桃褐腐菌抗dmi类杀菌剂的田间检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种田间快速检测桃褐腐菌株对DMI类杀菌剂抗性的引物，包括两对引物，分别为外引物和内引物，其序列分别为：MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC；MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG；MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA；MoBIP:GAGCAGAGTATCCCATTTAAATGTGTGAGGACTCGTTGTT。本发明还提供一种利用上述引物制备的试剂盒、一种上述的试剂盒在检测桃褐腐菌株是否已对DMI类杀菌剂产生抗性中的应用。本发明可以在喷施杀菌剂前有效预测杀菌剂是否能有效防治桃褐腐病菌的发生，从而防止对已产生了抗性的病菌持续喷药而导致的防治失败。
【专利说明】桃褐腐菌抗DMI类杀菌剂的田间检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物病原菌抗药性检测【技术领域】，具体的是指一种桃褐腐菌抗Dffl类 杀菌剂的田间检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 桃褐腐病是由子囊菌链核盘菌（Monilinia SPP.)引起的严重危害桃生产的重要 病害，除危害普通桃，该病还危害油桃、樓桃、杏、李等核果类果树，其中一些种甚至还危害 苹果、梨等仁果类果树。褐腐病遍布全球，其中W美国，亚洲、欧洲部分国家危害最为严重， 在采前及采后均能造成严重经济损失。
[0003] 目前使用杀菌剂在是控制该病的主要手段。生产上常用酱醇脱甲基化酶抑制剂类 值Mis)杀菌剂来防治桃褐腐病菌，经过二十多年的使用，美国佐治亚州，南卡罗来纳州，纽 约州及俄亥俄州都陆续出现了 DMIs抗性菌株，导致不少果园出现防治失败的现象，造成较 大经济损失。
[0004] 对抗性菌株进行分子研究发现，抗性菌株的MfCYP51基因的上游调控区都存在一 个65碱基对的插入片断'Mona'，是造成菌株产生抗性的原因。
[0005] 若在喷药前就能明确田间是否已产生了抗性菌株，就可W准确制定杀菌剂喷施计 划。目前比较常用的检测方法包括两种，即W菌丝生长抑制为基础的传统的菌落直径法和 基于目标基因的PCR技术。传统的菌落直径法需要采集田间菌株，进行单抱分离，然后在 添加一系列浓度的农药培养基上进行培养，检测农药对菌丝生长的效应，根据EC。。（抑制中 浓度）或MIC (最低抑制浓度）鉴别抗药性，根据Luo和Schn油el的鉴别浓度标准，即W 0. 3mg/L作为区分DMI类杀菌剂抗性和敏感菌株的标准。抗性菌株的MfCYP51基因的上游 调控区65bp的Mona片段的插入是田间大多数病原真菌对Dffl类杀菌剂产生抗药性的原 因。在此基础上设计相应引物，通过扩增片段长度或者测序结果可W对桃褐腐菌株的抗药 性进行定性检测（Luo, C.X. , Cox, K.D., Amiri, A., and Schn油el, G. 2008. Occurrence and detection of the DMI resistance-associated genetic element'Mona'in Monilinia fructicola. Plant Disease92:1099-1103.)。
[0006] 传统的菌丝对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数 量有限，要求严格的无菌操作，难W在早期就发现抗药性菌株的存在。基于PCR技术的检测 方法，所需仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高，不适合在田间或者地市县等农业部 口推广。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于克服现有技术检测周期长，工作 量大，需要无菌条件，及PCR技术对仪器和人员技术要求高的缺陷，提供一种基于分子水平 方便、灵敏、结果判断直观且可在田间操作的桃褐腐抗药性检测方法，可W保证基层技术员 在田间，两小时内获得客观、可靠的检测结果。
[000引本发明的第二个目的是研制与上述目的配套使用的试剂盒，使地市县等基层农业 部口的技术人员实时掌握本地、当年桃褐腐菌株的抗药性情况，做好病害预防及化学防治 工作。
[0009] 本发明提供了一种桃褐腐菌抗DMI类杀菌剂的田间检测试剂盒，它是在田间快速 检测桃褐腐菌株是否已对酱醇脱甲基化酶抑制剂类值Mis)杀菌剂产生抗性的试剂盒，可 在两小时内从菌丝中快速、简便、准确、灵敏的检测出抗Dffl类杀菌剂的桃褐腐菌。
[0010] 为实现上述目的，本发明所提供的桃褐腐菌抗DMI类杀菌剂的田间检测的引物， 其特征在于；包括两对引物，分别为外引物和内引物，其序列分别为：
[0011] 外引物：
[0012] MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC ;
[0013] MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG ;
[0014] 内引物；
[00巧]MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA ;
[0016] MoBIP:GAGCAGAGTATCCCATTTAAATGTGTGAGGACTCGTTGTT 〇
[0017] 本发明还提供一种上述引物制备的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括： lOXIliermopol Buffer、BstDNA 聚合酶、dNTP(MixUire)、MgCl2溶液、外引物 MoF 和 MoB、内 引物 MoFIP 和 MoBIP。
[001引进一步地，所述试剂盒还包括LyseGo裂解液（Thermo Scientific公司）和SYBR Green I 染料。
[0019] 本发明还提供一种上述试剂盒在检测桃褐腐菌株是否已对Dffl类杀菌剂产生抗 性中的应用。
[0020] 进一步地，上述试剂盒的应用，它包括如下步骤：
[0021] (1)挑取少量菌丝于lOuL Lyso Go裂解液中，100°C 5min ;
[0022] 似按照反应体系配制溶液，所述反应体系（2加^包括；10 X化ermopol Buffer2. 5uL, dNTPs (lOmmol/L) 3uL, (25mmol/L) 5. OuL, MoF (lOumol/L) 0. 3uL, MoB(10umol/L)0. 3uL，MoFIP(10umol/L)3.加L，MoBIP(10umol/L)3.加L，DM 模板 5. 9uL， Bst DM聚合酶巧U/uL) luL ;所述DM模板为挑取了菌丝的Lyso Go裂解液；ere 75min， 85°C lOmin ；
[002引 做在所得扩增产物中加入luL SYBR Green I染料，观察颜色反应，得出结果。
[0024] 本发明的试剂盒能在喷施杀菌剂前就可W准确预测出田间是否已产生了 DMI类 杀菌剂抗性菌株，该试剂盒可W在一个半小时内，在不需要贵重繁琐的实验室仪器的条件 下，通过清晰的颜色反应指示出是否存在抗性菌株，对制定科学的病菌治理策略，保证桃产 业的健康发展具有重要意义。
[0025] 本发明克服传统技术中桃褐腐菌对Dffl类杀菌剂的敏感性测定方法耗时，工作量 大，测定样本数量有限，要求严格的无菌操作，难W在早期发现抗药性菌株的存在的问题。 同时也克服了基于PCR技术的检测方法，所需仪器价格昂贵，对操作人员技术要求高，难W 在基层农业部口及田间开展的问题。能在田间，快速，准确检测大量样本，检测准确率达到 95% W上，对制定科学的病菌治理策略，保证桃产业的健康发展具有重要意义。
[0026] 本发明桃褐腐菌抗Dffl类杀菌剂的田间检测试剂盒和现有其他技术相比，具有如 下优点和积极效果：
[0027] 1、本发明在已知桃褐腐菌抗DMI类杀菌剂分子机理的研究基础上，根据65bp碱基 对的插入，应用环介导恒温扩增技术，使检测桃褐腐菌对Dffl类杀菌剂的抗药性不需要昂 贵的PCR仪器，在田间条件下就能快速、准确检测大量样本，使在喷施杀菌剂前快速检测田 间病原菌是否已经产生抗药性成为可能。
[002引 2、本发明提供可W特异性和桃褐腐菌对Dffl杀菌剂抗性产生的65bp插入片段相 结合的四对环化引物，及其高效准确便捷的检测试剂盒及扩增条件。应用该试剂盒可在两 小时内从菌丝中快速、简便、准确、灵敏的检测出抗Dffl类杀菌剂的桃褐腐菌，灵敏度高的 基因组DNA，检测速度比传统的检测方法-菌落直径法相比更快速，比普通分子检测；分离 纯化样本，提取DNA，PCR扩增，更简单、高效。
[0029] 3、步骤简单易操作，不需要PCR仪等实验室高级仪器，该对于基层植保站和田间 操作的工作有重要意义。使用特异性引物和环介导恒温扩增反应，可W达到很高的准确率 和灵敏度，可W在2h内完成对田间样本的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1是LAMP特异性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP对41个桃褐腐菌株DNA的扩增结 果电泳图谱。
[003U 其中；M 代表 Marker, 1-22 依次代表抗性菌株 D-7、D-1、Dmap3-08、Bmpc5、DR1、 DR2、DR3、DR4、D贴、DR6、DR7、DR8、DR9、DRIO、DRll、DR12、DR13、DR14、DR15、DR16、DR17、 DR18, 23-41 依次代表敏感菌株 CPk6-l、HWLlO-lb、CPk3-l、ZM09-2a、YHCl 1-1、YHCl 1-2、 Y肥 11-3、Y肥 11-4、Y肥 11-5、Y肥 11-6、服la、服2a、服6a、服5a、服7a、服8a、服9a、GTCla、 GTC2a，42 W灭菌蒸馈水为对照。
[003引图2是桃褐腐DMI抗性和敏感菌株菌丝的LAMP产物电泳结果。
[003引 其中；M代表Marker,选用的抗性菌株依次为D-7、D-l、Dmap3-08、Bmpc5、DRl、DR2、 DR3、DR4、D贴、DR6,选用的敏感菌株依次为 CPk6-l、HWL10-化、CPk3-l、ZM09-2a、YHCll-l、 YHC11-2、服la、服2a、GTCla、GTC2a。
[0034] 图3是加染料后的LAMP扩增产物。
[0035] 其中；抗性菌株为D-7,敏感菌株为CPk3-l。
【具体实施方式】
[0036] W下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0037] 桃褐腐菌抗DMI类杀菌剂的机理是在该杀菌剂的祀标基因MfCYP51基因的上游 调控区存在一个65碱基对的插入片断'Mona'。扩增上述MfCYP51基因的上游调控区， 检测是否存在65碱基对的插入，根据环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DM, LAMP)设计特异性引物，使扩增反应可W在恒温条件下进行，不需 要室内PCR仪等昂贵设备，其引物序列如下；
[00測外引物；
[0039] MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC
[0040] MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG
[0041] 内引物；
[0042] MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA
[0043] MoBIP:GAGCAGAGTATCCCATTTAAATGTGTGAGGACTCGTTGTT
[0044] 检测是否有上述65bp碱基对插入的检测试剂盒（400次），含有；
[0045] 1) 10ml 10 XHiermopol Buffer
[0046] 2) 20ml25mM 的 MgCla溶液
[0047] 扣 12mll0mM 的 dNTP (Mix1:ure)
[0048] 4) 1. 2mll0uM 的外引物 MoF 和 MoB
[0049] 5) HmllOuM 的内引物 MoFIP 和 MoBIP
[0050] 6) 3200U 巧U/ul) Bst DM 聚合酶
[0化1] 7) 1ml 10000巧YBR Green I
[0052] 8) 5ml Lyse Go 裂解液（Thermo Scientific 公司）
[0053] 本发明一个反应体系（2加1)，内含；
[0化4] 10 XHiermopol Buffer 2.加L
[005引 dNTPs(lOmmol/L) 3uL
[0化6] Mg2+(25mmol/L) 5. OuL
[0057] MoF (lOumol/L) 0. 3uL
[005引 MoB(10umol/L) 0. 3uL
[0化9] MoFIP (lOumol/L) 3.加L
[0060] MoBIP (lOumol/L) 3.加L
[006U DM 模板 5.9
[0062] BstDNA 聚合酶巧U/uL) luL
[0063] 在本发明中，首先挑取少许菌丝，加入lOul lyse go试剂（Thermo Scientific公 司），100°C下裂解5分钟。吸取5. 9ul该裂解液加入含有buffer, dNTP，Mg"，四条特异性 环化引物，DM Bst I聚合酶的混合体系中，ere下等温扩增75分钟，85°C 10分钟。
[0064] 扩增完成后，加入lullOOOO巧YBR Green I染料，观察颜色反应。若产生了大量 扩增产物，则加入SYBR Green I染料会形成肉眼清晰可分辨的巧光绿色，若未产生扩增产 物，则加入SYBR Green I染料后不变色，仍然为褐色。加入染料后，产生绿色巧光的是抗性 菌株，颜色为红褐色的为敏感菌株（如图3所示）。
[00化]若为抗性菌株，加入染料W后呈巧光绿色，表明不可W再使用DMI类杀菌剂进行 防治。若不为抗性菌株，加入染料后呈褐色，表明可W使用Dffl类杀菌剂进行防治。
[0066] 实施例一；
[0067] 桃褐腐菌株（M. fructicola)的环化特异性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP的环介导 恒温扩增：
[0068] 从美国南卡莱罗纳州采集桃褐腐菌株，室内常规单抱分离，获得Dffl抗性菌株 22株，从中国湖北、云南、甘肃采集分离到Dffl敏感菌株19株。据罗等报道（文献），根 据DMI杀菌剂祀标基因MfCYP51上游区域设计引物化CYP-1F:AGAGCTACCACCCACGAGGAA和 化CYP-1R:GACCGCTGCGAAATCTCTTGA分别扩增DMI抗性和敏感菌株，测序发现，所有DMI抗 性菌株在MfCYP51上游区域含有65bpMona片段插入，而所有的DMI敏感菌株均不含有该插 入。
[0069] 根据该65bp序列和其上下游序列，利用LAMP引物设计的在线网站化ttp: // primerexplorer.化/e/)设计了环化特异性引物；
[0070] 外引物；
[0071] MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC
[0072] MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG
[007引 内引物：
[0074] MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA [00 巧]MoBIP: GAGCAGAGTATCCCATTTMATGTGTGAGGACTCGTTGTT
[0076] 使用本发明中的试剂盒配方，分别用环化特异性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP，W 上述41株桃褐腐菌株的基因组DM为模板，并W灭菌蒸馈水为对照进行PCR扩增。25ul 反应体系中含：① 2.加llOXHiermopolBuffer 缓冲液② 3. 0uLdNTPs(Mix1:ure) (lOmmol/ L)⑨ 5. 0uLMgCl2(25mmol/L)④外引物；MoF 和 MoB(10umol/L)各 0. 3uL⑥内引物；MoFIP 和 MoBIP(10umol/L)各 3. 5uL ⑧ DNA 模板 luL ⑦ BstDNA 聚合酶巧U/uL) luL ⑨ 4. 9uLd地2〇。 LAMP 扩增反应条件；61°C 75min，85°C lOmin.
[0077] DMI抗性菌株通过环化特异性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP得到相应扩增产物，而 敏感菌株及水对照则无相应扩增产物（图1)。
[0078] 由图1可知，检测的42个样本中，1?22是DMI抗性菌株，23?41是DMI敏感菌 株，42为dd&O对照。检测准确度达100 %。
[0079] 实施例二；
[0080] 桃褐腐菌株（M.化ucticola)菌丝直接用环化特异性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP 扩增：
[0081] 2011年从美国南卡莱罗纳州采集回来的桃褐腐菌株，挑取其菌丝直接用于抗药性 检测；挑取少量菌丝置于PCR离屯、管中，加入lOuL Lyse G〇，100°C水中加热5min后，常温 放置冷却。取5. 9uL液体作为模板，用环化特异性引物MoF/MoB/MoFIP/MoBIP对其进行扩 增。使用本发明中的试剂盒配方，25uL反应体系中含①2.加110X化ermopol Buffer缓 冲液② 3. OuL dNTPs(MixUire) (lOmmol/L)⑨ 5. OuL MgCl2(25mmol/L)④外引物；MoF 和 MoB(10umol/L)各 0. 3uL ⑥内引物；MoFIP 和 MoBIP(10umol/L)各 3. 5uL ⑧ Bst DM 聚合酶 巧U/uL) luL⑦5. 9uL裂解液（约5n曲NA)为模板。扩增条件；erC 75min，85°C lOmin. [008引结果见图2,说明直接用菌丝扩增，抗性菌株值-7, D-1，Dmap3-08, Bmpc5, DRl， DR2, DR3, DR4, D贴，DR6)可W得到相应的扩增产物，而敏感菌株（CPk6-l、HWL10-化、 〔口心3-1、2]?09-23、￥肥11-1、￥肥11-2、服13、服23、61'(：13、6^23)无法得到相应的扩增菌株。 该种方法和提取菌丝基因组DNA相比，准确率相同都达到100%，且时间短，只需不到化，且 不需要昂贵的实验室仪器。
[0083] 实施例对环化扩增产物进行染色反应
[0084] SYBRGreen I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染 料。在游离状态下，SYBRGreen I发出微弱的巧光，但一旦与双链DNA结合后，巧光大大增 强。利用该特征，若扩增产生大量双链，在加入该染料后，会产生肉眼可W清晰分辨的绿色 巧光，而若未产生扩增产物，加入该染料后，不会有颜色变化而呈现红褐色。结果见图3,抗 性菌株扩增染色后可产生绿色巧光，而敏感菌株扩增染色后为红褐色。
[0085] 本发明试剂盒的检测原理；Thermo Scientific公司的Lyse Go试剂可W在高温 下2分钟内释放出菌丝中的DM,从而使从分子水平上检测菌株抗药性成为可能。抗性菌株 的MfCYP51基因的上游调控区65bp的Mona片段的插入是田间大多数病原真菌对DMI类杀 菌剂产生抗药性的原因。在此基础上设计相应引物，利用环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术快速扩增抗性菌株才特有的Mona片段。LAMP技术 原理是依据检测祀基因的6个特异性区域设计4条特异引物，在60°C?65°C恒温环境下， 利用链置换DNA聚合酶60?80min内即能完成检测工作，不需要模板的热变性、温度循环 等步骤，即可形成大量扩增产物巧?10]。扩增结束后，加入SYBR Green I染料，该染料 可W结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域，并产生绿色激发波长。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的巧光，但一旦与双链DM结合后，巧光大大增强。在本实验所形成的大量扩增 产物中加入该染料，可W产生肉眼能清晰辨认的绿色巧光。若加入染料后产生绿色巧光，说 明是Dffl抗性菌株，若未产生绿色巧光而呈染料本身的红褐色，则为敏感菌株。
【权利要求】
1. 一种桃褐腐菌抗DMI类杀菌剂的田间检测的引物，其特征在于：包括两对引物，分别 为外引物和内引物，其序列分别为： 外引物： MoF:TTTAAGGTACGAACACGAATC； MoB:TCGATGTAGGTGATGGAAG； 内引物： MoFIP:TGTAAAAAGTATCTCTTCAATACCTTTCAAATCTAAACTACGGTA； MoBIP:GAGCAGAGTATCCCATTTAAATGTGTGAGGACTCGTTGTT〇
2. 利用权利要求1所述引物制备的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括： lOXThermopolBuffer，BstDNA聚合酶，dNTP(Mixture)，1\%012溶液，外引物MoF和MoB， 内引物MoFIP和MoBIP。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括LyseGo裂解液和 SYBRGreenI染料。
4. 一种根据权利要求2所述的试剂盒在检测桃褐腐菌株是否已对DMI类杀菌剂产生抗 性中的应用。
5. 根据权利要求4所述试剂盒的应用，其特征在于：它包括如下步骤： (1) 挑取少量菌丝于lOuLLysoGo裂解液中，100°C5min; (2) 按照反应体系配制溶液，所述反应体系（25ul)包括：10XThermopol Buffer2. 5uL,dNTPs(10mmol/L) 3uL,Mg2+(25mmol/L) 5.OuL,MoF(lOumol/L) 0. 3uL, MoB(10umol/L)0. 3uL，MoFIP(10umol/L)3. 5uL，MoBIP(10umol/L)3. 5uL，DNA模板 5. 9uL， BstDNA聚合酶（8U/uL)luL;所述DNA模板为LysoGo裂解液；61°C75min，85°ClOmin; ⑶在所得扩增产物中加入luLSYBRGreenI染料，观察颜色反应，得出结果。
【文档编号】C12N15/11GK104513853SQ201410314219
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】罗朝喜, 陈淑宁, 林杨, 阴伟晓 申请人:华中农业大学