专利名称：一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程学和病毒学，尤其涉及一种含人类B亚群11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途。该腺病毒可以是11型腺病毒，也可以是用11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纤毛头氨基酸序列而构成的杂合腺病毒。该腺病毒通过对其增殖必须基因进行的有效控制或突变而具有选择性增殖能力。作为具有更广的感染谱和改良感染能力的条件增殖型的重组病毒，本发明的重组溶瘤腺病毒可以用于基因治疗尤其是肿瘤的基因治疗。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一大类疾病，随着社会经济的发展，肿瘤的主要危险因素不但未得到有效控制，反而愈演愈烈，是其发病率和死亡率持续上升。目前恶性肿瘤的常规治疗难以收到预期的疗效，特别是化疗药物的治疗指数低，毒副作用大。近几年，包括基因治疗在内的综合治疗成为肿瘤临床中不可或缺的一部分。我国的重组腺病毒p53注射液"Ad-p53"已于2004年上市，成为世界上第一个上市的癌症基因治疗药物(WangX等，Mol Cancer Ther. 2008Jun ;7 :1598-1603)。 腺病毒是肿瘤基因治疗的最常用的病毒载体，它是一种双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳(c即sid)呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体(hexon)、12个五联体(penton)及12根纤毛(fiber)，除此之外还有其他一些小蛋白，如A/I、WI、IX、111 a和IV a2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛(Fiber)以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区(knob)。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用(Gall JG等，J Virol. 1998 Dec ;72 :10260-10264 ;Sakurai F等，Curr Gene Ther. 2007Aug;7 :229-238)。
人类腺病毒家族有51个已知血清型，分为6个亚属(A-F)。基因治疗常用的人的2型(Ad2)及5型(Ad5)腺病毒在血清学分类上均属C亚群，在DNA序列上有95%的同源性。腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的。C亚群腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体，因此这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体(coxsackie/adenovirus rec印tor， CAR)。但是，在人体内造血细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、某些表皮细胞和肿瘤细胞(如膀胱癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤等)表面，CAR是低表达甚至不表达的。由于以腺病毒为载体的基因治疗中CAR介导的腺病毒进入靶细胞是基因转移中的限速步骤，并且转染效率与细胞表面CAR表达水平有关。低水平表达的CAR无疑是制约腺病毒转导效率的主要原因，即表现出细胞对C亚群腺病毒载体的抗性作用(Kim J等，J Virol. 2002;76 :1892-1903 ;Cripe TP等，Cancer Res. 2001 Aprl ;61 :2953-2960 ;S證ki K等，ClinCancer Res. 2001 ;7 :120-126 ;Wesseling JG等，Gene Ther即y. 2001 ;8 :969-976 ;Bao Y
4等，Prostate. 2005 S印1 ;64 :401-407 ;Stoff-Khalili MA等，Gene Ther. 2005 Dec ;12 :1696-1706)。以CAR为受体的C亚群腺病毒还存在在体内会引起严重毒副作用、人体内广泛存在的Ad5型腺病毒中和抗体很快清除病毒。这些问题限制了 Ad5和Ad2的广泛应用。
B亚群腺病毒包括3型、7型、11型、16型、35型、50型腺病毒，该组腺病毒的感染细胞不通过CAR受体，主要以CD46分子为吸附受体(Fleischli C等，J Gen Virol. 2007Nov ;88 :2925-2934 ;Pache L等，Virology. 2008 Jun 5 ;375 :573-579 ;Pache L等，JVirol. 2008Aug ;82 :7923-7931) 。 CD46是一种广泛表达的补体调节蛋白，这种蛋白几乎表达在除了红细胞以外所有人外周血细胞、各类干细胞以及大多数肿瘤细胞表面。因此，利用CD46受体的腺病毒载体近来受到更广泛的关注，人们针对腺病毒载体的靶向性修饰问题提出了许多策略。腺病毒Ad5/F35载体即是一种外壳改造的杂合病毒载体，它的主要结构是在现在的Ad5腺病毒载体的基础上，其受体结合位置的纤毛改造成了 35型腺病毒(Ad35)的纤毛。因此，Ad5/F35的细胞受体从Ad5的CAR变成了 CD46，原有的感染吸附受体的改变，提高了它对血液细胞、干细胞、肿瘤细胞的感染效率，感染谱比现在常用的Ad5更广，且转导效率普遍比Ad5高(Stone D等，Mol Ther. 2007Dec ;15 :2146-2153 ;Brouwer E等，CancerGene Ther. 2007Feb ;14 :211-219)。实验结果证实，Ad5/F35载体对髓系来源的K562细胞的感染能力明显优于常规的5型腺病毒载体，对B淋巴细胞的感染能力也略高于Ad5载体。AD5/F35的改造改变了载体的感染特性，但是其对细胞的毒性作用并没有因此而增加，证实这种方式的改造载体在干细胞、肿瘤细胞等转导和基因治疗研究中有更广阔的应用空间。
此外，有实验证实，B亚群腺病毒可能存在另一种感染细胞的特异受体。利用Ad5/ll-CMV-GFP和Ad5/35-CMV-GFP分别感染CD46阳性表达的A549和Hela细胞，Ad5/ll-CMV-GFP的感染效率均比Ad5/35-CMV-GFP高，而同时用这两种载体去感染CD46阳性表达的CH0-C2细胞，效率几乎一样(Stone D等，J Virol. 2005 ;79 :5090-5104)。另夕卜，抗血清实验显示，Adll-Fiber的knob区能完全抑制Ad35与A549细胞的结合，而Ad35_Fiber的knob区并不能完全抑制Adll与A549细胞的结合(MeiYF等，Virology. 2002 ;295 :3043)。分别用Ad5、Ad5/11和Ad5/35感染11种食道癌细胞和6种口腔癌细胞，Ad5/11和Ad5/35对所有肿瘤细胞的感染效率均比Ad5要高很多，而且Ad5/ll和Ad5/35的感染效率不依赖于CD46的表达水平(Ling Y等 Oncol R印.2005 ; 14 :831-835)。因此推测可能有其他的受体参与调节Adll和Ad35对细胞的感染。 尽管以腺病毒为载体的肿瘤基因治疗在实验和临床中取得了一些疗效，但是，进一步提高腺病毒对肿瘤细胞的转导效率、增强抗肿瘤基因的表达、使病毒载体具有更特异的靶向性，从而提高疗效和安全性，是未来肿瘤基因治疗研究的重点方向。
人11型腺病毒载体与传统的C组腺病毒载体相比，有诸多的优点血清中中和抗体的阳性率较低；与Ad5、 Ad35之间也没有交叉免疫反应；感染细胞不依赖CAR受体，对包括造血干细胞、原代肿瘤细胞、肿瘤干细胞在内的许多重要细胞都有较高感染效率；肝脏毒性低，免疫副作用小。因此，开发Adll载体，高效转染多数干细胞和肿瘤细胞，靶向杀灭肿瘤干细胞，实现彻底杀灭肿瘤的目的，将有十分重要的意义。 基因治疗方案中采用的腺病毒载体，多数采用没有复制能力的增殖缺陷型腺病毒。虽然增殖缺陷型腺病毒在体内外显示了一定的安全性，然而至今在临床试验中应用的大多数此类腺病毒载体尚存在表达外源基因的时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等许多缺点，因此临床疗效不佳。 要解决上述问题，需要一种能在肿瘤细胞中具有特异性增殖能力、能提高外源基因拷贝数和表达量、并且可以溶解杀死肿瘤细胞的条件增殖型腺病毒载体，即溶瘤腺病毒载体。国内外溶瘤腺病毒项目进展较快，国内上海三维公司的H101项目2005年底被批准上市(Yu W等，Curr Cancer Drug Targets. 2007 Mar ;7 :141-148)。越来越多的数据证明，溶瘤腺病毒有希望成为新一代的肿瘤治疗药物。
发明内容
所要解决的技术问题 基因治疗方案中采用的腺病毒载体，多数采用人类C亚群5型腺病毒(Ad5)，其感染细胞的过程依赖于CAR。但是，在人体内造血细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、某些表皮细胞和肿瘤细胞表面，CAR低表达甚至不表达。因此，低水平表达的CAR成为制约该类型腺病毒转导效率的主要原因，即表现出细胞对C亚群腺病毒载体的抗性作用。以CAR为受体的C亚群腺病毒还存在在体内会引起严重毒副作用、人体内广泛存在的5型腺病毒中和抗体很快清除病毒。 基因治疗方案中采用的腺病毒载体，多数采用没有复制能力的增殖缺陷型腺病毒。该类腺病毒载体普遍存在表达外源基因的时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等许多缺点，影响了其临床疗效。 因此，进一步提高病毒载体对肿瘤细胞的转导效率、增强抗肿瘤基因的表达、使病毒载体具有更特异的靶向性，从而提高疗效和安全性，是未来肿瘤基因治疗研究的重点方向。 采用的技术方案 本发明的目的在于提供一种可用于多种人体肿瘤的基因治疗的增殖型重组溶瘤腺病毒，该重组溶瘤腺病毒能够克服当前增殖缺陷型腺病毒载体(如Ad-p53)转运及表达抗癌基因效率低下、无靶向性的缺点，克服以人Ad5增殖型腺病毒载体(如H101、0NYX-015)仅具有单一抗肿瘤机制、对肿瘤细胞感染力低下、安全性不佳等缺点，其抗肿瘤疗效得以提
高，安全性得以改善。 为实现上述目的，本发明提供一种含B亚群11型腺病毒纤毛头(knob)氨基酸编码序列的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，该重组病毒的基因组含B亚群11型腺病毒纤毛头(knob)氨基酸编码序列，所述11型腺病毒纤毛蛋白编码序列，既可以是11型腺病毒，也可以是用人类11型腺病毒纤毛头(knob)的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纤毛头氨基酸序列而构成。 在实施例中，该增殖型重组溶瘤腺病毒的骨架序列是5型腺病毒(Ad5)，并由11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列取代5型腺病毒的纤毛头氨基酸序列，其纤毛蛋白编码序列如SEQ ID N0:1所示。病毒载体构建方面，通过两种实施方案来说明含ll型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒的功能的改进和用途，一是采用人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控Ela基因，同时用人缺氧反应元件(HRE)调控Elb区基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)，构建增殖型溶瘤腺病毒，二是对Elb-55kDa实施突变，使其失去活性，从而使病毒的增殖获得肿瘤特异性。在外源基因选择方面，通过两种实施方案来说明含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒介导基因表达的功能和用途，一是携带人趋化因子CCL5基因，二是携带绿色荧光蛋白报告基因EGFP。 含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒能够识别CD46膜受体和可能存在的其他特异受体，从而能高效感染人造血系统细胞、间充质干细胞、树突状细胞、肿瘤干细胞、原代肿瘤细胞等重要细胞，且免疫原性较低，与传统的C组腺病毒载体无交叉免疫反应；该腺病毒基因组通过基因缺失或者基因调节的有效控制，使其选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖；该腺病毒可作为基因转移的载体，在其基因组中同时插入多种抗肿瘤治疗基因，使肿瘤治疗基因随病毒的复制在肿瘤细胞内高效表达。通过病毒增殖和抗癌基因双重作用，特异性杀灭肿瘤细胞，用于治疗多种人体肿瘤。
人类腺病毒有A、B、C、D、E、F 6个不同亚属，它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史各不相同。本发明涉及腺病毒B亚群ll型。 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，腺病毒基因组的纤毛蛋白编码序列由人11型腺病毒纤毛蛋白基因组成。所述11型腺病毒纤毛蛋白基因，既可以是完整的野生型11型腺病毒的纤毛蛋白编码序列，也可以是由11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纤毛头氨基酸序列杂合而成。该病毒能够识别CD46膜受体和其他可能存在的特异受体，而不再依赖于CAR受体，从而使其感染人肿瘤细胞的感染谱更广，转导效率更高，提高了它对人造血系统细胞、间充质干细胞、树突状细胞、肿瘤干细胞、原代肿瘤细胞等重要细胞的感染效率。在实施方案中，所述重组腺病毒的11型纤毛蛋白基因序列如SEQ ID N0 :1所示，其中(l)第1-134位碱基5型腺病毒纤毛的tail蛋白编码序列；(2)第135-981位碱基11型腺病毒纤毛的shaft、knob蛋白编码序列。 另一方面，本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，该腺病毒基因组通过肿瘤特异性启动子对增殖必需基因的有效控制，使其选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，从而使其靶向人肿瘤细胞，保证腺病毒在肿瘤细胞内高度增殖，发挥溶瘤作用。该肿瘤特异性启动子可以是以下任何一种肿瘤特异性启动子或增强子(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、 Her-2、 Her_3和Her_4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-l(HIF-l)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列；和(k)人端粒酶亚基启动子。
本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，至少一个病毒增殖必需基因受一种肿瘤特异性启动子控制。该病毒增殖必需基因可以是Ela。该溶瘤腺病毒能够在在肿瘤细胞内特异性地增殖复制，表达Ela，发挥Ela抗肿瘤作用。Ela可以通过抑制Her-2/neu基因的转录、阻断NF- k B的活性、提高免疫细胞的杀伤效应、增强转移抑制基因nm23的表达等多种途径，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭转移，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。该溶瘤腺病毒与化疗和放疗合用，能够增强肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，进一步提高治疗效果。 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，至少一个病毒增殖必需基因受一种肿瘤特异性启动子控制。肿瘤特异性启动子控制的病毒增殖必需基因还可以是Elb-55kDa、 Elb-19kDa、 E2或E4，该增殖必需基因可以是野生型的，也可以是经过缺失、突变等改造的基因变体。 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其Elb-55kDa蛋白功能丧失，通过对编码Elb-55kDa蛋白的基因序列进行全部缺失、点突变、部分缺失、插入突变或者插入终止密码子等方式。Elb-55kDa是腺病毒在正常细胞增殖复制必需的而在肿瘤细胞中复制时的非必需的蛋白，Elb-55kDa编码基因的选择性缺失可以使腺病毒在肿瘤细胞内保持增殖复制的能力，而在正常细胞中失去复制能力。
本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其Elb-19kDa蛋白功能丧失通过对编码Elb-19kDa蛋白的基因序列进行全部缺失、点突变、部分缺失、插入突变或者插入终止密码子等方式。腺病毒Elb-19kDa基因与凋亡抑制基因Bcl-2同源，编码的Elb-19kDa蛋白能够结合Bax或/和Bak启动下游的凋亡抑制程序，Elb-19kDa还可以破坏Fas介导的凋亡过程，保护感染的细胞免受TNF-a介导的杀伤作用。Elb-19kDa基因失活，因而该病毒在肿瘤细胞内增殖的特异性得以提高，而在正常细胞内的增殖活性被削弱。Elb-19kDa蛋白功能的丧失，不但能够促进肿瘤细胞凋亡通路的恢复，而且有利于病毒在正常细胞内的快速清除以及在肿瘤细胞内的快速释放和播散，使该溶瘤腺病毒治疗肿瘤的特异性更好，效能更强。 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其基因组中预置了多克隆位点，可作为基因转移的载体。该位点可以在Ela启动子上游，也可以在Ela和Elb之间，或在E3区，便于携带各种抗肿瘤基因表达盒。将抗肿瘤基因插入该病毒的外源基因多克隆位点，发挥多重抗肿瘤效能。随着病毒在肿瘤内的特异性增殖复制，其携带的抗肿瘤基因的拷贝数和表达量得到提高，从而抑制肿瘤细胞生长或杀灭肿瘤细胞。 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其抗肿瘤基因的选择还可以是下列任意一种(a)干扰素系列免疫调节因子基因；(b)白细胞介素系列免疫调节因子基因；(c)细胞集落剌激因子基因；(d)抑癌基因；(e)原癌基因反义序列；(f)人肿瘤表皮生长因子受体家族(EGFRs)的抗体基因；(g)具有抗血管生成的内皮抑素、血管抑素及其片段、纤溶酶原激活因子抑制剂、Canstatin、血小板反应蛋白等核苷酸序列；(h)细胞凋亡诱导因子家族基因；(i)血管内皮生长因子抗体基因；(j)药物前提转化基因(又称自杀基因)；和(k)肿瘤坏死因子基因。 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，抗肿瘤基因表达盒中编码序列受人类巨细胞病毒(CMV)启动子的控制，该顺式作用元件插入抗肿瘤基因序列的转录起始位点与翻译起始位点之间，保证该基因蛋白在病毒感染的肿瘤内部高效表达，发挥生物学活性。抗肿瘤基因还可以受下列启动子控制(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、 Her_2、 Her_3和Her-4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-l(HIF-l)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列；和(k)人端粒酶亚基启动子。 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，抗肿瘤基因表达盒中编码序列的加尾序列为SV40 Poly A，该顺式作用元件插入基因核苷酸序列的翻译终止密码子之后。 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，至少一个病毒增殖必需基因受一种肿瘤特异性启动子控制。其多个增殖必需基因之间可以由多核糖体进入位点(IRES)序列连接，使之共同受肿瘤特异性启动子调控，或由多个肿瘤特异性启动子分别调控。实施例中，以双启动子分别控制Ela和Elb基因，人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制Ela基因，人缺氧反应元件(HRE)调控Elb区基因(Elb_55kDa和Elb-19kDa基因)。 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，该病毒突变体由人类腺病毒载体、肿瘤特异性启动子的顺式作用元件、人类11型腺病毒纤毛蛋白基因和抗肿瘤基因表达盒可操作地连接而成。该增殖型溶瘤腺病毒由含人类11型腺病毒纤毛蛋白基因的骨架质粒与携带抗肿瘤基因的腺病毒穿梭质粒在293细胞内通过Cre-loxP重组酶切割系统定点重组而产生。其含人类11型腺病毒纤毛蛋白基因的骨架质粒序列如SEQ ID N0:2所示，其中(l)第l-85位碱基腺病毒ITR序列；(2)第562-700位碱基SV40\AN序列；(3)第1245-2294位碱基pSP13Cre序列；(4)第2375-2716位碱基HCMV\IE序列；(5)第2962-3819位碱基amp编码序列；(6)第4901-4934位碱基LoxP序列;(7)第31516-31649位碱基:5型腺病毒纤毛蛋白的tail编码序列；(8)第31649-32496位碱基11型腺病毒纤毛蛋白基因的shaft、 knob编码序列；(8)第35554-35655位碱基腺病毒ITR序列；(9)其余5型腺病毒基因组序列，见MicrobixBiosystems公司的pBHGloxdeltaEl， 3Cre序列。
实现的技术效果 1.本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，该腺病毒具有外源基因的多克隆位点，可用于构建多种抗肿瘤基因治疗的腺病毒产品，为肿瘤的基因治疗建立一种疗效可靠的技术平台。 2.本发明提供的溶瘤腺病毒具有多重抗肿瘤机制和特异性优势1)该重组病毒的基因组含11型腺病毒纤毛蛋白蛋白编码序列，使病毒能够识别CD46膜受体，从而高效感染人造血系统细胞、间充质干细胞、树突状细胞、肿瘤干细胞、原代肿瘤细胞等重要细胞；2)以肿瘤特异性启动子调控腺病毒增殖必须基因表达，使病毒在大多数类型的人类肿瘤细胞中增殖并破坏肿瘤细胞，其调控具有严谨性和安全性；3)在肿瘤细胞内高效而特异性表达的Ela，促进病毒增殖，同时其本身也具有抗肿瘤作用；4)将编码抗肿瘤基因的核苷酸序列插入该病毒的基因组中，随着病毒在肿瘤内的特异性增殖复制，其携带的抗肿瘤基因的拷贝数和表达量增加，从而抑制肿瘤生长。 3.本发明提供的溶瘤腺病毒，比国内目前已上市的基因治疗产品重组p53腺病毒注射液"Ad-p53"具有更好的广谱性和感染效率，疗效得到提高；比国内目前已上市的增殖 腺病毒产品H101具有更好的疗效和更高的安全性，适应于人类绝大多数类型恶性肿瘤的 治疗。 附图简述
图1表示含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列的腺病毒载体pCL0N9-F11的构建 流程。 图2表示腺病毒包装质粒pPE3的构建流程。
图3表示pPE3-F11构建流程。 图4表示L02正常肝细胞，MOI = 10感染Ad5-EGFP，荧光细胞约占25%左右。
图5表示L02正常肝细胞，MOI = 10感染SG511-EGFP，荧光细胞约占85%左右。
图6表示S匪C-7721肝癌细胞，M01 = 10感染Ad5-EGFP，荧光细胞约占35%左右。
图7表示SMMC-7721肝癌细胞，MOI = 10感染SG511-EGFP，荧光细胞约占95%左 右。 图8表示用人CCL5基因引物扩增1_4号腺病毒克隆，均能扩增出349bp条带，与 阳性对照(P) —致，说明1-4号腺病毒均含有CCL5基因。其中Ml :100bp DNA Ladder ;N : 阴性对照；P :阳性对照(pENTR12-CCL5) ;1-4 :SG511-CCL5病毒克隆 图9表示SG511-CCL5在肝癌细胞中随着时间呈几何倍数增殖，具有良好的增殖能 力，而在正常细胞株BJ中的增殖倍数很低。 图10表示SG511-CCL5治疗组同其他对照组相比，显示出更强的抑制肿瘤生长作 用，肿瘤体积一直明显小于对照组，有显著统计学差异(P < 0. 05)，说明嵌合增殖型腺病毒 SG511-CCL5对肝癌动物模型有很强的抗肿瘤作用，能明显抑制肿瘤的生长发展。
发明详述 下面通过实施例阐述本发明的实施方式，所述实施例仅用于例示性阐示本发明， 其不限制本发明的保护范围，本领域技术人员根据本发明通过同等的变型和改良的技术方 案都包含在本发明中。 在实施例中，第一方案以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制5型腺病毒Ela， 用人缺氧反应元件(HRE)调控Elb区基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)为例；第二方案 对Elb-55kDa实施突变，使其失去活性，从而使病毒的增殖获得肿瘤特异性，构建含11型腺 病毒纤毛蛋白基因的溶瘤腺病毒载体。在实施例的具体实施中，以人趋化因子CCL5基因和 绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)为例设立两种策略，构建携带目的基因的腺病毒载体。
具体实施例方式
实施例1 :含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列的腺病毒载体pCL0N9-F11的构
建 第一步合成含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列如SEQ ID N0:3所示，命名 Ad5Fll，其中(l)第236-369位碱基5型腺病毒纤毛tail蛋白编码序列；(2)第367-1216 位碱基11型腺病毒纤毛shaft、 knob蛋白编码序列；(3)其余碱基5型腺病毒基因组序 歹lj， i Microbix Biosystems &^]白勺pBHGloxdeltaEl， 3Cre ，歹lj。第二步合成VT176序列(SEQ ID NO :4)禾PVT177序列(SEQ IDNO :5)，构建pCL0N9
10载体。Ad5F11序列经Pacl+Hindlll酶切，回收2656bp片段，与pCL0N9/PacI+Hind111酶切 的载体连接，构建成pCL0N9-Fll，经酶切和测序鉴定确认。构建步骤如图l所示。
实施例2 :BJ5183细胞内同源重组第一步pCL0N9-F11经HindlII+Aat11酶切，回收5913bp片段。 第二步合成ADP序列(SEQ ID NO :6)，如图2所示，构建腺病毒包装质粒pPE3。第三步pPE3载体经PacI酶切，回收线性化载体。pCL0N9-Fll/HindlII+Aat11 4
微升，pPE3/PacI 2微升，共同转化感受态大肠杆菌BJ5183(Qbiogene公司)。铺板培养，
挑取克隆进行酶切鉴定，正确者命名为pPE3-Fll，经大样质粒提取纯化，保存于深低温冰箱
中。pPE3-F11构建流程如图3所示。 实施例3 :含Adll腺病毒纤毛蛋白基因的腺病毒在体外对培养细胞的感染力实验
第一步以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制5型腺病毒Ela，插入位点 Notl+Swal，构建腺病毒载体pQW-hTERT-Ep-HRE (见专利ZL028138198， 一种高效表达抗癌 基因的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途；现改名为pSG502)。其中hTERT启动子调控 Ela基因，同时用人缺氧反应元件(HRE)调控Elb区基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)。 所述hTERT启动子核心序列如SEQ ID NO :7所示，缺氧反应元件HRE序列如SEQ ID NO :8 所示。 第二步将EGFP基因(SEQ ID NO :9)插pSG502，构建成pSG502-EGFP， EGFP插入 位点为EcoRI+SalI。 第二步含有EGFP基因的腺病毒质粒pSG502-EGFP与骨架质粒pPE3_Fll共转染 HEK293细胞(购于加拿大Microbix Biosystems公司，该细胞由剪切的5型腺病毒DNA转 化，含5型腺病毒El区，腺病毒DNA对其具有高转染率，通过细胞内重组产生具有感染力的 腺病毒)，进行细胞内重组。转染具体方法步骤参见Invitrogen公司的LipoFectamine2000 试剂盒操作说明书。重组产物经PCR鉴定正确者命名为SG511-EGFP。 EGFP基因PCR引物 为上游引物5'-GCTCTAGAGAATTCACCATGGTGAGCAAGGGC-3' (SEQ ID NO : 10)，下游引物5'-CGGGATCCGTCGACTTATTACCTAGATCCGGTGG-3， (SEQ ID NO :11)，扩增片段793bp。
第三步将EGFP基因插入腺病毒质粒pDC315 (MicrobixBiosystems公司)中的 EcoRI+Sall位点，构建成pDC315-EGFP，与骨架质粒pPE3进行细胞内重组，重组产物经PCR 鉴定正确者命名为Ad5-EGFP，作为对照病毒。该对照病毒为含5型腺病毒纤毛蛋白基因的 病毒载体。 第四步正常细胞株和肿瘤细胞株分别按5X 105细胞/孔铺在6孔板中，在37°C 孵箱5% C02培养，第二天换无血清液体lml，然后按MOI = 10分别加入重组溶瘤腺病毒 SG511-EGFP和Ad5-EGFP， 24小时后荧光显微镜下观察。 观察结果图4中为L02正常肝细胞，M01 = 10感染Ad5-EGFP，荧光细胞约占25% 左右。图5中为L02正常肝细胞，M01 = 10感染SG511-EGFP，荧光细胞约占85X左右。图 6中为SMMC-7721肝癌细胞，MOI = 10感染Ad5-EGFP，荧光细胞约占35%左右。图7中为 SMMC-7721肝癌细胞，M01 = 10感染SG511-EGFP，荧光细胞约占95%左右。表明SG511-EGFP 感染能力明显强于Ad5-EGFP。 实施例4 :含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列、Elb-55kDa失活的溶瘤腺病毒的
重组
以我们前期构建成功的Elb-55kDa失活的腺病毒载体pXC-delElb (钱其军等，中 华医学杂志.2002,82 :557-560)为基础，与pPE3_Fll共转染HEK293细胞，重组含11型腺 病毒纤毛蛋白基因编码序列的腺病毒SG211，该病毒Elb-55kDa失活，获得在肿瘤细胞内特 异增殖的能力。 实施例5 :携带抗肿瘤基因的腺病毒载体的构建 本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的重组溶瘤腺病毒，其特征在于，通 过基因缺失或者基因调节的有效控制，使其选择性地在肿瘤细胞内增殖；其基因组中预置 了多克隆位点，该位点可以携带各种抗肿瘤基因表达盒。溶瘤腺病毒载体以人端粒酶逆转 录酶(hTERT)启动子控制5型腺病毒Ela基因，同时用人缺氧反应元件(HRE)调控Elb区 基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)为例，抗肿瘤基因以人趋化因子CCL5基因为例。同 时构建非增殖的腺病毒载体为对照病毒。 第一步以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制5型腺病毒Ela，插入位点 Notl+Swal，构建腺病毒载体pSG502 (见专利ZL028138198)。其中hTERT启动子核心序列 如SEQ ID NO :7所示。 第二步合成含有人趋化因子CCL5基因核苷酸序列(SEQ IDN0 :12)，其 5'端和3'端分别引入EcoRI和BamHI位点，经EcoRI+BamHI酶切后分别插入质粒 pENTRll(Invitrogen LifeTechnology Inc.)和pDC315多克隆位点区，构成pENTR12-CCL5 和pDC315-CCL5，再分别与骨架质粒pPE3-F11进行重组，重组产物经酶切鉴定正确者命名 为pPE3-Fll-CCL5和Ad5Fll-CCL5。 实施例6 :含11型腺病毒纤毛蛋白基因的溶瘤腺病毒的细胞内重组及扩增纯化
本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，对肿瘤 细胞具有良好感染能力和靶向性。 第一步将构建好的5型腺病毒质粒pSG502，与含有11型腺病毒纤毛蛋白基因 的杂合腺病毒载体质粒pPE3-Fll-CCL5，通过LipoFectamine2000共同转染HEK293细胞。 pPE3-Fll-CCL5含有5型腺病毒右臂，缺失El区，其重组酶系统Cre/LoxP可以保证病毒 的高效重组。在载体共转染后的9-14天，陆续出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化(具 体方法参见GeneTransfer and Expression Protocols, Murray EJ主编，Humana Press, Clifton， New Jersey)，重组得到溶瘤腺病毒SG511_CCL5。 第二步重组溶瘤腺病毒的鉴定，以腺病毒Ela基因引物排除野生型腺病毒，以人 CCL5基因引物鉴定重组腺病毒是否含有CCL5序列。腺病毒Ela基因引物上游引物5' _c ggaattcaccatgagacatattatc-3， (SEQ ID NO : 13)，下游引物5，-gcgtcgacttatggcctggggcg -3' (SEQID NO :14)，扩增片段1005bp。人CCL5基因引物为上游引物5，-CGGAATTCACCATG AAGGTCTCCGCGGCAG-3' (SEQ ID NO :15)，下游引物5'-CGGGATCCCTATAACTGGAAGTCATCATCCAT TG-3' (SEQ ID NO :16)，扩增片段349bp。 如图8所示，以人CCL5基因引物扩增1_4号腺病毒克隆，均能扩增出349bp条带， 与阳性对照(P) —致，说明l-4号腺病毒均含有CCL5基因。 第三步重组溶瘤腺病毒在HEK293细胞中大量扩增，应用氯化铯梯度离心的方法 纯化腺病毒(具体方法参见GeneTransfer andExpression Protocols, Murray EJ主编， Humana Press, Clifton， Newjersey)。用TCID50法测得重组溶瘤腺病毒SG511-CCL5的滴度达到2. 79X101Qpf ii /ml。 实施例7 :重组溶瘤腺病毒SG511-CCL5的在体外培养的肿瘤细胞内增殖实验
正常细胞株和肿瘤细胞株分别按5X 105细胞/孔铺在6孔板中，在37t:孵箱5% C02培养，第二天换无血清液体lml，然后按MOI = 5加入重组溶瘤腺病毒SG511-CCL5，培养 90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5%胎牛血清的培养液培养， 分别在0小时、48小时、96小时收集，冻融三次，用TCID50法来检测病毒滴度(方法参见美 国Qbiogene公司的AdEasyTM操作手册)。以0小时病毒滴度为参照，算出病毒在48小时、 96小时的增殖倍数，结果发现SG511-CCL5在肝癌细胞中随着时间呈几何倍数增殖，具有良 好的增殖能力，而在正常细胞株BJ中的增殖倍数很低，具体如图9所示。
实施例8 :重组溶瘤腺病毒SG511-CCL5动物实验 第一步4 6周龄BALB/C裸鼠50只，平均重量22 27g，由上海中科院实验动 物培育中心提供，清洁级动物实验室饲养。 第二步体外培育人肝癌细胞S匪C-7721，取对数生长期贴壁生长细胞，0. 25%胰 酶消化，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后 离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5 X 107个/ml 。 第三步于裸鼠右肋背部皮下接种S匪C-7721细胞，O. lml/只。接种三周左右后， 可见接种部位皮下长出米粒大小硬结，移植瘤模型建成。待瘤体直径生长至7-9mm时开始 治疗。挑选40只皮下肿瘤生长至7-9mm的S匪C-7721移植瘤进行治疗，将裸鼠随机分分为 5组。给药途径为直接瘤内多点注射。 第四步每日观察小鼠的生活状态并定期测量肿瘤的体积，定期测量一次肿瘤的 最长径(A)及其垂直径(B)，按公式(AXB2)/2计算肿瘤的体积，观察不同剂量组的疗效。
实验设置带CCL5基因的非增殖型的腺病毒Ad5Fll-CCL5和不带CCL5基因的增 殖型腺病毒SG511(其名称为人腺病毒5/11嵌合型SG511，保藏日为2009年1月9日，保 藏号为CCTCC-V2000903，保藏地点为中国典型培养物保藏中心)为对照病毒。结果发现 SG511-CCL5治疗组同其他对照组相比，显示出更强的抑制肿瘤生长作用，肿瘤体积一直明 显小于对照组，有显著统计学差异(P < 0. 05)，说明杂合增殖型腺病毒SG511-CCL5对肝癌 动物模型有很强的抗肿瘤作用，能明显抑制肿瘤的生长发展(见图10)。 SG511-CCL5治疗 组同其他对照组相比，显示出更强的抑制肿瘤生长作用，肿瘤体积一直明显小于对照组，有 显著统计学差异(P < 0. 05)，说明嵌合增殖型腺病毒SG511-CCL5对肝癌动物模型有很强的 抗肿瘤作用，能明显抑制肿瘤的生长发展。
序列表 〈110〉第二军医大学东方肝胆外科医院 〈120〉 一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及 其用途 〈130〉IDC080XXX
〈160>16 〈170>PatentIn version 3. 2
〈210>1
〈211>981
〈212>DNA〈213〉 11纤毛序列〈400>1atgaagcgcgcaagaccgtctg皿gateccttcaaccccgtgtetccatetg3C3Cgg皿60accggtcctccaactgtgccttttcttectcctccctttgtetcccccaa120gagagtccccctggagttcttgttteacccC3C3ggCgg3180tctctecagcte腿gtggg郷gggactt織gtggatg3C3CC皿Cggttttttgaaa240gtgccaccacaccactcgtt皿gactggtcactcteteggttteccacte300ggagccggattggg朋cg朋ctttgtetca皿tteggac33ggacttec3360ttcaattcaaacaacatttgcattgatgacccttetggacaggagtc皿c420cccaccgaagccaactgtcatccagtgaatcteatgattg■cteacactegttea朋ctggagcactegtcactgcatttgtttetgttetaggagtetct540atetgcteactec3C3C3gattectgcagagctgtttttc600gattctectggteatttectaactegactctcatccctcaaaactccact660tC3gg3C3朋acatggctectggtgccattacteatgcteaaggtttcatgcccagcacg720actgcctetcctttcaatgateattctegaactecatttecggaacttgt780tectecacagctegtgatcgcactgcttttcccattgacatetctgtcatgctteaccga8403gagc朋tea3tg3Cg3g3Catcatettgtattcgteteacttggtcctgg皿C3C3gg3■gatgccccag3ggtgC3朋Cctctgctecaaccctegtcacctccccattteccttttec960tecatcagag朋gacgactg981〈210>2〈211>35655〈212>DNA〈213>Ad5/ll重组载体序列〈220〉〈221>misc—feature〈222〉 (721) (721)〈223>n isa， c， g，或t〈220〉〈221>misc—feature〈222〉 (849) . (849)〈223>n isa， c， g，或t〈220〉〈221>misc—feature〈222〉 (874) . (874)〈223>n isa， c， g，或t〈220〉〈221>misc—feature〈222>(1118) . (1118)
〈223〉n isa， c， g，或t〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1197). (1197)〈223〉n isa， c， g，或t〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉 (2254) (2254)〈223〉n isa， c， g，或t〈400〉2ttettttgga郷gggtggagtttgtgacgtggcgcgggg60cgtggg雄ggggcgggtgacgtegtegtgtggcgg朋gtgtgatgttgc朋gtgtggcg120皿gcgacggatgtggc朋朋gtgacgtttttggtgtgcgccggatccaca180ggacgggtgtggtcgccatgatcgcgtagtcgategtggctccaagtegcg皿gCg3gC3240ggactgggcggcggcca朋gcggtcggacagtgctccgag皿cgggtgcgcatega朋tt300gcatcaacgcatatagcgct3gC3gC3CgCcatagtgactggcgatgctgtcgg朋tgga360cgatetcccgc朋gaggcccggcagteccggcat朋cc朋gcctatgcctacagcatcca420gggtgacggtgccg郷atg3Cg3tg3gCgcattgttagatttcatacacggtgcctgac■tgcgttegcaatttaactgtgate朋cteccgcatte皿gcttetcgttcg咖tttggg540ggatcttcgatgctegacgatccagacatgttgatgagtttgg3C3朋CC600ac朋cteg朋aaaatgcttttttgtgatgctattgcttta660tttgtaaccattataagctggttgctcgaagtcgacgatcCg朋C3朋Cg720nccc朋cacccgtgcgttttattctgtctttttattgccgatcccctcag780c皿g朋ggcgateg皿ggcgatgcgctgcg皿tcgggagcggcgateccgte朋gcacg3840gg朋gcggncagcccattcgccgccatgtttttnagcaatgccaacgcta■tgtcctgatagcggtccgcc3C3CCC3gCCtcgacaattccaacctteccc皿gagttcg960ccaaactcagacatcacttt3gC皿皿CCgcgccgtgcttcttcctcggtggcattcatc1020cagcactecgcatacttttgg3C3gg朋3Cgc皿cggatettgagtcaat1080atcaggcattctatcgctcagctttacagtgacaatgncggctggcgact1140gcttecagacagcactacatattttccgtcgatgttga朋tcctttctcatatgtcncca1200ateattetegcaatcatttacgcgtteatggcteatcgccatcttccagc12603ggCgC3CC3ttgcccctgtttcactetcc郷ttecggatetegttcatgacaatettt1320acattggtccagccaccagcttgcatgatctccggtettgaaactccagcgcgggccate1380tctcgcgcggctccgacacgggcactgtgtCC3g3CC3ggccaggtatctCtg3CC3g3g1440tcatccttegcgccgtaaatc皿tcgatg3gttgcttcaaaaatcccttcc郷gcgcga1500gttgategctggctggtggc卿tggcgcggcaacaccattttttctgacccggc皿皿c1560aggtegttettcggatcatcagctecaccagagacgg3朋tccatcgctcgaccagttta1620gttacccccaggct皿gtgccttctctacacctgcggtgcteaccagcgttttcgttctg1680cc朋tetggattaacattctcccaccgtcagtecgtg卿tetcttteaccctgatcctg
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〈400>3gccgtteattaagatcttettcccttteac60ttctgtccag tttettcagcagcacctcct tgccctcctc120ccagctctggtettgcagcttcctcctggctgcaaactttctccacaatc teaatggaat180gtcagtttcctcctgttcctgtccatccgcacccactetcttcatgttgt tgcagatgaa240gcgcgcaagaccgtctgaagateccttcaa ccccgtgtetccatetg3C3 cgga皿ccgg300tcctccaactgtgccttttcttectcctccctttgtetccccc皿tgggt ttc皿gagag360tccccctggagttcttectt皿ccccactaacaaccacag gcggatctct4203C3gctea朋gtggg郷gggacttecagtgg3tg3C3CC皿Cggttttt tg皿3g皿皿■cateagtgcc3CC3C3CC3Ctcgtteagactggtcactctateggtttec cacteggagc540cggattgggaggac皿ggac ttecattc皿600atttgcattgatgac皿tetteacaccttatgg3C3gg3g tc皿ccccac660cg皿gcc皿ctgtcaaatcatgaactccag tgaatcteatgattgcaaat teattcteac720actegtte皿3Ctgg3gC3Ctegtcactgcatttgtttetgtteteggag tetcteac皿780tttteatetgcteactecacgcagagctgt ttttcgattc840
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〈212>DNA〈213>HRE序列〈400>8actegtccacagtgcatecg tgggctccaacaggtcctcttccacagtgc atecgtgggc60tccaacaggtcctcttccac3gtgcatecgtgggctccaacaggtcctct tccacagtgc120atecgtgggctccaacaggtcctcttccac3gtgcatecgtgggctccaa caggtcctct180tggteggcgtgtecggtggg aggtctetet皿gcagagctcgtttegtga accgtcagat240cactegt247〈210>9〈211>747〈212>DNA〈213>EGFP报告基因序列〈400>9EltggtgElgCElElgggCgElggElgctgttcaccggggtggtgcccatcctggt cgagctggac60ggcgacgtea3CggCC3C朋gttcagcgtgtccggcgagggcgagggcga tgccacctec120ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggc皿gctgcccgtgcc ctggcccacc180ctcgtgaccaccctgacctecggcgtgcagtgcttcagccgcteccccga ccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccg皿ggctecgtccaggagcg caccatcttc300ttc朋ggacgacggc朋ctecaagacccgcgccg郷tga3gttCg3ggg Cg3C3CCCtg360gtg朋ccgcatcgagctg朋gggcatcgac3CggC皿C3t cctggggcac420朋gCtgg3gtC3gCC3C皿Cgtctetetcatggccgac皿gcag皿g皿c■ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccac皿C3tCg3ggacggcagcgt gcagctcgcc540gaccactecc3gC3g朋C3Cccccatcggcgacggccccgtgctgctgcc cgacaaccac600tecctgagcacccagtccgcCCtg3gC皿3gaccccaacg3g皿gcgcga tcaratggtc660ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagct gtec皿gtcc720ggactcagatccaccggatcteggtea747〈210>10〈211>32〈212>DNA〈213>引物序列〈400>10gctctegagaattcaccatg:gtgagc卿g gc32〈210>11〈211>34〈212>DNA〈213>引物序列〈400>11cgggatccgtcgacttatta,cctagatccg gtgg34〈210>12
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〈211>345〈212>DNA〈213〉人趋化因子CCL5序列〈400>12gaattcacca tgaaggtctc cgcggcagcc ctcgctgtca tcctcattgc tactgccctc60tgcgctcctg catctgcctc cccatattcc tcggacacca caccctgctg ctttgcctac120attgcccgcc cactgccccg tgcccacatc aaggagtett tctecaccag tggcaagtgc180tccaacccag cagtcgtctt tgtcacccga aagaaccgcc aagtgtgtgc caacccagag240朋g朋3tggg ttCggg￡lgt￡l C3tC朋Ctct ttgg￡lg￡ltg￡l gCtt￡lg￡lCtt gg￡lg￡ltgtt￡l300gctccctete tcccaatgga tgatgacttc cagttetegg gatcc345〈210>13〈211>26〈212>DNA<213>引物序列〈400>13cggaattcac catgagacat attatc26〈210>14〈211>23〈212>DNA〈213〉引物序列<400>14gcgtcgactt atggcctggg gcg23〈210>15〈211>30〈212>DNA〈213〉引物序列〈400〉15cggaattcac catgaaggtc tccgcggcag30〈210>16〈211>34〈212>DNA〈213〉引物序列〈400>16cgggatccct ataactggaa gtcatcatcc attg3权利要求
一种增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于该重组腺病毒含B亚群11型腺病毒纤毛头的氨基酸编码序列；并且该病毒基因组至少一个病毒增殖必需基因被突变或者被缺失而失去功能，或所述病毒在增殖必需基因序列的转录起始位点与翻译起始位点ATG之间可操作地插入顺式作用元件，所述元件控制基因组中至少一个病毒增殖必需基因的转录。
2. 权利要求l的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于该重组腺病毒纤毛头的氨基酸序 列为人类B亚群11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列。
3 根据权利要求1所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒在增殖必需基 因序列的转录起始位点与翻译起始位点ATG之间可操作地插入的是肿瘤特异性启动子的 顺式作用元件。
4. 根据权利要求3所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述肿瘤特异性启动子 选自(a) 癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b) 甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c) 人表皮生长因子受体家族的受体酪氨酸激酶启动子、增强子及其突变体序列；(d) 乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e) 血管内皮生长因子受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f) L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g) 凋亡抑制蛋白家族成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h) 前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i) 缺氧诱导因子-1调控的缺氧反应元件保守序列； (j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列；禾口 (k)人端粒酶亚基启动子、增强子及其突变体序列 中的至少一种。
5 根据权利要求1所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒增殖必需基因 是野生型的或者经过突变的编码Ela、Elb-55kDa、Elb-19kDa、E2或E4的基因。
6. 根据权利要求l所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒增殖必需 基因是经过点突变、插入突变、插入终止密码子、完全或部分缺失而失活的Elb-55kDa或 Elb-19kDa基因。
7. 根据权利要求1所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于其还可操作地连接有外 源基因表达盒。
8. 根据权利要求7所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述外源基因选自(a) 干扰素类免疫调节因子的基因；(b) 白细胞介素类免疫调节因子的基因；(c) 细胞集落剌激因子的基因；(d) 抑癌基因;(e) 原癌基因的反义序列；(f) 人肿瘤表皮生长因子受体家族的抗体基因；(g) 编码抗血管生成因子的内皮抑素、血管抑素及其片段、纤溶酶原激活因子抑制剂、 Canstatin、血小板反应蛋白的核苷酸序列；(h) 细胞凋亡诱导因子家族的基因；(i) 血管内皮生长因子抗体的基因；(j)自杀基因；禾口(k)肿瘤坏死因子的基因中的至少一种。
9. 根据权利要求1所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒载体为选自C亚群的2型或者5型腺病毒中的至少一种。
10. 权利要求1的增殖型重组溶瘤腺病毒，其保藏日为2009年1月9日，保藏编号为CCTCC-V200903 ，保藏地点为中国典型培养物保藏中心。
11. 构建权利要求2所述的增殖型重组溶瘤腺病毒的方法，其特征在于通过基因工程方法用人类B亚群11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纤毛头氨基酸序列；且使所述病毒的至少一个增殖必需基因被突变或者被缺失而失去功能，或使所述病毒在增殖必需基因序列的转录起始位点与翻译起始位点ATG之间可操作地插入顺式作用元件，所述元件控制基因组中至少一个病毒增殖必需基因的转录。
12. 权利要求1所述增殖型重组溶瘤腺病毒载体，其作为基因的载体而用于制备基因治疗药物。
全文摘要
本发明涉及基因工程学和病毒学，尤其涉及一种含人类B亚群11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途。该腺病毒可以是11型腺病毒，也可以是用11型腺病毒纤毛蛋白的编码序列取代非11型腺病毒的纤毛蛋白编码序列而构成的杂合腺病毒。该腺病毒通过对其增殖必须基因进行的有效控制或突变而具有选择性增殖能力。作为具有更广的感染谱和改良感染能力的条件增殖型的重组病毒，本发明的重组溶瘤腺病毒可以用于基因治疗尤其是肿瘤的基因治疗。
文档编号A61P35/00GK101781636SQ20091004551
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者吴孟超, 吴红平, 李琳芳, 苏长青, 钱其军 申请人:中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院