专利名称：大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及大豆生育期el-as基因及其编码蛋白。
背景技术：
El基因位于着丝点附近，自Bernard (1971)年报道以来，人们一直没有克隆出其功能基因。由于该基因位于近着丝点(pericentromeric region),遗传重组率较低,不利于采用图位克隆法克隆出该基因，在发明专利名称一种大豆生育期El基因及其编码蛋白，专利申请号为201210112662.9中，公布出El基因序列及其相应的蛋白序列后，证明大豆生育期El基因具有强烈抑制大豆开花的生理功能。其蛋白质序列虽然并不能鉴定出B3结构域，但是与B3结构域基因具有远缘的关系。B3结构域基因是一类较为保守的植物特有的转录因子，一般只有100-120氨基酸，常与其他结构域共同起作用。B3结构域中含有与DNA相结合的特殊位点，一般与DNA分子的大沟起作用。在含有B3结构域的蛋白质对抗逆性反应、植物的生长与发育等诸多方面起重要作用。同时，El基因具有一个核定位信号，其特征为亲核蛋白一般都含有的能保证整个蛋白质能够通过核孔复合体被运到细胞核内的特殊的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品种中，其El基因的突变如何影响着大豆生育期(开花期及成熟期)是一个非常重要的科学问题，目前还没有在分子水平上的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供大豆生育期el-as基因及其编码蛋白。本发明的大ii生育期el-as基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所不。本发明的大豆生育期el-as基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本发明的大豆生育期el-as基因是大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)的突变型基因。本发明的有益效果本发明是在克隆出大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的基础上，进一步对El基因序列进行深入系统的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表一类新型的基因家族，我们已证实El基因可以代表着El位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本发明对不同品种及近等基因系中El基因序列进行了研究，并确定了 el-as基因，其对大豆生育期关系密切。el-as基因与大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)相比，两者的序列在DNA水平的仅有一个核苷酸(44号)差异，该核苷酸对核定位信号有很大的影响，el-as基因在氨基酸序列15从精氨酸到苏氨酸的错义突变，该区域为核定位信号的第一个结构域(氨基酸序列13 16上的KKRK)上(见序列表Seq ID No :1)。
el-as基因与大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)相比，本发明的el-as基因在关键的核定位信号上有一个碱基差异，并改变了原来El基因的功能，使其抑制大豆开花的功能明显减弱(见发明专利申请号201210112662. 9公开内容)，因此本发明的el-as基因较大豆生育期El基因具有促进大豆开花的功能，即抑制开花不彻底，具有该功能的基因被称为渗漏(leaky)基因型，即该基因型尚有部分抑制开花功能，并非功能全失。本发明的el-as基因具有对大豆光周期的不敏感性，使具有该基因的品种能在长日照条件下，开花期较为适中的特点，是我国大豆甚至世界大豆品种栽培中最为重要的一类基因，比如在Harosoy、William82及我国的合丰55等都为el_as基因型。
图lel-as基因酶切后电泳结果图片,其中I号为中黄13,2号为合丰55,3号为淮ii4 号，4 号为徐 14,5 号为 Harosoy-El, 6 号为 Sakamotowase, 7 号为中黄 39 ;M 为 DNA 分子量标准样品(0X174 -HaeIII)；图2为GFP未融合el-as基因的瞬时表达载体结构不意图；图3为GFP融合el-as基因的瞬时表达载体结构示意图；图4为GFP未融合el-as基因的激光共聚焦显微镜GFP通道下的亚细胞定位影像图；图5为GFP未融合el-as基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；图6为GFP未融合el-as基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定影像位图； 图7为GFP未融合el-as基因的激光共聚焦显微镜GFP通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图；图8为GFP融合el-as基因的激光共聚焦显微镜GFP通道下的亚细胞定位影像图；图9为GFP融合el-as基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；图10为GFP融合el-as基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定位影像图；图11为GFP融合el-as基因的激光共聚焦显微镜GFP通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图；图12 :大豆品种Harosoy在长日照16小时光照/8小时黑暗条件下，出苗后55天照片，其中，箭头所指的是已开放的大豆花朵；图13具大豆生育期El基因的大豆品种Harosoy-El在长日照16小时光照/8小时黑暗条件下，出苗后55天的照片。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的大豆生育期el-as基因的突变基因序列如序列表Seq ID No 1 所示。本实施方式是在克隆出大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的基础上，进一步对El基因序列进行深入系统的研究。由于在大中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表一类新型的基因家族，我们已证实EI基因可以代表着EI位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中El基因序列进行了研究，并确定了 el-as基因，其对大豆生育期关系密切。el-as基因与大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)相比，两者的序列在DNA水平的仅有一个核苷酸(44号)差异，该核苷酸对核定位信号有很大的影响，在氨基酸序列15从精氨酸到苏氨酸的错义突变，该区域为核定位信号的第一个结构域(氨基酸序列13 16上的KKRK)上(见序列表Seq ID No :1)。el-as基因与大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)相比，本实施方式的el-as基因在关键的核定位信号上有一个碱基差异，并影响改变了原来El基因的 功能，使其抑制大豆开花的功能明显减弱(见发明专利申请号201210112662. 9公开内容)，因此本实施方式的el-as基因较大豆生育期El基因具有促进大豆开花的功能，即抑制开花不彻底，具有该功能的基因被称为渗漏(leaky)基因型，即该基因型尚有部分抑制开花功能，并非功能全失。本实施方式的el-as基因具有对大豆光周期的不敏感性，使具有该基因的品种能在长日照条件下，开花期较为适中的特点，是我国大豆甚至世界大豆品种栽培中最为重要的一类基因，比如在Harosoy、William82及我国的合丰55等都为el_as基因型。
具体实施方式
二 本实施方式的大豆生育期el-as基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No :2所示。本实施方式是在克隆出大豆生育期基因El (发明专利申请号201210112662. 9)的基础上，进一步对El基因序列进行深入系统的研究。由于在大中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表一类新型的基因家族，我们已证实EI基因可以代表着EI位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中El基因序列进行了研究，并确定了 el-as基因，其对大豆生育期关系密切。el-as基因与大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)相比，两者的序列在DNA水平的仅有一个核苷酸(44号)差异，该核苷酸对核定位信号有很大的影响，在氨基酸序列15从精氨酸到苏氨酸的错义突变，该区域为核定位信号的第一个结构域(氨基酸序列13 16上的KKRK)上(见序列表Seq ID No :1)。el-as基因与大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)相比，本实施方式的el-as基因在关键的核定位信号上有一个碱基差异，并影响改变了原来El基因的功能，使其抑制大豆开花的功能明显减弱(见发明专利申请号201210112662. 9公开内容)，因此本实施方式的el-as基因较大豆生育期El基因具有促进大豆开花的功能，即抑制开花不彻底，具有该功能的基因被称为渗漏(leaky)基因型，即该基因型尚有部分抑制开花功能，并非功能全失。本实施方式的el-as基因具有对大豆光周期的不敏感性，使具有该基因的品种能在长日照条件下，开花期较为适中的特点，是我国大豆甚至世界大豆品种栽培中最为重要的一类基因，比如在Harosoy、William82及我国的合丰55等都为el_as基因型。通过以下试验验证本发明的效果(I)基因el-as序列的获得—、取长至三叶真叶期的待测大豆Harosoy品种的叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA ;以提取的DNA为模板通过Kl与K2引物，采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTARHS扩增El基因，PCR反应条件如下94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，共30循环，再72°C延伸7min，将PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序。测序结果表明大豆生育期el-as基因具有序列表中Seq ID No 1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No 1由525个碱基组成，并编码具有序列表中Seq ID No 2的氨基酸序列的蛋白质。(2) el-as基因的鉴定大豆El基因中el-as基因的鉴定方法一、取长至三叶真叶期的待测品种叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA ;二、以步骤一提取的基因组DNA为模板，Fl和F2为引物，采用购买自Takara公司的ExTaq酶进行扩增，PCR反应条件如下95°C预变性3min ；95°C变性20s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共32个循环，再72°C延伸7min ;三、取经步骤二PCR的产物8iU(浓度为300ng/iil)，稀释I倍后，经TaqI限制性内切酶(Takara公司)，在65° C温度下，消化3h ;四、然后将步骤三酶切后的产物，采用13%非变性PAGE胶电泳进行检测；其中，步骤一所述的待测品种为中黄13，合丰55，淮豆4号，徐豆14，Harosoy-El, Sakamotowase 和中黄 39。电泳结果如图I所示，由图I可知，图I中1、3、4、5、6和7品种仅出现A号带，即没有被TaqI消化的一条带(444bp)为大豆生育期El基因；而2号合丰55品种出现二条带型(图I中B与C所示)，即为可以被TaqI消化成二条带(414bp与31bp)的为el_as基因。(3) El基因el-as基因的功能分析一、在 2004 年，将大豆的两个近等位基因系 Harosoy-El (L68-694, Ele2E3E4e5, PI547707)和Harosoy-el (L58-266, ele2E3E4e5, PI 547676)进行杂交；二、对杂交后的 13761个F2:5代大豆群体通过图位克隆法对el-as基因进行筛查，筛选出10个重组体，并采用弓I物Cl、C2与Dl、D2对获得的10个重组体自交后代进行鉴定。自交后代开花期的分离情况如表I所示，表I中开花期为品种出苗至开花(第一朵花开放)的天数，el-as基因与大豆的开花期提前有极显著的相关性，与大豆生育期El基因相比，有显著促进开花的功能，含有el-as基因的株系113和株系337其开花期的天数平均为37. I与36. 4，显著地早于带有El基因的株系177、株系268和株系427的51. 6,50. 2和51. 3，之间存在着极显著差异。同时，在上代为杂合体的株系241、株系306、株系378和株系446，其下一代分离的群体中，含有el-as基因的个体其开花期显著早于含有El基因的个体。在株系378中，其后代为纯合的el/el基因型，其开花期为37. 5，显著地早于其El/El基因型的50. 8，同时杂合基因型(El/el-as)的开花期46. 7，接近于E1/E1的基因型，说明El基因对el-as基因有部分显性作用。其中，表中株系为Harosoy-El与Harosoy杂交筛选得到的含有10个重组体的子一代；平均值为开花的天数；E1基因型中，el/el为纯合的el-as基因型，El/el为杂合的El/el-as基因型，E1/E1为纯合的El基因型；显著性测定是用 SigmaPlot (V12. I)中的 ANOVA 进行。表I开花期与El基因的关联分析
权利要求
1.大豆生育期el-as基因，其特征在于大豆生育期el-as基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。
2.如权利要求I所述的大豆生育期el-as基因的编码蛋白，其特征在于大豆生育期el_as基因编码蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
全文摘要
大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白，它涉及大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白。本发明提供了大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白。本发明的大豆生育期e1-as基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本发明的大豆生育期e1-as基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqID No2所示。本发明通过品种的相关的遗传及分子功能验证，e1-as基因与E1基因相比，具有促进开花的功能。
文档编号C12N15/29GK102676543SQ20121016226
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者吕世翔, 吴红艳, 夏正俊, 翟红, 陈受宜 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所