别提取三名临床正常已育男性基因组DNA、三名待检测男性基因组DNA和一
名女性基因组DNA。 2、荧光定量PCR扩增反应 取PCR反应管，在管壁上做好标记，分别加入荧光定量反应液9. 75ii L(包括 10XPCR Buffer 2. 5 ii L(无Mg2+) 、25mM MgCl2 4iiL、10mM dNTPs0. 5 ii L、 10 ii M上游引物 0. 5 ii L、 10 ii M下游引物0. 5 ii L、 10 X SYBR Green 11. 25 ii L、5U/ ii L酶0. 5 ii L)，已提取的 样本基因组DNA 0. 625 y L(含基因组DNA约25ng)，最后加入无菌水至25 y L反应总体系。 该过程需在冰上操作，每个样品同时做3个PCR扩增进行检测，且每次检测都同时设立一组 阳性对照和一组阴性对照(女性基因组DNA)。 荧光定量反应在ABI 7300检测仪上进行，按以下条件进行扩增
第一阶段95。C 15min ; 第二阶段94。C 30sec， 57°C 45sec (荧光收集)，72°C 30sec， 35个循环;
第三阶段(熔解曲线)95。C 15sec，60。C lmin，95。C 15sec，60。C 15sec。
三、结果判定 读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高 点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。
(1)样品Ct值《30.0，出现典型的扩增曲线，则表示样本Y染色体在该位点没有 微缺失；若无典型的扩增曲线，则表示样本Y染色体在该位点发生了微缺失。
(2)阳性对照Ct值《30. 0，出现典型的扩增曲线，如图2所示。
(3)阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。
从图3、图4、图5可以看出，三名临床正常已育男性样本均扩增出典型阳性扩增曲 线，该三名男性未发生Y染色体的微缺失。 从图6 、图7、图8可以看出，三名待检测男性基因组DNA样本也均扩增出典型阳性
扩增曲线，证实该三名男性也未发生Y染色体微缺失基因。 SEQUENCE LISTING 〈110〉深圳博睿祥晖生物技术有限公司 〈120>Y染色体微缺失基因SYBR Greenl实时荧光定量PCR检测试剂盒 〈130>P10922 〈160>6 <170>PatentIn version 3. 3 〈210〉1 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1 gtgacacaca gactatgctt c 21 〈210>2 〈211>20 <212>DNA <213>人工序列 〈400〉2 acacacagag ggacaaccct 20 〈210>3 〈211>20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>3 ggctc3ca朋cg朋朋g朋3 20 <210>4 〈211〉20 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>4 ctgcaggcag taat朋ggga 20 〈210>5
〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉5gttacaggat tcggcgtgat20〈210>6〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ctcgtcatgt gcagccac18
i兑明 书 6/6页
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权利要求
一种Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY86序列的引物，其碱基序列如SEQID NO1和2所示；Y染色体AZFa亚区sY86位点阳性对照样品用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒作为阳性参考品；特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY127序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO3和4所示；Y染色体AZFb亚区sY127位点阳性对照样品用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒作为阳性参考品；特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY255序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO5和6所示；Y染色体AZFc亚区sY255位点阳性对照样品用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示序列的引物对得到的扩增产物为插入子构建的重组质粒作为阳性参考品。
2. 根据权利要求1所述的Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂 盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括SYBR Greenl荧光染料。
3. 根据权利要求1或2所述的Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测 试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括MgCl2、 dNTPs和PCR反应缓冲液。
4. 根据权利要求3所述的Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂 盒，其特征在于，所述MgCl2反应终浓度为4mM。
5. 根据权利要求3所述的Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂 盒，其特征在于，所述dNTPs反应终浓度为0. 2mM。
6. SYBR Green I实时荧光定量PCR在Y染色体微缺失检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种Y染色体微缺失SYBR Green I实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒利用实时荧光定量PCR可以检测Y染色体AZFa亚区sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127位点，Y染色体AZFc亚区sY255位点的基因缺失，操作方便，检测结果稳定。
文档编号G01N21/64GK101701248SQ20091010634
公开日2010年5月5日 申请日期2009年3月23日 优先权日2009年3月23日
发明者汪朝晖 申请人:深圳博睿祥晖生物技术有限公司