专利名称：大豆生育期e1-fs基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及大豆生育期el-fs基因及其编码蛋白。
背景技术：
El基因位于着丝 点附近，自Bernard (1971)年报道以来，人们一直没有克隆出其功能基因。由于该基因位于近着丝点(pericentromeric region),遗传重组率较低，不利于采用图位克隆法克隆出该基因，在发明专利(一种大豆生育期El基因及其编码蛋白，专利申请号为201210112662. 9)中，公布出El基因序列及其相应的蛋白序列后，证明大豆生育期El基因具有强烈抑制大豆开花的生理功能。其蛋白质序列虽然并不能鉴定出B3结构域，但是与B3结构域基因具有远缘的关系。B3结构域基因是一类较为保守的植物特有的转录因子，一般只有100-120氨基酸，常与其他结构域共同起作用。B3结构域中含有与DNA相结合的特殊位点，一般与DNA分子的大沟起作用。在含有B3结构域的蛋白质对抗逆性反应、植物的生长与发育等诸多方面起重要作用。同时，El基因具有一个核定位信号，其特征为亲核蛋白一般都含有的能保证整个蛋白质能够通过核孔复合体被运到细胞核内的特殊的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品种中，其El基因的突变如何影响着大豆生育期(开花期及成熟期)是一个非常重要的科学问题，目前还没有在分子水平上的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供大豆生育期el-fs基因及其编码蛋白。本发明的大ii生育期el-fs基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所不。本发明的大豆生育期el-fs基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本发明的大豆生育期el-fs基因是大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)的突变型基因。本发明的有益效果本发明是在克隆出大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的基础上，进一步对El基因序列进行深入系统的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表一类新型的基因家族，我们已证实El基因可以代表着El位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本发明对不同品种及近等基因系中El基因序列进行了研究，并确定了 el-fs基因，其对大豆生育期关系密切。el-fs基因是在大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)核苷酸序列48bp处发生了单碱基缺失,在AA 16至41之间形成移码(frameshift),在第42位形成了终止子(见序列表Seq ID No 2)0细胞定位研究发现，该基因因移码而造成了没有任何信号出现在细胞核或细胞质中。具有el-fs基因的品种表现为开花特早，在长日照条件下具有el-fs基因的品种或品系与短日照条件下的开花天数相当，大约为30天左右，说明具有el-fs品种几乎丧失了对光周期的敏感性。坂本早生(Sakamotowase)及其衍生品种是具有el-fs基因型的典型品种。
图I为el-fs基因电泳图，其中，I号为铁荚四粒丑，2号为长农14,3号为Kariyutaka, 4号为铁荚子，5号为长农18,6号为坂本早生(Sakamotowase), 7号为小金黄，8号为长农4 ；图2为GFP未融合el-fs基因的瞬时表达载体结构示意图；图3为GFP融合el-fs基因的瞬时表达载体结构示意图；图4为GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦显微镜GFP通道下的亚细胞定位影像图；图5为GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；图6为GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定影像位图；图7为GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦显微镜GFP通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图；图8为GFP融合el-fs基因的激光共聚焦显微镜GFP通道下的亚细胞定位影像图；图9为GFP融合el-fs基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；图10为GFP融合el-fs基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定位影像图；图11为GFP融合el-fs基因的激光共聚焦显微镜GFP通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图；图12 :大豆品种坂本早生(Sakamotowase)在长日照16小时光照/8小时黑暗条件下，出苗后32天照片，其中，箭头所指的是已开放的大豆花朵；图13具大豆生育期El基因的大豆品种Harosoy-El在长日照16小时光照/8小时黑暗条件下，出苗后32天的照片。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的大豆生育期el-fs基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。本实施方式是在克隆出大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的基础上，进一步对El基因序列进行深入系统的研究。由于在大中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表一类新型的基因家族，我们已证实EI基因可以代表着EI位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中El基因序列进行了研究，并确定了 el-fs基因，其对大豆生育期关系密切。el-fs基因是在大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)核苷酸序列48bp处发生了单碱基缺失,在AA 16至41之间形成移码(frameshift),在第42位形成了终止子(见序列表Seq ID No 2)0细胞定位研究发现，该基因因移码而造成了没有任何、信号出现在细胞核或细胞质中。具有el-fs基因的品种表现为开花特早，在长日照条件下具有el-fs基因的品种或品系与短日照条件下的开花天数相当，大约为30天左右，说明具有el-fs品种几乎丧失了对光周期的敏感性。坂本早生(Sakamotowase)及其衍生品种是具有el-fs基因型的典型品种。
具体实施方式
二 本实施方式的大豆生育期el-fs基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No :2所示。本实施方式是在克隆出大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的基础上，进一步对El基因序列进行深入系统的研究。由于在大中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表一类新型的基因家族，我们已证实EI基因可以代表着EI位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中El基因序列进行了研究，并确定了 el-fs基因，其对大豆生育期关系密切。el-fs基因是在大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662. 9)核苷酸序 列48bp处发生了单碱基缺失,在AA 16至41之间形成移码(frameshift),在第42位形成了终止子(见序列表Seq ID No 2)0细胞定位研究发现，该基因因移码而造成了没有任何信号出现在细胞核或细胞质中。具有el-fs基因的品种表现为开花特早，在长日照条件下具有el-fs基因的品种或品系与短日照条件下的开花天数相当，大约为30天左右，说明具有el-fs品种几乎丧失了对光周期的敏感性。坂本早生(Sakamotowase)及其衍生品种是具有el-fs基因型的典型品种。通过以下试验验证本发明的效果(I)基因el-fs序列的获得取长至三叶真叶期的待测品种坂本早生(Sakamotowase)叶片,采用CTAB法提取叶片基因组DNA ；以提取的DNA为模板通过Kl与K2引物，采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTAR HS扩增el-fs基因，PCR反应条件如下94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，共30循环，再72°C延伸7min，将PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序。测序结果表明大豆生育期el-fs基因具有序列表中Seq ID No 1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No 1由524个碱基组成，并编码具有序列表中Seq ID No 2的氨基酸序列的蛋白质。(2) el-fs基因的鉴定一、取长至三叶真叶期的待测品种叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA ;二、以步骤一提取的50ng基因组DNA为模板，以Fl和F2为引物采用购买自Takara公司的HinfI酶进行扩增，PCR反应条件如下95°C预变性3min ;95°C变性20s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共32个循环，再72°C延伸7min ;三、取经步骤二 PCR的产物约8 yl (浓度为300ng/U I)，用灭菌水稀释I倍后，经HinfI限制性内切酶(购买自Takara公司)，在37° C温度下，消化3h ;四、然后将步骤三酶切后的产物，采用13%非变性PAGE胶电泳进行检测；其中，步骤一所述的待测品种I至8号分别为铁荚四粒豆，长农14，Kariyutaka，铁荚子，长农18，坂本早生(Sakamotowase),小金黄,长农4。电泳结果如图I所示，由图I可知，其中1、2、3、4、5、7和8品种仅出现三条条带(A，B与C表示，即只有二个酶切位点),为大豆生育期El基因；而6号坂本早生(Sakamotowase)品种出现四条带型(A，B，D，E表示，即有三个酶切位点)即可为HinfI消化的el-fs基因型。(3) el-fs基因的功能分析一、大豆品种带有el-fs基因的表型分析为进一步验证el-fs基因型的功能， 将带有el-fs基因的坂本早生(Sakamotowase)品种与带有大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的Harosoy-El品种，种植在人工培养箱中(人工控制日照长度长日照为16小时光照/8小时黑暗，中等长照为13. 5小时/9. 5小时，短日照条件为12小时光照/12小时黑暗)，光源为荧光灯与白炽灯，其光强为235 270iimol s—1 m_2，同时，在自然光照的田间种植，观察品种从出苗到开花的天数。结果如表I所示，从表I中可以看出，在短日照(12小时光照/12小时黑暗)条件下，含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品种与含有el_fs基因的坂本早生(Sakamotowase)品种开花天数(从播种到开花)相当，大约30天左右；而在长日照条件(16小时光照/8小时黑暗)下,含有el-fs基因的坂本早生(Sakamotowase)品种为30天左右(图12)，而Harosoy-El品种为73天(图13)，在中等长照强度(13. 5小时光照/9. 5小时黑暗)及田间的效果，坂本早生(Sakamotowase)品种开花期与短日照相当，说明el_fs品种缺失了对大豆不同光周期长度的敏感性。表I不同El基因型品种的开花期
从出苗至开花期
品种名基因型人工气候箱# 田间(自然光照条 __12L/12D 14.5U9.5D 16U8D件)_
__E1______
ff黄豆
(Aokimame)__E±__31^0__nj.__106.0__S96_
「00411北兄小懲豆
(Peking)__El____65,0__98,0__55.2
Bay__E±__29,5__ird,__75,0__60.0
Harosoy-E/__E±__3^0__51^__73,0__46.4
Enrei__E1___ad,__510__7^,0__49.0
__e1-fs_____
坂木早4:
(Sakamotowase)__e1-fs__29.0__31.0__30.0__29.7_
_9E_ e1-fs29.0n.d.32.0n.d.注n. d. (not done)没有进行相应的试验；L=Light (光照长度)；D=Dark (黑暗长度)二、大豆生育期El基因核定位研究一、提取大ii Sakamoto品种(从日本生物资源研究所基因库购头得到)的DNA,并以其为模板，以Kl与K2为引物，采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTARHS扩增el-fs基因，PCR反应条件如下94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火15s，72°C延伸Imin，共30循环，再72°C延伸7min ;二、将步骤一获得的产物采用ClaI酶SpeI酶进行酶切，然后将酶切片段克隆到PBSK质粒中，形成一个CaMV 35S启动子驱动的el-fs与eGFP融合体质粒(即 CaMV 35S el-fs :eGFP);三、制备拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts)；四、将步骤三得到CaMV 35S el-fs :eGFP质粒通过氯化钙聚乙二醇法转染拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts),同时，将不含有 el-fs 的 pBSK (CaMV 35S :eGFP)质粒作为对照组，通过氯化钙聚乙二醇法转染拟南芥原生质体，置于激光共聚焦显微镜下观察；其中，pBSK质粒购买自Stratagene公司；拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts)制备方法如下一、配制纤维素酶消化液，消化液各组分的配比1. 25%(w/v)的纤维素酶R10，0. 3%(w/v)的离析酶R10，0. 4M/L的甘露醇，20mM/L的KCl，20mM/L的MES (pH=5. 7)，混合均匀后在55°C温度下加热lOmin，再加入终浓度为10mM/L CaCl2溶液，5mM/L的P -巯基乙醇和0. 1% (w/v) BSA ;二、取三至四周龄未抽苔的拟南芥莲座叶片，切成约0. 5mmXO. 5mm的形状，然后浸没于步骤一制得的消化液中，然后在黑暗放置3h，再用200目筛网过滤，收集滤过液并置于离心管中以IOOg/min的速度离心2min,去上清,用预冷的W5的溶液重悬清洗,再次以100g/min的速度离心后，收集沉淀用W5重悬并于冰上放置30min，再次以100g/min的速度离心，收集沉淀，用 ImL MMg溶液重悬，即得拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts);其中，W5的组成为154mM/L 的 NaCl, 125mM/L 的 CaCl2, 5mM/L 的 KCl 和 2mM/L 的 MES 缓冲液(pH=5. 7) ;MMg 的配比为0. 4M/L的甘露醇，15mM/MgCl2溶液和4mM/L的MES。氯化钙聚乙二醇法方法具体步骤如下一、分别取10 ill的质粒(CaMV35S: el-fs: eGFP与CaMV 35S: eGFP，质粒浓度约为lyg/yL)加入IOOyl的制备好的拟南芥原生质体中，再加入110 ill的PEG-CaCl2溶液，吹吸混匀，转化20min ;二、转化完后，加入440 ill的W5溶液混匀后，然后以100g/min的速度离心3min，去上清后加入ImL的W5溶液过夜培养16h,即完成;其中，PEG-CaCl2是由4g的PEG4000,3mL的H2O, 2. 5mL的0. 8M/L甘露醇，ImL的1M/L CaCl2溶液制成；W5的组成为154mM/L的NaCl溶液，125mM/L的CaCl2溶液，5mM/L的KCl溶液和2mM/L的MES缓冲液(pH=5. 7)。在激光共聚焦显微镜下观察拟南芥原生质体不同器官中大豆生育期el-fs基因的分布，从图4至图7中可见，不带有el-fs基因的对照载体，在细胞的细胞核及细胞质中均有分布，从图8至11中可以发现，本发明的el-fs基因，在细胞核内未观察到任何信号，说明el-fs基因并不具有核定位功能。说明el-fs基因的突变改变了原有大豆生育期El基因(发明专利申请号201210112662.9)的核定位功能，使本发明的el-fs基因较大豆生育期El基因具有不完全抑制大豆开花的功能。在上述试验中所述的Harosoy-El和Harosoy-el来源于美国农业部基因种质库(the USDA-ARS National Plant Germplasm System)的统一入库编号，分别为 PI547707 和 PI547676 ；Harosoy-EU Harosoy-el、Williams 82、Bay、Enrei、9E、坂本早生(Sakamotowase)和Kariyutaka等从日本生物资源研究所基因库购买得到。其他品种长农14,铁荚子,长农18,小金黄,长农4,小粒秣食S 和中黄39从吉林省农业科学院大S 研究中心是购买得到。
权利要求
1.大豆生育期el-fS基因，其特征在于大豆生育期el-fs基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。
2.如权利要求I所述的大豆生育期el-fs基因的编码蛋白，其特征在于大豆生育期el-fs基因编码蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
全文摘要
大豆生育期e1-fs基因及其编码蛋白，它涉及一种大豆生育期e1-fs基因。本发明提供了大豆生育期e1-fs基因及其编码蛋白。本发明的大豆生育期e1-fs基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本发明的大豆生育期e1-fs基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No2所示。本发明通过品种的相关的遗传及分子功能验证，e1-fs基因与E1基因相比，具有显著的促进开花的功能。
文档编号C12N15/29GK102732529SQ201210162188
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者刘宝辉, 吕世翔, 吴红艳, 夏正俊, 孔凡江, 翟红 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所