专利名称：使用含缺损基因组片段的病毒的抗病毒保护的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒学和动物的病毒感染和疾病的预防和/或治疗，所述的动物包括鸟类和人。本发明涉及抗病毒治疗的领域。本发明进一步涉及在人类或者动物中以及在包括细胞和组织在内的人类或者动物的组成部分中激发产生先天免疫和天然的干扰素的方法。本发明还涉及缺损干扰(DI)病毒的领域，所述的缺损干扰病毒包括克隆的DI病毒。
背景技术：
正黏病毒科(Orthomyxoviridae)是感染脊椎动物的RNA病毒的科。该科包括引起流感的病毒。流感是呼吸系统的病毒感染，其特征在于发热、咳嗽和严重的肌肉疼痛。有三个属的流感病毒，通过其核蛋白和基质蛋白的抗原差异识别甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。甲型和乙型流感病毒各个含有八个单链RNA(ssRNA)的片段。所述的病毒包括主要的外部病毒颗粒蛋白，血凝素(HA)和唾液酸苷酶(NA)。甲型流感病毒属包括16种HA的亚型以及9种NA的亚型，这很可能形成全部144种可能的组合。然而，乙型流感是单个的亚型，并与甲型流感具有显著性差异。丙型流感病毒含有七个ssRNA片段，由于该病毒缺少独立的唾液酸苷酶基因(参见 Lamb, R.禾口 Krug, R. M. (1996)第 45 章；Orthomyxoviridae :The viruses and their replication-Fields Virology,第 3 版，Raven Publishers, Philadelphia)。副粘病毒科(Paramyxoviridae)的成员是在自然界中具有窄的特异性宿主范围的病毒，但是在培养的细胞中其显示出广的宿主范围。体内感染的特征包括内含体和合胞体的形成。副粘病毒感染一般地在呼吸道中开始并可以在该部位保持(例如人呼吸道合胞病毒，HRSV)或者可以传播到第二个部位(例如对于麻疹病毒(Mev)而言，淋巴和内皮组织)。一般来说，副粘病毒的感染被宿主免疫限制并消除。然而，病毒有时候可以在数周或数月的时间内在正常的，尤其地在免疫低下的个体中散发。肺炎病毒科(Paramyxoviridae)包括副粘病毒属(Pneumovirus)。该属包括牛呼吸道合胞病毒(BRSV)以及人呼吸道合胞病毒(HRSV)，其中有命名为A和B的两种亚型，以及几个病毒株如HRSV株A2、HSRV株RS-S2和BRSV株Snook。也有鼠肺炎病毒(也称作小鼠肺炎病毒PVM)。抗病毒药物是一类专门用于治疗病毒感染的药物。经常将特异性抗病毒剂用于特异性病毒。多数可用的抗病毒剂设计用于处理HIV、疱疹病毒(熟知其引起唇疱疹和生殖器疱疹，但实际上其导致大范围的疾病)，乙型和丙型肝炎病毒(其可以引起肝癌)，以及甲型和乙型流感病毒。研究者当前试图将抗病毒剂的范围扩展到其他家族的病原体中。例如金刚烷胺和金刚烷乙胺对所有的甲型流感病毒有效，而对乙型流感病毒无效。经常发现对于这些化合物有抗性的病毒。其他抗甲型和乙型流感病毒的抗病毒药物包括扎那米韦(Relenza )和奥塞米韦(Tamiflu )。然而，这些治疗的有效性在一定程度上受到限制。必须在感染之后不久开始治疗并且需要每天给予两次。抗病毒的治疗仅能将症状的持续时间减短1到3天。在患有流感的患者中，发现了越来越多的对达菲有抗性的病疫苗用于产生免疫应答以攻击病毒。传统上疫苗由经削弱的或杀死的病原体组成。最近发明出了“亚单位”疫苗，其严格地由来自病原体的蛋白靶构成。疫苗激发免疫系统，而对宿主不产生严重的危害，并且当真正的病原体攻击受试者时，免疫系统迅速对其响应并阻碍其进入体内。疫苗在与稳定的病毒导致的感染的斗争中可以是有效的，但是在治疗已经感染或者持续受感染的患者时作用有限。针对快速变异的病毒如流感的疫苗是有问题的。流感疫苗必须每年进行更新。例如针对HIV的疫苗仍然是难以捉摸的。缺损干扰(DI)病毒历史悠久。其作为甲型流感病毒制备中的自体干扰原件，由研究它们的von Magnus在二十世纪四十年代晚期和二十世纪五十年代早期(例如冯·马格努斯(von Magnus), P (1947) Ark. Kemi. Mineral. Geol, 24b 1)发现。多年来这些干扰元件以他命名。随后，当意识到这些元件几乎在病毒中普遍都发现时，其被称作DI病毒(参见例如 Huang 和 Baltimore (1970) Nature 226 :325-327)。在二十世纪七十年代，对 DI 病毒的兴趣达到了顶点，但是由于对其在体内的抗病毒活性过高的期待，随后对其兴趣减弱。全部的甲型流感病毒具有复制结构，该复制结构允许双重感染的细胞中的基因组片段进行交换(重新组合)，从而赋予这些病毒巨大的遗传可塑性。该现象导致了 1957和 1968年的流感病毒大流行。除了正常的复制过程外，在复制中发生的错误引起400-500个核苷酸(nt)的小RNA缺失80%左右的模板的核心序列，其看起来产生自聚合酶复制模板的起始部分，从模板上脱离并随后再次结合并拷贝其他的末端。这些小RNA保留了末端的复制和包装信号。它们的小的尺寸意味着与全长的RNA片段相比，可以在单位时间内制备更多的拷贝。基因组RNA的包装表现为有组织的过程，从而毒粒正好含有8个片段中每一个的一个拷贝。毒粒在缺损的和全长的RNA之间表现出没有区别，所以当缺损的RNA过量时， 它们比被它们取代的完整的基因组片段更频繁地被包装。含有缺失的基因组片段的颗粒不能正常地合成该RNA所编码的病毒蛋白质，并且是非感染性的，尽管当细胞由甲型流感病毒感染时其可以反式复制。将缺损的RNA掺入到毒粒中导致所产生的有感染性的病毒的量减少。因此携带了缺失的基因组的毒粒已知是干扰或者缺损干扰(DI)病毒。正黏病毒科的病毒由于在一个或者多个基因组片段中的内部缺失(75 80%的核苷酸)，自发地产生缺损的RNA片段。因此DI病毒的基因组是产生它的感染性病毒的基因组缺失的形式；并且与其他类型的缺损病毒核苷酸分子相比其具有一些独特的特征(参见 Dimmock. N. J. (1996)"Antiviral activity of defective interfering influenza virus in vivo"-Viral and other infections of the human respiratory tract ；S. Myint and D.Taylor-Robinson(Eds.)，Chapman & Hall)。与有活性的，即活的或者感染性的病毒相比，DI病毒尽管能够感染细胞，但仅当其基因组存在于已经被完整基因组的病毒(有时候称作“辅助病毒”)感染的细胞中时才进行复制和增殖。DI流感病毒壳体化为在尺寸和蛋白质组成上通常与感染性的辅助病毒颗粒不可区分的病毒颗粒。在重新出现之后，DI基因组迅速扩增，其浓度与感染性病毒的基因组的浓度相关， 从而在几个感染的周期中(或几代中)，种群中的DI病毒比感染性的辅助病毒更多。
DI病毒具有在细胞内干扰感染性的辅助病毒的能力，从而其能够特异性地抑制感染性的辅助病毒的增殖。体内的动物实验显示了自发产生的DI甲型流感病毒(A/equine/ Newmarket/7339/79 (H3N8))能够以足够的量保护小时免受致命的甲型流感病毒的攻击，所述的甲型流感病毒具有同源病毒(EQV)或者异源的亚型A/WSN(H1N1)或者A/ PR/8/34 (HlNl)。在这些研究中DI病毒制剂经UV处理，从而使存在的任意活的辅助病毒失去感染性。UV辐射的剂量不使DI病毒的干扰或者保护活性失活。一次的给予显示出提供长达约5天的预防。然而，这些DI甲型流感病毒制剂是异源的，并包括来自不同基因组片段的多个不明确的缺损 RNA 序列(参见 Noble 和 Dimmock (1994) Journal of General Virology 75 :3485-3491)。在鸡胚蛋中生长的DI甲型流感病毒A/WSN(HlNl)保护小鼠免受A/WSN (HlNl)的致命的攻击。鸡蛋中生长的DI病毒RNA物种和从存活的小鼠肺中提取的DI病毒RNA的比较显示，存在至少5种推断的DI RNA序列。DI病毒的这五种RNA物种中的每一种都具有内部缺失(参见 Noble &Dimmock(1995) Virology 210:9-19)。这些 RNA 分子中的四个的 3， 和5’末端看上去是完整的。Duhaut & Dimmock (2000，Virology 275 :278-285)通过将 EQV 的缺损的片段 1 的 RNA置于质粒中人类RNA聚合酶I启动子(Poll)的控制下，对其进行了修饰。这些质粒中的每一个编码约400个核苷酸的RNA，但是由于内部缺失的精确位置，保留了不同长度的5’ 和3’末端序列。使用每个质粒与编码流感病毒PB1、PB2、PA和NP蛋白质的质粒转染Vero 细胞，并将所述的细胞随后使用三种不同的辅助病毒亚型中的一种进行感染，所述的三种不同的辅助病毒亚型包括亲代的(H3N8)或者H2N2或者Hmi亚型。在细胞培养中进行系列的传代。发现在DI病毒RNA的5’末端至少150个核苷酸对于在体外进行可靠的传代而言是必要的，所述的传代在与特定的辅助病毒一起使用的各种细胞系中进行。还不能从实验上阐明非克隆的DI甲型流感病毒减少感染性病毒的产率，抑制由病毒诱导的细胞病理学，以及保护动物不遭受临床上的疾病的过程，由于DI甲型流感病毒的大多数种群均含有多种不同的缺损RNA序列，所述的多种不同的缺损RNA序列产生自不同的基因组片段以及具有多种中央缺失。因此，该缺损病毒的该非克隆种群的RNA含量不能有效地进行复制，同时还无法分析RNA序列和抗病毒活性之间的关系。Duhaut & DimmocH2002，J. Gen. Virol.迎403-411)证明了得自质粒系统的 DI 甲型流感病毒RNA显示出在细胞培养中真实地呈现。一种质粒(P0LI-317)产生了 DI病毒 RNA，所述的DI病毒RNA在体外在辅助病毒的存在下稳定复制，并强烈地抑制在该系统中辅助病毒的产生。Duhaut & Dimmock(2003，Journal of Virological Methods 108 :75-82) 给定的(例如分子克隆的)DI甲型流感病毒的制备，所述的病毒完全地产生自用于在培养中感染宿主细胞的质粒。所使用的质粒编码所述的DI RNA(H3N8或者H7N7)以及感染性的流感病毒(A/WSN，Hmi)。以这种方式产生的DI甲型流感病毒在鸡胚蛋中传代一次，并随后在辅助病毒(HlNl)的存在下接种小鼠。克隆的DI病毒在小鼠的肺中完整地繁殖。也测试了克隆的DI病毒(在没有感染性的辅助病毒时)，在小鼠中针对致命的(HlNl)的攻击的任意保护效果。观察到了一些非常弱的并且短暂存在的预防效果，但是这只是推迟了小鼠的临床症状和死亡的发生。Noble等人Q004，Vaccine 22 :3018-3025)报道了使用自然存在的(也即异源的和不明确的)DI甲型流感病毒制剂(EQV H3N8)对小鼠的体内研究。发现向小鼠给予此DI 病毒制剂产生一段时间的预防性保护，并且同时将其他致命的感染转化为无毒力的和免疫的感染。Dimmock & Marriott ^006，Journal of General Virology 87 :1259-1265)描述了不正常的现象，其中异源及未确定的DI甲型流感病毒制剂牢固地保护小鼠免于发生由 A/PR/8/34 (HlNl)和A/WSN/40 (HlNl)病毒引起的致命疾病，并且仅最低限度保护小鼠免于发生A/Japan/305/57 (A/Jap H2H2)引起的疾病。发现与A/PR8相比，A/Jap需要300倍以上的感染单位才导致小鼠临床疾病。改变并测试了 DI病毒和攻击病毒的比例。得到的结论是，DI病毒的效力取决于攻击病毒的感染剂量，而不是其导致疾病的剂量。Mann 等人 0006，Vaccine 24，4290_似96)测试了异源的和不明确的 DI A/EQV RNA，其是在雪雕中由A/PR8再活化的。DI甲型流感病毒施用两剂量，随后使用感染性的A/ Sydney 5/97 (H3N2)进行攻击。经DI病毒处理的雪雕仅显示出偶尔的和轻度的临床症状， 与此相比对照的动物发生严重疾病。US2006/0057116A1 (Kawaoka和Neumann)描述了质粒和在任何辅助病毒都不存在下转染和培养细胞以在体外产生重组的甲型流感病毒的方法。具体地，可以在受感染的细胞系中，完全通过甲型流感病毒的克隆的cDNA制备甲型流感病毒。可以将突变掺入到任意的基因片段中。W02006/051069 (Solvay Pharmaceuticals禾口 Erasmus University)中公开了有条件地缺损的流感病毒颗粒及制备其的方法。从转染的细胞的起始点无法产生用作疫苗的大量的缺损流感病毒，本说明书中教导了替代的方法。该方法涉及由质粒转染的细胞，所述的质粒编码流感病毒的七个RNA片段但是缺少表达聚合酶蛋白质的第八个片段。该细胞包括第二个表达质粒，所述的质粒携带缺失聚合酶基因的序列。当表达时，该经转染的细胞产生了“有条件地”缺损的病毒颗粒，所述的缺损病毒颗粒仅能够在表达缺损的基因组中不存在的聚合酶蛋白质基因的细胞系中复制。所述的缺损流感病毒颗粒仅能够在适合的，即使不是补全性的宿主动物或者细胞中复制一次。预期将有条件地缺损的病毒颗粒用作疫苗或者用作基因递送的目的，并且因此有利的是，病毒颗粒制剂在正常细胞中不能复制并且不含野生型或者辅助病毒。尽管描述了用于制备经克隆的甲型流感病毒(其结果是在小鼠中仅有一次微弱的保护)的原型系统(参见Duhaut & DimmOck，2003 supra)，但该原型系统并未提供用于制备对于进行进一步实验室研究而言必要量的克隆的DI病毒的实际途径，更不用说提供在常规的情况下，为了进行动物和人类的临床试验或者在常规的、流行性的或者大流行的情况下用于预防和/或治疗所需的克隆的DI病毒的量。Huang, A. S. & Baltimore, D. (1970)“ Defective viral particles and viral disease processes" Nature (Lond) 226, 325-327.本综述文章在第 325 页描述了对于裂谷热病毒(Rift Valley fever virus)、水疱性口炎病毒、鸡瘟病毒、猿猴病毒40、多瘤病毒、 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、仙台病毒、猿猴病毒5和脊髓灰质炎病毒，如何通过使用高的多样性(或者未稀释的传代病毒)感染细胞或者动物组织来实现DI颗粒的合成。
Holland, J. J. (1990) “ Defective viral genomes" Virology，第二版.第 151-165 页.由 B. N. Fields & D. Μ. Knipe 编辑.New York Raven Press.在这篇综述文章中，第155页描述了细胞培养物(或者鸡蛋或者动物)中，一系列的未稀释病毒的传代对于任意病毒的DI颗粒的产生而言如何仍然是选择的方法。Nayak, D. P. ， Chambers, Τ· Μ· & Akkina， R. K. (1985) “ Defective-inte rfering(DI)RNAs of influenza viruses :origin, structure, expression and interference" Current Topics in Microbiology and Immunologyll4,103-151 是证实了通过按顺序的独立非稀释的病毒传代，生产DI病毒的综述文章。W02007/135420 (University of Warwick)描述了用于生产前文中不可得到的，足量的经克隆的DI甲型流感病毒的方法，所述的病毒预防或者治疗人类和动物，包括鸟类的甲型流感病毒感染中用于实验或者临床使用。还描述了经克隆的甲型流感病毒作为甲型流感病毒感染的预防性或者治疗性处理的医学用途。经鉴定所述的DI甲型流感病毒对相同的或者不同株的感染性甲型流感病毒具有抗病毒效果。针对人类和动物中的病毒感染的范围治疗，尤其是针对没有可用的现有的抗病毒治疗的病毒，针对显示出快速的变异的病毒，或者针对可能对现有的抗病毒药物有抗性的病毒，以及针对新发现的或者欠缺表征的病毒，仍然需要提供抗病毒。本发明人做出了意想不到的发现，即经克隆的人类DI甲型流感病毒保护免受不同的(异源的)病毒的感染。更具体地，本发明人发现了人类的DI甲型流感病毒保护小鼠免受鼠肺炎病毒(PVM)的致命攻击。本发明人还出人意料地发现了经克隆的DI甲型流感病毒能够保护小鼠免受感染性乙型流感病毒的致命攻击。这是未预料到的发现，由于尽管甲型和乙型流感病毒属于同一病毒科的不同的属，但其在遗传学上不相互作用。本发明人做出了进一步的，预料不到的发现，也就是施用给小鼠的经克隆的DI甲型流感病毒导致天然干扰素产生的激发。不希望受到任意具体理论的约束，本发明人相信经克隆的DI病毒可以针对异型病毒发挥其抗病毒效果的机制是通过在经克隆的DI病毒的施用部位激发局部天然干扰素的产生。相应地，在一个方面本发明提供经克隆的缺损干扰(DI)病毒，所述的病毒用于预防或者治疗个体中的病毒感染或者疾病，其中所述的感染或者疾病由与所述DI病毒来源的病毒不同的病毒引起。经克隆的DI病毒包括具有单链RNA的那些病毒，以及为双链RNA、单链DNA或者双链DNA的那些病毒。在另一个方面，本发明提供经克隆的缺损干扰(DI)病毒，所述的病毒用于预防或者治疗由甲型流感之外的病毒引起的感染或疾病。与所述DI病毒来源的病毒不同的病毒优选地是其他病毒的野生型株。例如如果 DI病毒是DI甲型流感病毒，那么所述的不同病毒是人类呼吸道合胞体病毒(HRSV)。用于本发明中的经克隆的DI病毒材料优选地为从DNA或者RNA核酸序列的意义上来说基本上单一的。通过序列％—致性测定，可以提供单一性可以大于95-99. 9%和 100%遗传单一性的百分比。预防的(预防性的)和治疗的处理(即当临床上的症状明显时感染之后)在本发明的范围内是可能的。当有疑似病毒感染仍然是轻度症状时，可以给予治疗处理。
根据本发明，所预防或者治疗的感染或者疾病可以是由呼吸道或者全身性病毒引起的疾病。该感染或者疾病可以由副粘病毒科的病毒引起，例如肺炎病毒属，例如人类呼吸道合胞病毒(HRSV)。所述的感染或者疾病可以由偏肺炎病毒属(Metapneumovirus)引起，例如人类偏肺炎病毒(HMPV)。在本发明的其他方面，所述的感染或者疾病可以由正粘病毒科的病毒引起，例如乙型流感病毒或者丙型流感病毒。在本发明的又一个方面，所述的感染或者疾病可以由肝炎病毒或者肝病毒科的病毒引起，例如乙型肝炎病毒(HBV)。所述的感染或者疾病可以由黄病毒科的病毒引起，例如丙型肝炎病毒属。该病毒可以为丙型肝炎病毒(HCV)。在本发明的再个方面，所述的感染或者疾病可以由乳头瘤病毒科，如乳头瘤病毒属引起。导致所述感染或者疾病的病毒可以是针对人类或者其他的动物(包括鸟类、爬行类或者两栖类)有感染性的病毒。根据本发明，经克隆的DI病毒可以通过单个的人或者动物的鼻子和/或通过肺给予。可选地，所述的经克隆的DI病毒可以经肠道外给予，例如经皮下、肌内、静脉或者腹腔注射给予。本发明还提供了激发先天免疫和细胞、组织、器官或者人类或者动物中产生天然干扰素的方法，所述的方法包括将干扰素诱导剂量的缺损干扰(DI)病毒给予细胞、组织、 器官、人类或者动物，前提是当DI给予细胞培养物中的细胞时，所述的DI病毒不是具有“返折(copyback) ”或者“快速复性(snaphck) ”的RNA结构的RNA病毒。在本发明的该种方法中，当将DI病毒给予细胞培养物中的细胞时，DI干扰病毒优选地不是DI水泡性口炎病毒或者DI仙台病毒。本领域的技术人员使用已知的分析，容易地测量天然干扰素产生的激发。所产生的干扰素可以是任意的天然可诱导I型干扰素也就是I型干扰素(IFN)，并主要地为 IFN- α t 禾口 IFN-β (Theofilopoulos, Α. N.，Baccala, R.，Beutler, B. and Kono, D. H. 2005 Type I interferons ( α / β ) in immunity and autoimmunity. Annual Review of Immunology 23,307-336)。根据本发明在激发先天免疫和天然干扰素产生中，所述的DI病毒优选地为经克隆的DI病毒。更具体地天然干扰素的激发可以采取宿主具有复制能力的的辅助病毒。在进一步的这样的实施方案中，经克隆的DI病毒与辅助病毒的关系上，可以是不同的毒株或者可以是异型的。当激发干扰素产生时，则需要在期待的抗病毒效果之前给予DI病毒。这是由于在给予和身体产生反应从而使细胞产生干扰素之间有延迟。通常地观察到M小时的延迟，以及因此优选地在期待水平的干扰素生产之前的约M小时，或者更长时间之前给予。本发明因此也包括在个人或者动物中，预防或者处理病毒性感染的方法，所述的方法包括将诱导干扰素的量的缺损干扰(DI)病毒给予个体。
在本发明的这个方面，DI病毒优选地可以通过个体的鼻子和/或通过肺给予，尽管由肠道外给予，例如经皮下、肌内、静脉或者腹腔注射给予是可能的。根据本发明前述的方法，DI病毒可以不直接地给予个体，但是另外地或者可选地， 可以从人类或者动物体中分离出细胞、组织或者器官，即离体和/或在体外，使用DI病毒处理，从而诱导干扰素的产生，并随后将其重新引入或者移植到同一个或者其他的受体个体， 或者相同的或类似的血型或组织类型的个体内。根据本发明前文所限定的所有方面，所述的DI病毒可以是DI流感病毒，优选地是 DI甲型流感病毒，或者DI塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus) 0本发明人因此提供基于缺损干扰病毒的抗病毒药以及抗病毒治疗，所述的缺损干扰病毒具有针对异形(即不同的)病毒在任意宿主中的感染提供保护的能力。例如，在治疗肺的病毒感染时，抗病毒药物优选地通过鼻内给药递送到呼吸道的细胞。其他的给药途径包括经粘膜、肺和口腔。其他的途径包括通过口服的肠胃道给药。经克隆的DI病毒的优点在于，可以治疗已知或者怀疑由任意病毒感染的个体的感染，甚至当感染的症状还未观察到或者尚未诊断的感染。当怀疑有感染时，可以立刻向所述的个体给予经克隆的DI病毒药物。也可以在与已知或者怀疑由所述的病毒感染的同种或者不同种的个体接触之后，立即处理个体。有利地，据信保护不涉及适应性免疫应答，并且其由单独给予经克隆的DI病毒而不需要给予感染性的辅助病毒来实现。因此不需要传统的疫苗(其依靠B细胞和T细胞导向的免疫应答从而产生保护性的效果)一样在感染之前像单独给予经克隆的DI病毒，尽管M小时前用DI病毒进行预处理是有利的。依照本发明的药物能以预防的形式给予个体。所述的药物所给予的个体可以是动物或者人类，优选地其中动物选自猪、马、狗、 猫或者鸟(野生的或者驯养的)。在鸟类的情况下，无论是野生的或者驯养的，所述的药物可以方便地通过口服给药，例如将药物掺入到饮用水或者食物中。在鸟类物种的情况下，优选的经驯养的物种包括例如鸭、鹅、火鸡或者母鸡，例如肉鸡。与本发明一致的剂量方案可以由药物的单次给药组成。药物中的经克隆的DI病毒的量可以用定量RT-PCR进行测定。采用了对于缺失的RNA或者DNA片段有特异性的探针和/或引物。在药物中，经克隆的DI病毒的量可以为(每剂)lng-10yg病毒的量级(按照总病毒蛋白质进行测定)。DI病毒的量可以在0.05yg-10yg的范围内。优选的实施方案包括 0. 01-0. 1 μ g、0. 01-1 μ g 或者 0. 01-10 μ g 的病毒蛋白，更优选地 IOng, IOOng, 1 μ g 或者 10 μ g的病毒蛋白。当DI甲型流感病毒用作与本发明一致的药物的基础时，药物中所述的经克隆的DI病毒的量可以在每剂0. 05-5000HAU的范围内，优选地在选自0. 1-100,0. 5-50或者 1-10HAU 的范围内。其他可能的范围包括 0. 05-10HAU.0. 1-50HAU、1-100HAU 和 1-5000HAU。经克隆的DI病毒的量，无论是以每剂中HAU还是μ g病毒蛋白进行测量，都可以根据受试者进行变化。例如，马可以需要4X人类的剂量，而鸟可以需要1/10的人类的剂量。在经克隆的DI病毒中的缺损核酸与其来源的基因组片段相比，可以具有至少一处缺失，尽管片段1中可以发生多个部分的缺失。所述的缺失可以由多个连续的核苷酸隔开。与其来源的基因组片段相比，所述的缺损核苷酸的序列可以包括一处或者多处的核苷酸的改变。这些可以包括不同的置换核苷酸，缺失的核苷酸或者插入的额外的核苷酸。包括缺失的基因组片段的5’或者3’末端优选地是完整的。在更优选的实施方案中，所述的片段是片段1。缺失的效果是，毒粒RNA片段的5’端具有至少150、200或者220 个核苷酸。优选地，所述片段的5，末端具有150-500个，更优选地150-250，或者150-220 范围内的多个核苷酸。就3，末端而言，剩余的(未缺失的)部分包括至少20、50、100、200、300、400或者500个核苷酸。片段1的3，末端可以具有20-600、30-550、40-500、50-450、60-400或者 75-250的范围内的多个(未缺失的)核苷酸。所述的片段缺失可以为至少50%的核苷酸，优选地至少75%的核苷酸，更优选地至少80%的核苷酸。为了在RNA片段中进行有效的缺失，可以缺失至少一个核苷酸。在更优选的实施方案中，所述的缺失可以由至少3、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、 400、500、750、1000、1500、3000或者5000个的核苷酸组成，优选地为连续的核苷酸。在同一
RNA片段中，多个缺失是可能的。本发明因此提供药物组合物，所述的药物组合物包括前文所述的经克隆的DI病本发明的适用于给予的药物组合物包括无菌的水或者非水溶液、悬浮液和乳液中的DI病毒。所述的组合物可以进一步地包括如现有技术中已知的助剂或者赋形剂，参见例如 Berkow 等人，The Merck Manual, 16th edition Merck & Co. ，Rahman, NJ(1992), Avery' s Drug Treatment Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics,第三版，ADIS Press, Ltd. , Williams and ffilkins, Baltimore, MD(1987)& Osol(ed. ), Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. , Easton, PA 1324-1341 (1980) 0本发明的组合物优选地以单个剂量(单位剂量)的形式存在。用于口服给药的液体剂型通常可以包括含有所述液体剂型的脂质体的溶液。适合悬浮脂质体的形式包括乳剂、悬浮液、溶液、糖浆和含有惰性稀释剂的酏剂，所述的惰性稀释剂是本领域中通常使用的，如经纯化的水。与惰性稀释剂一样，典型的组合物还可以包括佐剂、润湿剂、乳化和悬浮剂或者甜味、调味或者芳香剂。当本发明的组合物或者药物用于给予个体时，其可以进一步地包括盐、缓冲液或者其他的物质，所述的物质旨在改进组合物的效力。优选的组合物或者药物用于黏膜递送。在可采取的不同的黏膜递送选择中，鼻内的途径是最富操作性的，由于其以相对简单的已经大量生产的设备容易实现。本发明的组合物因此优选地改造为和/或包装用于鼻内给药，例如通过鼻喷雾剂，滴鼻剂，凝胶或者粉末(参见 Almeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 这455-467 和 Agarwal & Mishra(1999)Indian J. Exp. Biol. 37 :6-16)。其他可能用于黏膜递送的途径包括口腔、胃内、肺和肠途径。本发明的组合物可以改造为和/或包装用于黏膜给药(例如，参见Walker (1994)Vaccinel2 =387-400, Clements (1997) Nature Biotech. 15 :622-623 & McGhee 等人.(1992) Vaccine 10 :75-88) 对于口腔给药，可以提供片剂或者胶囊(可选地为肠溶包被的)。可选地，液体、转基因移植材料、滴剂、吸入剂、气雾剂、肠溶衣、栓剂、阴道栓剂等 (# B Michetti (1998) J. Gastroenterol. [Supp 1 X] :66-68 VX R Vaccine design :thesubunit and adjuvant approach 17 eds. Powell &Newman, Plenum Press 1995)。本发明的组合物可以通过肠胃外的途径给药。所述的肠胃外的途径包括静脉、肌内、皮下、真皮内、上皮(印icutantous)/透皮(transdermal)或者腹腔给药。可以使用不同类型的肠胃外剂型，包括溶液、胶束分散剂、乳剂、包合复合物(环糊精)、脂质体和悬浮液。无论使用何种递送途径，本发明的组合物或者药物优选地为单位剂型。可以按常规确立有效的剂量。例如，用于注射或者鼻内使用的组合物的典型人类剂量为0. 1-0. 5ml 体积之间，例如两剂100μ ι喷雾剂，每鼻孔一剂。本发明的组合物优选地是无菌的，并且优选地不是致热的。在更高的浓度下，DI甲型流感病毒组合物可以是致热的或者显示出残留的致热活性。所述的组合物优选地是经缓冲的，例如缓冲到ΡΗ6. 5到ρΗ8之间，一般地在ρΗ7左右。W02006/041819 (Medimmune)中描述了经鼻给药的有利的形式。本发明还包括将感染受试者的强毒病毒转化为无毒病毒感染的方法，其包括向受试者给予有效量的经克隆的DI病毒。克隆的DI病毒颗粒可以在感染之前、与感染同时或者在感染之后施用。本发明还包括将感染受试者的强毒病毒转化为无毒病毒感染的方法，所述的无毒病毒感染针对感染病毒接种受试者，所述方法包括向受试者施用克隆的DI甲型流感病毒。所述的受试者可以，或者可以被怀疑由给定的病毒感染。在实际上的，或者甚至怀疑的感染的情况下，可以在个体被感染，或者怀疑被感染之后尽快地，在48小时之内，优选地在M小时之内给予经克隆的DI病毒。类似地，如果个体短暂地暴露于感染性的病毒中， 不管是从受感染的人类、动物还是鸟类，可以向所述的个体给予经克隆的DI病毒作为预防性措施。必须处理已知或者怀疑受到致病性病毒感染的动物或鸟类尸体或者处理人类尸体的人，尤其是在流行或者大流行的情况下，可以给予本发明的所述经克隆的DI病毒。这样的人可以在暴露于病毒的风险之前即刻给予本发明的药物作为预防基础。与疫苗的使用不同，没有必要知道感染性的病毒的特性。在前文中描述的本发明的各个方法中，所述的经克隆的DI病毒足量地给予。辅助病毒可以是该病毒相对应的任意毒株，无论是来自人或者其他的动物，包括鸟类。在感染后长达M小时以及此后，经克隆的DI病毒也提供保护。因此可以对抗实际的感染。因此可以将其用作被感染的个体的家庭或其他直接接触的处理使用。经克隆的DI病毒容易给予。可以简单地将含有所述的DI病毒的一滴盐水喷入鼻中。已经用于一些疫苗的气雾剂给药提供了另一种简单的给药途径。所述的经克隆的DI 病毒为驯养的动物提供了有用的治疗，例如通过饮用水。本发明在此参考实施例及附图进行详述，其中
图1是凝胶的照片，其显示了鸡蛋的尿囊液中含有的224 RNA的RT-PCR，所述的鸡蛋接种了表1和2中所描述的甲型流感病毒DI 244/PR8和感染性乙型流感病毒的混合物。 M = DNA 分子量标准；A = 1/10DI+B/Lee ；B = 1/100DI+B/Lee ；C = 1/1000DI+B/Lee ；D = 1/10，000DI+B/Lee ；E = B/Lee ；F = 1/10DI ；G =盐水。图2A是数据的绘图，其显示了不同剂量的PVM对于C3H/He-mg小鼠的作用(每组 4只小鼠)。
图2B是数据的绘图，其显示了不同剂量的PVM对于BALB/c小鼠的作用(每组4 只小鼠)。图3是数据的绘图，其显示了未经稀释的DI甲型流感病毒针对PVM对C3H/He-mg 小鼠攻击的保护作用。图4是数据的绘图，其显示了经稀释的DI甲型流感病毒针对PVM对C3H/He-mg小鼠攻击的保护作用。图5是数据的绘图，其显示了 DI甲型流感病毒介导的针对PVM对C3H/He-mg小鼠的攻击的保护作用的持续时间。在使用DI甲型流感病毒处理之后6天，攻击小鼠。图6是数据的绘图，其显示了针对PVM对C3H/He-mg小鼠的攻击，提供保护的DI 甲型流感病毒的水平。图7是来自另一个试验的进一步数据的绘图，其显示了针对PVM对C3H/He-mg小鼠的攻击，提供保护的DI甲型流感病毒的水平。图8是来自另一个试验的进一步的数据的绘图，其显示了所提供的保护的持续时间。如图所示，在使用DI甲型流感病毒处理小鼠之后第1或者3天，用PVM攻击小鼠。图9是数据的绘图，其显示了在PVM攻击之前或者之后使用DI甲型流感病毒进行处理而引起的小鼠的组体重随时间如何变化。图10显示了在使用纯的DI甲型流感病毒进行小鼠鼻内接种后的第1天，基于肺 (L)和血清( 样品进行的干扰素的检测结果。在感染之后第6天读出中性红染色的细胞的0D。“病毒”指在检测中塞姆利基森林病毒的存在。图11显示了在图10和表10使用的同一个微滴定板上，对照的β干扰素的滴定曲线。图12显示了在产生表15中的数值的同样的滴定板上，对照的β干扰素的测量值的标准曲线。本发明人进行了试验，并出乎意料地发现了一些甲型流感的DI病毒为小鼠提供一定程度的免受乙型流感病毒感染的保护。发现针对乙型流感病毒测试的DI病毒的效力的量级是244/PR8 = 220/Vic > 220/PR8g卩 244/PR8 和 220/Vic 比 220/PR8 更有效。然而，针对甲型流感病毒(参见下表1和2~)测试的DI病毒的效力的量级是244/PR8 > 220/Vic = 317/Vic > 220/PR8即244/PR8和220/Vic针对甲型和乙型流感病毒是最有效的，并且220/PR8是效果最差的。使用317/Vic的测试未完成。然而，如果在感染乙型流感病毒之前M小时给予DI甲型流感病毒，则发现针对乙型流感病毒的DI病毒的效力的量级是244/PR8 > 220/PR8S卩，在这些情况下，244/PR8再一次地是最有效的并且220/PR8是效果最差的。表1. 244/PR8和244/WSN的DI曱型流感病毒针对A/WSN的保护的总结 标出了最低的有效剂量。
权利要求
1.用于预防或者治疗个体中的病毒感染或者疾病的经克隆的缺损干扰(DI)病毒，其中所述的感染或者疾病由与DI病毒来源的病毒不同的病毒引起。
2.用于预防或者治疗感染或者疾病的经克隆的缺损干扰(DI)甲型流感病毒，其中所述的感染或者疾病由甲型流感之外的病毒引起。
3.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由呼吸道或者全身性的病毒引起。
4.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由副粘病毒科的病毒引起。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述的感染或者疾病由肺炎病毒属的病毒，例如人类呼吸道合胞病毒(HRSV)引起。
6.如权利要求4所述的用途，其中所述的感染或者疾病由偏肺炎病毒属的病毒，例如人类偏肺炎病毒(HMPV)引起。
7.如权利要求1或者权利要求2中所述的用途，其中所述的病毒是正粘病毒科的病毒。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述的感染或者疾病由乙型流感病毒或者丙型流感病毒弓I起。
9.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由肝脱氧核糖核酸病毒科的病毒引起。
10.如权利要求1、2或者9中任一项所述的用途，其中所述的病毒是肝炎病毒。
11.如权利要求9或者权利要求10所述的用途，其中所述的病毒是乙型肝炎病毒 (HBV)。
12.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由黄病毒科的病毒弓I起。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述的病毒是丙型肝炎病毒属的病毒。
14.如权利要求10或者权利要求12所述的用途，其中所述的病毒是丙型肝炎病毒 (HCV)。
15.如权利要求1或者权利要求2所述的用途，其中所述的感染或者疾病由乳头瘤病毒科的病毒，例如乳头多瘤空泡病毒属的病毒引起。
16.如前述任一项权利要求所述的用途，其中所述的引起感染或者疾病的病毒是人类病毒。
17.如前述任一项权利要求所述的用途，其中所述的经克隆的DI病毒通过个体的鼻子和/或肺给予。
18.如权利要求1到14中任一项所述的用途，其中所述的经克隆的DI病毒经肠胃外， 例如经皮下、肌内、静脉或者腹腔给予。
19.一种激发细胞、组织、器官或者人类或者动物中产生先天免疫和天然干扰素的方法，所述的方法包括将诱导干扰素的量的缺损干扰(DI)病毒给予细胞、组织、器官、人类或者动物，前提是当DI病毒给予细胞培养物中的细胞时，所述的DI病毒不是具有返折的RNA 结构的RNA病毒。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述诱导干扰素的量的DI病毒在体外或者离体下给予经分离的细胞、组织或者器官。
21.如权利要求19或者权利要求20所述的方法，其中当将DI病毒给予细胞培养物中的细胞时，所述的DI病毒不是DI水泡性口咽病毒或者DI仙台病毒。
22.如权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述的DI病毒是经克隆的DI病
23.一种用于在个体的人类或者动物中预防或者治疗病毒感染的方法，其包括向个体给予诱导干扰素的量的缺损干扰(DI)病毒。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述的DI病毒通过个体的鼻和/或通过肺给予。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述的DI病毒经肠胃外，例如经皮下、肌内、静脉或者腹腔给予。
26.如权利要求23所述的方法，其中在体外将所述DI病毒给予经分离的细胞、组织或者器官，并将所述的细胞、组织或者器官随后移植到所述的个体的身体中。
27.如权利要求23到沈中任一项所述的方法，其中所述的病毒感染选自以下的一种或多种a.呼吸道或者全身性的病毒；b.副粘病毒科的病毒；c.肺炎病毒属的病毒，例如人类呼吸道合胞病毒(HRSV)；d.偏肺炎病毒属的病毒，例如人类偏肺炎病毒(HMPV)；e.正粘病毒科的病毒，例如乙型流感病毒或者丙型流感病毒；f.肝脱氧核糖核酸病毒科的病毒，例如乙型肝炎病毒(HBV)；g.黄病毒科的病毒，例如丙型肝炎病毒(HCV)；h.乳头瘤病毒科的病毒，例如乳头多瘤空泡病毒属的病毒。
28.如权利要求19到27中任一项所述的方法，其中所述的DI病毒是DI流感病毒，优选地是DI甲型流感病毒，或者DI塞姆利基森林病毒。
全文摘要
本发明涉及病毒学和病毒感染和动物疾病的预防和/或治疗，所述的动物包括鸟类和人。本发明涉及抗病毒治疗的领域。本发明进一步涉及在人类或者动物中以及在包括细胞和组织的人或者动物的组成部分中激发产生先天免疫和天然的干扰素的方法。本发明还涉及缺损干扰(DI)病毒的领域，所述的缺损干扰病毒包括克隆的D1病毒。
文档编号A61K35/76GK102256611SQ200980149732
公开日2011年11月23日 申请日期2009年12月8日 优先权日2008年12月12日
发明者A·伊斯顿, N·迪莫克 申请人:沃里克大学