专利名称：：一种大豆内生细菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物内生细菌。
背景技术：
：大豆广泛分布于我国的东北和华北的很多地区，尤其是黑龙江的主要粮食作物和油料作物，由腐霉菌、镰刀菌和立枯丝核菌引起的根腐病及由孢囊线虫引起的虫害常年发生，发病率在30%左右，每年减产10%以上，明显影响大豆的产量和品质，成为大豆种植上的主要问题。目前采用化学农药和化学种衣剂防治大豆病虫害，容易诱发病原菌或病虫的抗药性、造成农药残留污染及伤害非靶标生物。
发明内容本发明的目的是为了解决目前采用化学农药和化学种衣剂防治大豆病虫害，而诱发病原菌或病虫的抗药性、造成农药残留污染及伤害非靶标生物的问题，而提供的一种大豆内生细菌。大豆内生细菌SB-37为枯草芽孢杆菌(^acz7/wwto7z》，属于芽孢杆菌属(^ac/〃i^);保藏于CGMCC，保藏日期为2008年10月27日，保藏号为CGMCCNo.2726;为革兰氏阳性菌，杆状，长为1.52pm，宽为0.51)im，有芽孢；菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。将本发明的大豆内生细菌SB-37接种于pH值为6.08.0的营养肉汤培养基中，在204(TC条件下富集培养至菌落浓度达2040亿/毫升。本发明的大豆内生细菌SB-37在大豆植株体内定殖，或用该细菌液浸泡种子均有防病和促生长作用。使用本发明的大豆内生细菌SB-37生产的生物农药，对大豆的根腐病和大豆菌核病的防治达60%80%;对大豆有明显的促生长作用，可促进植株根和茎生长，增加植株的鲜重和干重5%20%;对人畜无毒无害，对环境不造成污染，不会伤害非靶标生物；大豆果实中无农药残留；不会诱发病原菌或病虫的抗药性；在农业生产中的广泛应用，能产生巨大的经济效益。大豆内生细菌SB-37为枯草芽孢杆菌，属于芽孢杆菌属；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年10月27日，保藏号为CGMCCNo.2726。具体实施方式'具体实施方式一本实施方式大豆内生细菌SB-37为枯草芽孢杆菌，属于芽孢杆菌属；保藏于CGMCC，保藏日期为2008年10月27日，保藏号为CGMCCNo.2726;为革兰氏阳性菌，杆状，长为1.52jam，宽为0.5ljim，有芽孢；菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。本实施方式大豆内生细菌SB-37是从大豆的根中分离得到的。其分离方法如下一、将大豆植株用水冲洗干净，随机称取根1.0g作为供试材料，用70%酒精和0.1°/。升汞对供试材料表面消毒，杀灭供试材料表面微生物；二、在无菌环境中，供试材料用无菌水冲洗3次，取100)il最后l次无菌水冲洗液涂布接种于NTOA培养基上，每个处理重复3次。培养48h，观察有无菌落产生。据此验证此消毒方法是否能全部杀死供试材表面微生物，晾干后转入无菌研钵中研磨碾碎；三、向供试材料分别加10ml无菌水匀浆，静止15min后，各取100^d涂于固体培养基上，30。C暗室培养48h;四、挑取单菌落，在NYDA固体培养基上反复划线纯化，直至得到纯系菌株为止；五、将纯系菌株接种于NYD液体培养基中，37"C恒温箱中培养1820h，取菌液70(^1加入50%甘油300^11，混合后，置于一7(TC冰箱中冷冻保存。NYDA固体培养基含有下列成份酵母膏0.5%，牛肉膏0.8%，葡萄糖1%，琼脂粉1.5%。NYD液体培养基含有下列成份酵母膏0.5%，牛肉膏0.8，葡萄糖1%。本实施方式大豆内生细菌SB-37在温度为2040°C、pH值为6.08.0的环境中生长。本实施方式大豆内生细菌SB-37具有运动性。本实施方式大豆内生细菌SB-37无可溶性色素、甘露醇发酵为阳性、葡萄糖发酵为阳性、形成芽孢试验为阳性、阿拉伯糖发酵为阳性、形成伴胞晶体试验为阴性、淀粉水解试验为阳性、V-P试验为阳性、接触酶试验为阳性、质量浓度7%的NaCl耐盐性试验为阳性、利用柠檬酸盐试验为阳性、氧化酶试验为阳性、硝酸盐还原试验为阳性、厌氧生长试验为阳性、明胶液化试验为阳性、分解酪素试验为阳性、M-R试验为阳性、产酸试验为阳性、酪氨酸水解试验为阴性。将本实施方式的大豆内生细菌SB-37接种于pH值为6.08.0的营养肉汤培养基中，在204(TC条件下富集培养至菌落浓度达3xl0^fb/mL。本实施方式的大豆内生细菌SB-37在大豆植株体内定殖，或用该细菌液浸泡处理种子均有防病和促生长作用。本实施方式的大豆内生细菌SB-37用于制备生物农药，其方法为一、菌种活化取-70。C甘油保存的Sb37菌液一环划线于NYDA固体培养基上，在温度为37'C恒温箱中培养1820h，然后挑取单菌落接种于5ml的NYD液体培养基中，在温度为37"C环境中，频率为150r/min条件下振荡培养1820h;二、菌种培养分别取0.1mlSb37菌液均匀涂布于装NYDA培养基的茄瓶上，共涂布6个茄瓶，在温度为37"C恒温箱中培养1820h备用，用时用无菌水冲洗；三、在1吨发酵罐内发酵发酵罐内NYD液体培养基量为700750L，Sb37接种量为发酵罐内NYD液体培养基体积的0.5%，接种后控制发酵温度在37士0.5。C，发酵时间3048h，搅拌速度为150r/min，发酵罐内气压为0.5个大气压，发酵开始时通气量为0.8VVM，发酵开始7h后至发酵结束通气量为1VVM，得到菌浓度达2040亿/毫升的菌液，即为含有大豆内生细菌SB-37的生物农药。本实施方式的生物农药中含有的大豆内生细菌SB-37定殖于植物体内，不易受外界环境的影响，可长期持续作用，而且该内生细菌具有防病、促生等生物功能，具有良好开发利用前景，尤其是对化学药剂难以发挥作用的植物土传病害、维管束病害和系统性病害的防治更显示其独特的优势。本实施方式的生物农药加水稀释100倍用于大豆浸种或灌根。大豆内生细菌SB-37防病促生长实验1、供试病原菌剂尖孢镰刀菌和菌核病病原菌，在麦粒培养基上培养，待菌丝长满后，磨碎待用。2、供试药剂生物种衣剂为本实施方式的生物农药；化学种衣剂选市场上销售的豆福种衣剂。53、供试作物大豆，品种合丰294、方法4.1大豆种子筛选筛选均匀饱满的大豆种子，用做本项实验。4.2接种病原菌制备将磨碎的病原菌用细沙按1:5比例稀释后使用，除空白对照组每盆均匀撒上一层病菌后放上大豆种子，再撒一层土覆盖。4.3实验设计共做10个样品类型，每个样品类型10盆，每盆4粒大豆种子，采用随机分组排列方法放置在温室内，40d后调査结果。样品类型l:空白对照组，直接播种大豆种子，不接种病原菌。病原菌对照，直接播种大豆种子，接种尖孢镰刀菌。化学药剂对照，播种用豆福种衣剂包衣的大豆种子，接种尖样品类型2:样品类型3:孢镰刀菌。样品类型4:样品类型5:样品类型6:样品类型7:播种生物农药浸泡过的大豆种子，接种尖孢镰刀菌。病原菌对照，直接播种大豆种子，接种菌核菌。播种生物农药浸泡过的大豆种子，接种菌核菌。化学药剂对照，播种用豆福种衣剂包衣的大豆种子，接种菌核菌。5、实验结果表1为生物农药温室防效实验结果，表2为生物农药对大豆苗期生长情况的影响结果(实验结果为IO盆的平均值)。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表1可见，本实施方式的生物农药对大豆的根腐病和大豆菌核病的防治达60%80%;由表2可见，用本实施方式的生物农药作为种衣剂处理组在根长、茎高、根瘤数和苗干重指标上均比空白对照和化学药剂对照组好，经统计学分析，4项指标与空白对照组相比均达显著水平，与化学药剂组相比，仅在根瘤数指标上达显著水平，因此生物农药可以有效防病和促进大豆的生长。权利要求1、一种大豆内生细菌，其特征在于大豆内生细菌SB-37为枯草芽孢杆菌，属于芽孢杆菌属；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年10月27日，保藏号为CGMCCNo.2726；为革兰氏阳性菌，杆状，长为1.5～2μm，宽为0.5～1μm，有芽孢；菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。2、根据权利要求1所述的一种大豆内生细菌，其特征在于大豆内生细菌SB-37在温度为2040°C、pH值为6.08.0的环境中生长。全文摘要一种大豆内生细菌，它涉及一种植物内生细菌。它解决了目前采用化学农药和化学种衣剂防治大豆病虫害，而诱发病原菌或病虫的抗药性、造成农药残留污染及伤害非靶标生物的问题。大豆内生细菌SB-37为枯草芽孢杆菌，属于芽孢杆菌属；保藏于CGMCC，保藏日期为2008年10月27日，保藏号为CGMCCNo.2726；为革兰氏阳性菌，杆状，长为1.5～2μm，宽为0.5～1μm，有芽孢；菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。本发明的大豆内生细菌SB-37对大豆植株有防病和促生长作用，对大豆的根腐病和大豆菌核病的防治达60％～80％；该菌是从大豆根部组织中分离获得的，无毒、无害。文档编号A01N63/02GK101508964SQ20081020970公开日2009年8月19日申请日期2008年12月15日优先权日2008年12月15日发明者孟利强,张云湖,张先成,张淑梅,晶李,王玉霞,赵晓宇申请人:黑龙江省科学院微生物研究所