含有TelomelysinGFP基因的重组病毒的制作方法

专利名称：含有Telomelysin GFP基因的重组病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种癌细胞检测用或癌诊断用试剂以及细胞死亡诱导剂。
背景技术：
在癌化细胞或无限增殖化细胞株中，端粒末端转移酶活性增大的频率高，在生殖细胞系、血球细胞系、上皮细胞系等以外的正常体细胞中却几乎检测不到端粒末端转移酶的活性。因此，现已尝试了以端粒末端转移酶活性作为指标检测癌(Shay JW，Zou Y，Hiyama E，Wright WE.Telomerase and cancer.Hum Mol Genet 10(7)677-85，2001)。
另一方面，正在图像诊断领域中正尝试进行在生物体中检测癌组织和转移淋巴结的研究。例如，现已报道了利用PET的生物学的诊断和运用神经网络的图像分析等。此外，也有一些关于限制增殖型病毒的抗肿瘤活性和安全性的研究报告(DeWeese TL，van der Poel H，LiS，Mikhak B，Drew R，Goemann M，Hamper U，DeJong R，Detorie N，Rodriguez R，Haulk T，DeMarzo AM，Piantadosi S，Yu DC，Chen Y，Henderson DR，Carducci MA，Nelson WG，Simons JW.A phase I trialof CV706，a replication-competent，PSA selective oncolytic adenovirus，for the treatment of locally recurrent prostate cancer followingradiation therapy.Cancer Res 61(20)7464-72，2001)，本发明人通过使具有端粒末端转移酶的启动子并具有增殖能力的病毒感染癌细胞，发现通过病毒增殖可以使癌细胞死亡Kawashima T，Kagawa S，Kobayashi N，Shirakiya Y，Umeoka T，Teraishi F，Taki M，Kyo S，Tanaka N，Fujiwara T.Related Articles，Links Abstract Telomerase-specific replication-selective virotherapy for human cancer.Clin CancerRes 10(1)285-92，2004)。
但是，由于靶向癌细胞的困难，还没有开发出手术中进行原位癌检测的系统。此外，至今为止还没有在病毒感染生物体的情况下的癌细胞内，动态地、实际使癌组织可视化的研究。
发明的公开如上所述，一直希望开发出生物体内可视化的癌细胞检测用或癌诊断用试剂，和细胞死亡诱导剂。
本发明人为了解决上述问题，进行了积极的研究，结果，通过在病毒基因组的E3区域中整合编码荧光标记蛋白质的基因，在E1区域整合按以下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子，E1A基因，IRES序列和E1B基因的复制盒，发现通过使两个盒(cassette)表达，可以以极高密度检测癌细胞，并且可以在生物体内进行检测，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)一种癌细胞检测用试剂，其含有一种重组病毒，所述病毒基因组的E1区域中整合了按如下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的复制盒，并且病毒基因组的E3区域中整合了含有编码标记蛋白质的基因以及可以调控该基因的表达的启动子的标记盒。
(2)一种癌诊断用试剂，其含有一种重组病毒，所述病毒基因组的E1区域中整合了按如下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的复制盒，并且病毒基因组的E3区域中整合了含有编码标记蛋白质的基因以及可以调控该基因的表达的启动子的标记盒。
在上述(1)和(2)中，这些试剂，可以用于体内检测、诊断或导航手术。作为上述的人端粒末端转移酶启动子，可以例举，如hTERT启动子，作为标记蛋白质，例如GFP。作为可以调控该编码标记蛋白质的基因的表达的启动子，可以使用例如，巨细胞病毒启动子或hTERT启动子。进而，作为病毒，例如腺病毒。
(3)一种细胞死亡诱导剂，其含有一种重组病毒，其中所述病毒基因组的E1区域中整合了按如下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的复制盒，并且病毒基因组的E3区域中整合了含有编码标记蛋白质的基因以及可以调控该基因的表达的启动子的标记盒。
此时，人端粒末端转移酶的启动子也可以是hTERT启动子。此外，作为细胞死亡诱导相关蛋白质，例如有免疫相关蛋白质、细胞凋亡诱导蛋白质、和端粒末端转移酶相关蛋白质。进而，作为免疫相关蛋白质，可以例举如PA28，作为细胞凋亡诱导蛋白质，可以例举如TRAIL，作为端粒末端转移酶相关蛋白质，可以例举如AU5。此外，可以调控细胞死亡诱导相关蛋白质的表达的启动子可以是巨细胞病毒启动子或hTERT启动子，而且所述病毒可以是腺病毒。作为本发明的细胞，也可以使用癌细胞。
(4)一种癌细胞的检测方法，其特征在于使上述(1)的试剂感染癌细胞，检测由所述癌细胞发出的荧光。
(5)一种癌的诊断方法，其特征在于使上述(2)的试剂感染癌细胞，检测由所述癌细胞发出的荧光。
(6)一种诱导靶细胞的细胞死亡方法的方法，其特征在于使上述(3)的诱导剂感染该靶细胞。
附图的简要说明

图1是表示Telomelysin-GFP结构的图。
图2是表示非增殖性病毒的增殖的图。
图3是表示在体外通过Ad-GFP共感染进行的癌细胞的检测结果的图。
图4是表示在体内通过Ad-GFP共感染进行的人癌组织的检测结果的图。
图5是表示通过Telomelysin-GFP感染人肺癌细胞产生的形态学的变化的图。
图6是表示通过Telomelysin-GFP感染人肺癌细胞产生的GFP荧光表达的图。
图7是表示通过定量的实时PCR确定的Telomelysin-GFP增殖的图。
图8是表示通过Telomelysin-GFP感染人大肠癌细胞产生的GFP荧光表达的图。
图9是表示通过定量的实时PCR确定的Telomelysin-GFP增殖的图。
图10是表示由Telomelysin-GFP感染正常人肺成纤维细胞(NHLF)产生的形态学变化的图。
图11是表示由Telomelysin-GFP感染正常人肺成纤维细胞(NHLF)产生的GFP荧光表达的图。
图12是表示通过定量的实时PCR确定的Telomelysin-GFP增殖的比较的图。
图13是表示通过荧光成像观察的Telomelysin-GFP的肿瘤内增殖·复制的图。
图14是表示通过荧光成像观察的Telomelysin-GFP的肿瘤内增殖·复制的图。
图15是表示通过荧光成像观察的Telomelysin-GFP的淋巴结转移模型中肿瘤内增殖·复制的图。
图16是表示使用裸鼠和HT29人大肠癌细胞的原位(orthotopic)直肠癌模型中的组织学的分析的图。
图17是表示使用裸鼠和HT29人大肠癌细胞的原位直肠癌模型中的剖腹所见的图。
图18是表示通过荧光成像观察的表示HT29直肠肿瘤和主动脉旁淋巴结中Telomelysin-GFP的肿瘤内增殖·复制的图。
图19是表示通过荧光成像观察的主动脉旁淋巴结中Telomelysin-GFP的肿瘤内增殖·复制的图。
图20是表示通过荧光成像观察的主动脉旁淋巴结中Telomelysin-GFP的肿瘤内增殖·复制的图。
用于实施发明的最佳方式以下，对本发明进行详细的说明。
记载于本说明书中的参考文献并入本说明书作为参照。
1.癌细胞检测用试剂和检测方法本发明涉及人癌细胞检测用试剂，其含有一种重组病毒，该病毒基因组的E1区域中整合了按如下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的复制盒，并且病毒基因组的E3区域中整合了含有编码标记蛋白质的基因以及可以调控该基因的表达的启动子的标记盒。此外，本发明涉及癌细胞的检测方法，其特征在于使所述试剂感染癌细胞，检测由所述癌细胞发出的荧光。在本发明中，所谓“重组病毒”是指其基因组中整合了后述的复制盒和标记盒的病毒。可以使用的病毒没有特别的限定，但是从安全性等方面出发，优选腺病毒。此外，即使在腺病毒中，从使用方便等方面考虑，更为优选5型腺病毒。
本发明中使用的重组病毒在相当于腺病毒基因组的E1区域的区域中整合了复制盒，并且在相当于腺病毒基因组的E3区域的区域中整合了标记盒。复制盒是按如下顺序含有人端粒末端转移酶启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的盒，由人端粒末端转移酶启动子驱动E1A基因、IRES序列和E1B基因，癌细胞特异性和端粒末端转移酶特异性增殖·复制。此外，标记盒是含有启动子和编码标记蛋白质的基因的盒，由例如CMV(巨细胞病毒)启动子或hTERT启动子驱动编码标记蛋白质的基因(图1)。
“端粒末端转移酶启动子”决定端粒末端转移酶的转录起始部位，直接调节其频率。所谓端粒末端转移酶，是拮抗真核生物染色体复制时的收缩，维持端粒长度的酶。这种端粒末端转移酶启动子的种类，只要是与用于表达靶基因的病毒相适应的启动子即可，没有特别的限定，但是优选，例如人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)的启动子。确认在hTERT 5’末端上游1.4kbp的区域中有许多转录因子结合序列，该区域被认为是hTERT启动子，其中，翻译起始部位的上游181bp的序列是下游基因表达中重要的核心区域。在本发明中，只要是含有该核心区域的启动子即可不受限制地使用，但是优选使用完全含有该核心区域的上游378bp左右的序列作为hTERT启动子。确认了，该378bp左右的序列与单独使用181bp的核心区域的情况基因表达效率同等。长度为455bp的hTERT启动子的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
作为hTERT启动子，除了SEQ ID NO.1中所示的碱基序列外，还包括与互补于包含SEQ ID NO.1的DNA的碱基序列构成的DNA在严紧条件下杂交、并且具有hTERT启动子活性的核苷酸的碱基序列。这种核苷酸可以以包含SEQ ID NO.1所示的碱基序列的多核苷酸、或其片段作为探针，通过菌落杂交、噬斑杂交、Southern印迹等公知的杂交法，从cDNA文库和基因组文库中获得。cDNA文库的制备方法可以参照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nd ed.」)(Cold Spring Harbor Press(1989))。此外，也可以使用市售的cDNA文库和基因组文库。
作为在上述杂交中的严紧条件，可以例举有例如，1×SSC～2×SSC、0.1％～0.5％SDS和42℃～68℃的条件，更具体地，可以例举有60～68℃下进行30分以上的预杂交后，在2×SSC、0.1％SDS中、室温下进行4～6次5～15分钟的清洗的条件。
对于杂交法的详细步骤，可以参照《分子克隆第2版》(「MolecularCloning，A Laboratory Manual 2nd ed.」)(Cold Spring HarborPress(1989)；尤其是Section9.47-9.58)等。
在本发明中之所以按如下顺序含有E1A基因、IRES序列和E1B基因，是因为使用在E1A基因和E1B基因之间插入IRES序列的病毒，在病毒感染宿主细胞时，其增殖能力提高。并且，E1A基因和E1B基因是包括于E1基因的基因，但是所谓E1基因，是指病毒具有的与DNA复制相关的早期基因(early:E)和晚期基因(late:L)中的早期基因的一种，其编码与病毒基因组的转录的调控相关的蛋白质。由E1A基因编码的E1A蛋白质可以活化产生感染病毒所必需的基因群(E1B、E2、E4等)的转录。由E1B基因编码的E1B蛋白质有助于晚期基因(L基因)的mRNA在被感染的宿主细胞的细胞质中积累，通过抑制宿主细胞的蛋白质合成，促进病毒的复制。E1A基因、E1B基因的碱基序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
E1A和E1B除分别包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的碱基序列外，还包括与互补于包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的DNA的碱基序列构成的DNA在严紧条件下杂交，并且编码具有E1A和E1B活性的蛋白质的碱基序列。这种碱基序列可以分别包含SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的碱基序列的多核苷酸、或其片段作为探针，通过菌落杂交、噬斑杂交、Southern印迹等公知的杂交法，从cDNA文库和基因组文库中获得。对于cDNA文库的制备方法，可以参照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.」)(Cold Spring Harbor Press(1989)。此外，也可以使用市售的cDNA文库和基因组文库。在上述杂交中，作为严紧条件，可以例举有例如，1×SSC～2×SSC、0.1％～0.5％SDS和42℃～68℃的条件，更详细的是，可以例举有60～68℃下进行30分以上的预杂交后，在2×SSC、0.1％SDS中、室温下进行4～6次5～15分钟的清洗的条件。对于杂交法的详细步骤，可以参照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，ALaboratory Manual 2nd ed.」)(Cold Spring Harbor Press(1989)；尤其是Section9.47-9.58)等。
所谓IRES(Internal Ribosome Entry Site)，是微小核糖核酸病毒科中特异的蛋白质合成起始信号，由于具有与18S核糖体RNA的3’末端互补的序列，因此起到核糖体结合部位的作用。已知微小核糖核酸病毒科病毒来源的mRNA通过该序列的介导得以翻译。由IRES序列的翻译效率高，即使从mRNA中部开始，也可以以非依赖于帽结构地方式进行蛋白质合成。因此，所述病毒中，由人端粒末端转移酶的启动子独立地翻译E1A基因和存在于IRES序列下游的E1B基因。如果使用IRES，端粒末端转移酶启动子的表达调控可以独立涉及E1A基因、E1B基因，因此与用端粒末端转移酶启动子调控E1A基因或E1B基因任意一方的情况相比，病毒的增殖可以更为严格地限制在具有端粒末端转移酶活性的细胞之中。IRES序列如SEQ ID NO.4所示。
此外，IRES除了包括SEQ ID NO.4中所示的碱基序列之外，还包括与互补于包含SEQ ID NO.4的DNA的碱基序列构成的DNA在严紧条件下杂交、且编码具有IRES活性的蛋白质的碱基序列。这种碱基序列，可以以包含SEQ ID NO.4所示的碱基序列的多核苷酸、或其片段作为探针，通过菌落杂交、噬斑杂交、Southern印迹等公知的杂交法，从cDNA文库和基因组文库中获得。cDNA文库的制备方法可以参照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.」)(Cold Spring Harbor Press(1989))。此外，也可以使用市售的cDNA文库和基因组文库。作为在上述杂交中的严紧条件，可以例举有例如，1×SSC～2×SSC、0.1％～0.5％SDS和42℃～68℃的条件，更详细的是，可以例举有60～68℃下进行30分以上的预杂交后，在2×SSC、0.1％SDS中、室温下进行4～6次5～15分钟的清洗的条件。对于杂交法的详细步骤，可以参照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，ALaboratory Manual 2nd ed.」)(Cold Spring Harbor Press(1989)；尤其是Section9.47-9.58)等。
此外，在本发明中，在E1基因的上游具有人端粒末端转移酶的启动子。是因为可以在具有端粒末端转移酶活性的细胞内促进增殖。
包含于本发明的复制盒中的基因可以通过通常的基因工程学方法获得。例如，作为基因工程的方法，可以使用采用一般使用的DNA合成装置的核酸合成法。此外，在分离或合成作为模板的基因序列后，设计特异于各基因的引物，可以使用通过PCR装置扩增所述基因序列的PCR法(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons(1987)Section 6.1-6.4)或采用克隆载体的基因扩增法。上述方法，本领域技术人员可以按照《分子克隆第2版》，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等容易地进行。获得的PCR产物的纯化，可以使用公知的方法。例如使用溴化乙锭的方法，使用SYBRGreenI(Molecular probes社)的方法，采用用GENECLEAN(FUNAKOSHI)、QIAGEN(QIAGEN社)等琼脂糖凝胶的方法，使用DEAE-纤维素滤纸的方法，冷冻&压缩法、使用透析管的方法等。在使用琼脂糖凝胶时，进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶切出DNA片段后进行纯化。根据需要，可以通过常用的序列测定法确认获得所预期的基因。例如，可以通过双脱氧核苷酸链终止法(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)等进行。此外，通过也可以利用适当的DNA测序仪(例如，ABI PRISM(Applied Biosystems公司))分析序列。
然后，使上述获得的各个基因按预定顺序连结。首先，用公知的制限性酶等切断上述各个基因，按照公知的方法将切断的这些基因的DNA片段插入公知的载体中，进行连结。作为公知的载体，可以使用含有脑心肌炎病毒(ECMV)的IRES(mRNA内部的核糖体结合位点)，可以由1种mRNA翻译两个位点的开放阅读框(ORF)的pIRES载体，以及大肠杆菌来源的质粒(pCR4、pCR2、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等)、枯草杆菌来源的质粒(pUB110、pTP5、pC194等)、酵母来源的质粒(pSH19、pSH15等)、λ噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、牛痘病毒、杆状病毒等动物病毒等，以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。对于本发明，如果使用pIRES载体，由于通过在多克隆位点顺次插入必需的基因，可以制备依次含有「人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因」的复制盒，因此而优选。DNA的连结中可以使用DNA连接酶。在本发明中，以下就使用人端粒末端转移酶hTERT的情况，进行具体的说明。
使用E1A-S、E1A-AS、E1B-S、E1B-AS等适当的引物，从293细胞等表达E1基因的细胞中，通过进行RT-PCR和/或DNA-PCR，扩增E1A基因和E1B基因，根据需要通过TA克隆等的公知的方法确认序列后，用公知的制限性酶切出E1A和E1B的DNA片段。
接着，通过利用多克隆位点等，在pIRES载体等公知的载体中按「hTERT启动子序列-E1A-IRES-E1B」的顺序插入各基因，可以制备本发明中使用的包含hTERT-E1A-IRES-E1B的复制盒。此外，根据需要，可以用公知的制限性酶切出包含于pShuttle等公知载体中的巨细胞病毒(CMV)启动子，在该部位插入用适当的制限性酶从phTERT-E1A-IRES-E1B切出的序列。如上所述，本发明中使用的只整合了包含hTERT-E1A-IRES-E1B的复制盒的腺病毒称为“Telomelysin”。通过在hTERT启动子的调控下使腺病毒增殖所必需的E1基因表达，可以使病毒癌细胞特异性地增殖。
在作为本发明的试剂使用的重组病毒中，包括复制盒和标记盒。该「标记盒」整合到，例如，腺病毒中的E3区域中。
其中，可以在本发明中使用的重组病毒病毒载体本来的功能是由于病毒增殖导致细胞损坏。因此，对于以微小癌组织的诊断目的使用本发明的试剂，发生上述细胞损坏的时期尽可能晚的情况是优选的。其原因是，如果细胞受到破坏，本发明的重组病毒的增殖中产生的荧光表达就消失，鉴定其存在部位变得困难。
另一方面，例如，E3A和E3B存在于腺病毒E3区域中，E3A区域的11.6kDa的ADP(adenovirus death protein)具有促进细胞损坏和病毒的扩散的功能。
因此，本发明中使用的重组病毒，通过除去含有ADP的E3区域等编码具有促进细胞损坏和病毒的扩散功能的蛋白质的病毒基因组区域，使细胞死亡的时间延迟，由此易于通过GFP等荧光表达鉴定癌组织。
构成标记盒的标记蛋白质是在上述病毒增殖的细胞内通过发光而可视化的蛋白质，优选使用发出荧光的物质。作为这种物质，可以例举有例如，Aequorea victorea等的发光水母来源的绿色荧光蛋白质(绿荧光蛋白GFP)，对其进行改变的变异体(GFP变异体)，EGFP(Enhanced-humanized GFP)或rsGFP(red-shift GFP)等。此外，也可以使用黄色荧光蛋白质(黄荧光蛋白YFP)、蓝绿色荧光蛋白质(蓝绿荧光蛋白CFP)、蓝色荧光蛋白质(蓝荧光蛋白BFP)、海肾(Renillareniformis)来源的GFP，也可以将编码这些蛋白质的基因用于本发明中。
此外，所谓可以调控上述基因表达的启动子，如果是可对应于表达作为靶的上述基因使用的病毒的适当的启动子，可以是任意一种。例如，可以例举有巨细胞病毒(CMV)启动子、hTERT启动子、SV40晚期启动子、MMTV LTR启动子、RSV LTR启动子、SRα启动子等，但不限于此。优选，可以使用CMV启动子或hTERT启动子。
包含于本发明的标记盒的重组基因，可以通过通常的基因工程方法获得。例如，作为基因工程的方法，可以使用采用一般使用的DNA合成装置的核酸合成法。此外，在分离或合成作为模板的基因序列后，设计特异于各基因的引物，可以使用采用PCR装置扩增所述基因序列的PCR法(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons(1987)Section 6.1-6.4)或采用克隆载体的基因扩增法。上述方法，本领域技术人员可以按照《分子克隆第2版》，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等容易地进行。获得的PCR产物的纯化，可以使用公知的方法。例如、有使用溴化乙锭的方法，使用SYBRGreenI(Molecular probes公司)的方法，采用用GENECLEAN(funakoshi)、QIAGEN(QIAGEN公司)等琼脂糖凝胶的方法，使用DEAE-纤维素滤纸的方法，冷冻&压缩法、使用透析管的方法等。在使用琼脂糖凝胶时，进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶切出DNA片段后进行纯化。根据需要，通过常用的序列测定法可以确认获得所预期的基因。例如，可以通过双脱氧核苷酸链终止法(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)等进行。此外，也可以通过利用适当的DNA测序仪(例如，ABI PRISM(Applied Biosystems公司))分析序列。然后，用公知的制限性酶等切断上述获得的基因，将经切断的基因的DNA片段配置成下述的重组基因，即在上述编码标记蛋白质的基因片段的上游配置编码可以驱动该基因的DNA片段的上述启动子。此时，作为质粒，可以使用穿梭质粒pHM11等。然后，使用DNA连接酶使两个基因连结，插入于载体中，制备标记盒重组基因。
作为公知的载体、可以使用pShuttle载体、大肠杆菌来源的质粒(pCR4、pCR2、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等)、枯草杆菌来源的质粒(pUB110、pTP5、pC194等)、酵母来源的质粒(pSH19、pSH15等)、λ噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、牛痘病毒、杆状病毒等动物病毒等，和pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
然后，通过用适当的制限性酶切出含有上述复制盒和标记盒的重组基因，插入适当的病毒表达载体，可以制备重组病毒。病毒表达载体中可以例举有腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、杆状病毒等，但是如上所述，优选腺病毒，尤为优选5型腺病毒。盒向病毒的整合，可以使用例如电穿孔法、脂质体法、原生质体法、醋酸锂法等。
本发明中，更具体的是，可以通过在穿梭质粒pHM11中插入pEGFP-N1(CLONTECH)来源的CMV-EGFP-SV40P(A)，通过在整合了phTERT-E1A-IRES-E1B的pShuttle载体的ClaI部位插入该质粒的Csp45I片段而获得。
本发明中，更具体的是，从如上制备的重组基因中通过公知的制限性酶切出必要部分的序列，用Adeno-X表达系统(CLONTECH)等市售的试剂盒，可以插入于Adeno-X病毒DNA等病毒的DNA中(将获得的产物称为“AdenoX-hAIB”。)。
然后，用公知的制限性酶将该AdenoX-hAIB线性化后，通过转染293细胞等培养细胞，可以制备具有感染性的重组病毒。
作为本发明中检测对象的癌细胞的种类没有限定，可以使用所有种类的癌细胞。例如，对于头颈部、胃、大肠、肺、肝、前列腺、胰腺、食道、膀胱、胆囊·胆管、乳房、子宫、甲状腺、卵巢等中的实体癌、或白血病、淋巴瘤、肉瘤、间质系肿瘤等有效。人组织来源的癌细胞的大部分显示出端粒末端转移酶活性的上升，本发明通过其端粒末端转移酶活性可以全部检测增殖变活跃的癌细胞。
由于与正常细胞相比，癌细胞中端粒末端转移酶的表达极高，在含有端粒末端转移酶的癌细胞中表达hTERT，复制盒发挥功能。因此病毒增殖，而且由于增殖使标记蛋白质的复制增加，因此通过标记蛋白质表达实现可视化。
因此，使本发明的试剂在正常细胞中不发生荧光，含有本发明的试剂的癌细胞则发光，由此可以在视觉上观察癌细胞。
为了使重组病毒感染细胞，例如，有以下的方法。首先、将人大肠癌细胞SW620、人肺癌细胞A549、H1299等细胞接种于加入了适当的培养液的培养皿中，在二氧化碳存在下，于37℃培养。培养液，采用动物细胞培养中一般使用的DMEM、MEM、RPMI-1640等，根据需要，可以添加血清、抗生物质、维生素等。通过在培养的细胞中接种一定量的本病毒、例如，0.1～10MOI(感染复数)、优选、1MOI，使之感染。所谓MOI，是指使一定量的病毒粒子感染一定量的培养细胞时的病毒量(感染单位)与细胞数之比，可以作为使病毒感染细胞时的指标使用。
并且，为了确认病毒增殖，回收病毒感染细胞，提取DNA，通过使用以该病毒具有的适当的基因作为目标的引物进行实时PCR，可以定量分析。
对于被标记的细胞的检测，推定病毒增殖的细胞由于通过碰到激发光而发出预定的荧光(例如GFP时为绿色荧光)，由此可以使癌细胞可视化。例如，如果在荧光显微镜下观察病毒感染细胞，可以在细胞中看到GFP荧光表达。并且，为了随着时间推移观察病毒感染细胞，使用CCD照相机，可以随着时间推移观察GFP荧光表达。
为了实时标记和检测生物体内细胞，可以在生物体内施加本发明的重组病毒。
本发明的试剂也可以在原患部位应用，也可以通过所有公知的方法、例如，在静脉、肌肉、腹腔内或皮下等，注射、从鼻腔、口腔或肺吸入、口服给药、使用导管等的血管内给药等导入于生物体(作为对象的细胞和器官)内。给药量可以根据有效成分的种类、给药途径、给药对象、患者的年龄、体重、性别、症状，其它条件进行适当选择，但是，作为一日给药量，通常有效成分的本发明病毒的量可以是106～1011PFU(噬斑形成单位，plaque forming units)左右，优选109～1011PFU左右，可以1天1次给药，也可以分成数次给药。
在生物体内实时观察标记，具有用于体内诊断剂的优点。这对于所谓导航手术等有用。
在外科手术中，如果进行包括病变器官在内的大范围的切除，经历手术的患者可以获得长期生存。但是，手术本身引发的并发症的发生率高，而且由于丧失功能，不能避免对术后日常生活的影响。一边维持长期生存的远期成绩，一边导入减轻患者负担的低侵袭性的治疗在癌治疗中十分重要。
以缩小必要最低限度切除手术的范围、实现低侵袭化为目的时，所希望了解的信息之一就是是否存在转移淋巴结，作为了解这些信息的方法，目前警戒淋巴结(sentinel node，SN)倍受关注。所谓SN是最早从肿瘤接受淋巴液流的淋巴结，存在着其中产生最早的微小转移这种假说。该假说被称为SN理论。针对乳腺癌中，现已开始了以欧美为中心的大规模的临床试验，但是对于这种方法在其它实体瘤中是否通用还不清楚，其验证已经开始了。
使用本发明的试剂的体内癌诊断系统，可以建立在癌细胞中使荧光蛋白质直接表达，通过高感度术中荧光检测系统鉴定肿瘤组织或转移阳性淋巴结的技术作为比SN更有效的方法，即“导航手术”的技术。本发明的重组病毒在具有端粒末端转移酶活性的许多癌细胞中增殖，可以发出例如GFP的强绿色荧光。
根据胃癌的单发淋巴结(単発リンパ節)转移部位的分析，报道了10％前后的skip转移、也就是越过第1组淋巴结向第2组远端淋巴结的初发转移，以此为根据，提倡SN导航的危险性的意见很多。但是，使用本发明的试剂的体内癌诊断系统在手术中直接实时鉴定肿瘤组织或转移阳性淋巴结，成为切除范围的导航，是独创的并且是划时代的，而且由于更为顺利地进行手术因此极为实用。具体的是，通过与SN导航时相同的技术，在手术前数日，用内视镜在肿瘤部位(例如胃癌和大肠癌周围的胃·大肠粘膜、胃癌·大肠癌·肺癌·胰腺癌等肿瘤内部等)注入本发明的试剂，病毒向肿瘤浸润组织、肿瘤转移组织、或所属淋巴结分布，为肿瘤部位或转移阳性部位中的病毒增殖提供了充分的时间。
手术时，在开腹后以GFP荧光激发光源投射手术的区域，将特殊3CCD照相机摄下的映像投影于眼罩显示器(face mount display)。通过使用透过性镜片，可以确保实际的手术的区域视野，可以通过重叠的GFP图像检测转移阳性淋巴结。进而，通过装备专用的滤镜，可以不使用照相机而用肉眼识别荧光。
2.体外诊断用试剂本发明的试剂也可以作为用于筛选的体外诊断剂来应用。现在，肿瘤标记的定量是了解无法用肉眼检测、或无法鉴定原发病灶的癌的存在的最一般的方法。但是，肿瘤标记的癌特异性未必可以满足需要，并且以单一的标记探索所有的癌种类极为困难。
已经确认，端粒末端转移酶在85％以上的人恶性肿瘤中活性上升，与其癌特异性相关性极高。
使用本发明的试剂的体外的癌诊断可以通过例如以下方式进行。
除去从被检者采集的全血中的红血球，在其余细胞悬浮液中加入一定比率(0.1～10MOI、优选、1MOI)的本发明的试剂，在试管内混合。放置一定时间(例如12～48时间)，促进病毒向癌细胞的感染和增殖，用流式细胞仪定量分析其细胞组分中GFP表达。使用该系统可以以高敏感度检测存在于外周血中的游离癌细胞。可使用该方法来检测外周血中是否存在极为微量的游离癌细胞。
3.细胞死亡诱导剂和诱导细胞死亡的方法本发明提供了一种细胞死亡诱导剂，其含有一种重组病毒，该病毒基因组的E1区域中整合了按如下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的复制盒，并且病毒基因组的E3区域中整合了含有编码标记蛋白质的基因以及可以调控该基因的表达的启动子的标记盒。优选，作为癌细胞的细胞死亡的诱导剂，也可以用于癌的基因治疗，以及预防手术后的复发、防止和/或预防转移等。
本发明的细胞死亡诱导剂所含的重组病毒的细胞死亡诱导盒中整合了由启动子驱动的并且编码可以诱导细胞死亡的蛋白质的基因。
该重组病毒中使用的细胞死亡诱导盒中可以含有编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因和可以调控该基因的表达的启动子。因此，例如，如果在癌细胞中导入本发明的诱导剂，病毒在癌细胞中特异性增殖的结果是，细胞死亡诱导蛋白质的细胞内表达量提高，其它正常细胞没有受损，可以只在癌细胞中诱导细胞死亡。
所谓编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因是指编码与特定细胞的细胞死亡的诱导相关的蛋白质的基因。
作为细胞死亡诱导相关蛋白质，可以例举有例如，如下所示的蛋白质，在本发明中可以整合编码这些蛋白质的基因。
例如、作为免疫相关蛋白质，可以例举有PA28。PA28是使细胞内的蛋白酶体活化的蛋白质，在由于过量表达而引起免疫反应的同时诱导细胞死亡的蛋白质。此外，作为细胞凋亡诱导蛋白质，可以例举有TRAIL。TRAIL是指通过与细胞表面的受体结合，诱导细胞凋亡细胞死亡的分子。作为端粒末端转移酶相关蛋白质，可以例举有AU5。AU5具有在具有端粒末端转移酶活性的细胞中可以诱导细胞死亡的序列。
这些细胞死亡诱导相关蛋白质的基因可以通过通常的基因工程的方法获得。例如，作为基因工程的方法，可以采用使用一般可以使用的DNA合成装置的核酸合成法。此外，分离或合成作为模板的基因序列后，设计特异于各基因的引物，可以使用采用PCR装置扩增所述基因序列的PCR法(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons(1987)Section 6.1-6.4)或采用克隆载体的基因扩增法。上述方法，本领域技术人员可以按照《分子克隆第2版》，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等容易地进行。获得的PCR产物的纯化，可以使用公知的方法。例如、有使用溴化乙锭的方法，使用SYBRGreenI(Molecular probes社)的方法，采用用GENECLEAN(funakoshi)、QIAGEN(QIAGEN社)等琼脂糖凝胶的方法，使用DEAE-纤维素滤纸的方法，冷冻&压缩法、使用透析管的方法等。在使用琼脂糖凝胶时，进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶切出DNA片段后进行纯化。根据需要，通过常用的序列测定法可以确认获得所预期的基因。例如，可以通过双脱氧核苷酸链终止法(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)等进行。此外，也可以通过利用适当的DNA测序仪(例如，ABI PRISM(Applied Biosystems公司))分析序列。
此外，作为癌细胞的细胞死亡的诱导物质，也包括癌抑制基因。这是因为癌抑制基因具有抑制癌细胞的增殖的功能。此时，癌抑制基因可以例举有，例如，在以往的基因治疗中可以使用的以下基因。
p53(SEQ ID NO.11；Accesion No.M14694)多种癌p15(SEQ ID NO.12；Accesion No.L36844)多种癌p16(SEQ ID NO.13；Accesion No.L27211)多种癌APC(SEQ ID NO.14；Accesion No.M74088)大肠癌、胃癌、胰腺癌BRCA-1(SEQ ID NO.15；Accesion No.U14680)卵巢癌、乳腺癌DPC-4(SEQ ID NO.16；Accesion No.U44378)大肠癌、胰腺癌FHIT(SEQ ID NO.17；Accesion No.NM 112012)胃癌、肺癌、子宫癌p73(SEQ ID NO.18；Accesion No.Y11416)成神经细胞瘤PATCHED(SEQ ID NO.19；Accesion No.U59464)基底细胞癌Rb p 110(SEQ ID NO.20；Accesion No.M15400)肺癌、骨肉瘤DCC(SEQ ID NO.21；Accesion No.X76132)大肠癌NF1(SEQ ID NO.22；Accesion No.NM 000267)1型神经纤维瘤病NF2(SEQ ID NO.23；Accesion No.L11353)2型神经纤维瘤病WT-1(SEQ ID NO.24；Accesion No.NM 000378)维尔姆斯瘤(Wilms tumor)这些癌抑制基因可以通过通常的基因工程的方法获得。例如，作为基因工程的方法，可以使用采用一般使用的DNA合成装置的核酸合成法。此外，在分离或合成作为模板的基因序列后，设计特异于各基因的引物，可以使用采用PCR装置扩增所述基因序列的PCR法或采用克隆载体的基因扩增法。根据需要，可以用DNA测序仪确认获得所预期的基因。
作为可以调控上述基因表达的启动子，如果是可对应于表达作为靶的上述基因使用的病毒的适当的启动子，可以是任意一种。可以优选使用CMV启动子或hTERT启动子，但是不限于这些启动子，例如，可以使用SV40晚期启动子、MMTV LTR启动子、RSV LTR启动子、SRα启动子等。
本发明的细胞死亡诱导剂也可以在原患部位应用，也可以通过所有公知的方法、例如，在静脉、肌肉、腹腔内或皮下等，注射、从鼻腔、口腔或肺吸入、口服给药、使用导管等的血管内给药等导入于生物体(作为对象的细胞和器官)内。
此外，例如通过冷冻干燥等方法处理便于操作后，可以以其原状或与赋形剂、增量剂、粘合剂、润滑剂等公知的药学上可接受的载体、公知的添加剂(包括缓冲剂、等渗化剂、螯合剂、着色剂、保存剂、香料、调味剂、甜味剂等)等相混合，可制备医药组合物。
本发明的细胞死亡诱导剂根据片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液剂、糖浆等口服剂；注射剂、外用剂、栓剂、滴眼剂等非口服剂等形态，可经口服或不经口服给药。优选例如经肌肉、腹腔等局部注射、经静脉注射等。
给药量，根据有效成分的种类、给药路径、给药对象、患者的年龄、体重、性别、症状等其它条件适当选择，但是，作为一日给药量，通常作为有效成分的本发明病毒量为106～1011PFU(plaque formingunits)左右，优选为109～1011PFU左右，可以每日给药一次，也可以每日给药多次。
此外，在使用本发明的病毒时，通过使用公知的免疫抑制剂等，抑制生物体的免疫，也可使该病毒感染易于进行。
而且，本发明的病毒也可与选自于公知的抗癌剂和放射线中的至少一种抗癌剂组合使用。抗癌剂可以包含，但不限于以下物质。
(1)烷基化活性剂这种制剂具有通过在癌细胞的核酸蛋白质中导入烷基，使细胞损坏发生的作用，可以例举有例如卡波醌、白消安(マスタ一ド药)、尼莫司汀(亚硝基脲类)等。
(2)代谢拮抗活性剂这种制剂具有通过在代谢过程中拮抗酶，抑制细胞合成的作用，可以例举有，例如甲氨蝶呤(叶酸类)、巯基嘌呤(嘌呤类)、阿糖胞苷(嘧啶类)、氟尿嘧啶、替加氟、卡莫氟等。
(3)抗生物质可以例举有具有抗癌作用的放线菌素D、满霉素(pleomycin)、阿霉素、丝裂霉素C等。
(4)微小管阻害活性剂这种制剂通过对微小管作用显示出抗肿瘤效果，可以例举有，例如多西他赛、紫杉醇(Taxane)、长春瑞宾、ピンクリスチン、长春碱(生物碱类)等。
(5)铂制剂这种制剂具有通过构成DNA链内或链间结合或DNA蛋白质结合，抑制DNA合成的作用，例如，可以例举有顺铂、アルボプラチン、奈达铂等。
(6)拓扑异构酶阻害活性剂抑制拓扑异构酶的伊立替康(拓扑异构酶I抑制药)、鬼臼毒素衍生物(拓扑异构酶II抑制药)等。并且，所谓拓扑异构酶，是指催化通过在DNA中暂时加入缺口改变DNA链的连接数目的反应的酶。
据认为，本发明的细胞死亡诱导剂等由于以下理由产生副作用的可能性极低，可以认为是一种非常安全的制剂。
(1)在正常体细胞中，几乎没有端粒末端转移酶活性，而且，本发明的病毒难以感染造血细胞等悬浮细胞。
(2)由于本发明的病毒具有增殖能力，所以可以比常规基因治疗中使用的非增殖性病毒更低的浓度进行使用。
(3)即使在本发明的病毒过量给药的情况下，也可通过生物体内常规免疫作用起到抗病毒的作用。
通过使本发明的重组病毒感染靶细胞，可以在靶细胞中诱导细胞死亡。靶细胞的种类没有特别的限定，可以例举有，例如肿瘤细胞，增殖活跃的细胞、端粒末端转移酶活性上升的细胞等。
为了判断细胞死亡是否被诱导，可以通过以下方法进行形态学的观察。也就是说，如果使本发明的重组病毒感染附着于培养容器的底面的细胞一定时间，倒立显微镜下，细胞圆形化，从底面脱落，成为具有光泽的细胞悬浮于培养液中。此时，细胞中维持其生命的机制被破坏，可以评断细胞死亡已经被诱导。此外，使用采用四唑盐(MTT、XTT等)的市售的活细胞检测试剂盒，可以确认细胞死亡。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明并不受这些实施例的限定。
实施例1在体外通过共感染进行的癌细胞显像本实施例在使含有复制盒的病毒「Telomelysin」和含有标记盒的非增殖型病毒「Ad-GFP」共感染时，预备在体外研究是否发出荧光。
使0.1MOI的Ad-GFP感染人大肠癌细胞SW620、人肺癌细胞A549、H1299(图2)。
其结果是，即使使0.1MOI Ad-GFP感染人大肠癌细胞SW620、人肺癌细胞A549、H1299，也几乎无法确认绿色倾向，但是如果与1MOI的TRAD合用，可以只在癌细胞中检测荧光，在WI38和NHLF等人成纤维细胞和人脐带血管内皮细胞(HUVEC)等正常细胞中完全没有发现荧光(图3)。
实施例2显示在体外通过Telomelysin与Ad-GFP的共感染进行的人癌组织本实施例在使含有复制盒的病毒「Telomelysin」和含有标记盒的非增殖型病毒「Ad-GFP」共感染时，预备在体内研究是否发出荧光。
在移植于裸鼠的背部皮下的人大肠癌SW620和人肺癌A549肿瘤中肿瘤内给药8×105PFU的Ad-GFP和8×106PFU的TRAD，随时间推移观察荧光。
其结果显示，在任一肿瘤中给药后第2天后检测到斑状的荧光，渐渐消失直至第14天(图4)。
实施例3用Telomelysin-GFP进行的癌细胞检测1.在单一病毒中包括含有端粒末端转移酶启动子和E1基因的复制盒，以及含有编码GFP蛋白质的基因的标记盒的GFP表达增殖型病毒(Telomelysin-GFP)的制备Telomelysin-GFP的概要如图1所示。Telomelysin-GFP，由hTERT启动子驱动E1A/IRES/E1B，可确认其癌细胞特异性和端粒末端转移酶特异性增殖·复制，另一方面，而且由启动子驱动的Aequorea victorea来源的GFP基因整合到E3区域中。因此。发现病毒增殖的细胞通过激发光发出绿色荧光，可以使癌细胞可视化。
这种非增殖型病毒如下述方式制备。
2.重组病毒的制备根据从293细胞提取的RNA，使用以下特异的引物(E1A-S、E1A-AS)和PCR条件进行RT-PCR，扩增出897bp的E1A基因。
E1A-S5’-ACA CCG GGA CTG AAA ATG AG-3’(SEQ IDNO.5)E1A-AS5’-CAC AGG TTT ACA CCT TAT GGC-3’(SEQ IDNO.6)PCR液组成1×PCR缓冲液0.2mM各dNTP5mM MgCl22.5U AmpliTaq Gold0.2μM各引物反应条件95℃10分(95℃1分、56℃1分、72℃1.5分)×32个循环72℃7分4℃5分根据从293细胞提取的DNA，使用以下的引物(E1B-S、E1B-AS)进行DNA-PCR，扩增出1822bp的E1B基因。
E1B-S5’-CTG ACC TCA TGG AGG CTT GG-3’(SEQ IDNO.7)E1B-AS5’-GCC CAC ACA TTT CAG TAC CTC-3’(SEQ IDNO.8)PCR液组成、反应条件(循环、温度)与E1A基因的情况相同。
进行各个PCR产物的TA克隆(TA Cloning kit dual Promoter；Invitrogen)，测定序列后，用制限性酶EcoRI切出分别为911bp(E1A)、1836bp(E1B)的DNA片段。
在pIRES载体(CLONTECH)的MluI切断部位，SaII部位延其方向分别插入E1A，E1B(E1A-IRES I-E1B)。
在存在于E1A-IRES-E1B的E1A上游的XhoI部位延其方向插入用制限性酶MluI和BglII切出的455bp的hTERT启动子序列(phTERT-E1A-IRES-E1B)。
通过制限性酶MfeI和NheI处理切出包含于pShuttle载体的巨细胞病毒(CMV)启动子，在其部位插入用制限性酶NheI和NotI从phTERT-E1A-IRES-E1B中切出的3828bp的序列(pSh-hAIB)。
用AgeI/NheI切断pEGFP-N1(CLONTECH)，用Klenow片段平末端化并自连(pEGFP-N2)。
用NsiI/AflII切断该pEGFP-N2，用T4DNA聚合酶平末端化，使用BglII连接子制备BglII位点。在pHM11的BamHI部位插入该BglII片段(pHM11-EGFP-N2)。
进而、在整合了phTERT-E1A-IRES-E1B的pShuttle载体(pSh-hAIB)的ClaI部位插入pHM11-EGFP-N2的Csp45I片段。
用制限性酶I-CeuI和PI-SceI从制备的重组基因切出4381bp的序列，插入于Adeno-X Expression System(CLONTECH)的Adeno-X ViralDNA中(AdenoX-hAIB)。用制限性酶PacI处理AdenoX0-hAIB，使之线状化后，转染293细胞，制备具有感染性的重组腺病毒(以下、称为“Telomelysin-GFP”)。
实施例4人肺癌细胞的检测试验1.通过Telomelysin-GFP感染人肺癌细胞而产生的形态学的变化在体外使1MOI和10MOI Telomelysin-GFP感染培养中的人非小细胞肺癌来源的H1299细胞。具体的是，将5×104个H1299细胞接种于24孔板中，24小时后计算细胞数，然后以1MOI或10MOI的浓度的病毒添加于培养液中。然后，在倒立显微镜下随着时间推移观察细胞形态，研究病毒的细胞损坏活性。
其结果是，由于病毒浓度依赖性地且时间依赖性地增殖诱导了细胞死亡。10MOI感染后120小时，在倒立显微镜下大部分细胞呈圆形悬浮(图5)。
2.通过Telomelysin-GFP感染人肺癌细胞产生的GFP荧光表达在荧光显微镜下观察图6中所示的倒立显微镜像。确认了表示病毒以浓度依赖性以及时间依赖性增殖的GFP绿色荧光(图6)。发现10MOI感染后72小时GFP表达的细胞最多，然后在细胞死亡的诱导的同时，GFP阳性细胞数也减少了(图6)。
3.通过定量的实时PCR进行的Telomelysin-GFP增殖的验证使10MOI的Telomelysin-GFP感染H1299人肺癌细胞，自2小时后，26、50、74小时后回收细胞，提取DNA。以Telomelysin-GFP所具有的E1A基因为靶，使用引物进行实时PCR，定量分析病毒增殖·复制。所使用的引物和PCR条件如下所示。
E1A-S5’-CCT GTG TCT AGA GAA TGC AA-3’(SEQ IDNO.9)E1A-AS5’-ACA GCT CAA GTC CAA AGG TT-3’(SEQ IDNO.10)PCR液组成1×LC FastStart DNA Master SYBR Green I3mM MgCl20.5μM各引物反应条件95℃10分(95℃10秒、60℃15秒、72℃8秒)×40个循环70℃15秒40℃30秒其结果表示，Telomelysin-GFP在26小时后已经增殖成100万倍(图7)，然后，到达曲线平稳段，但是稍延迟一会后，GFP荧光渐渐增强(图7)。
实施例5人大肠癌细胞的检测试验1.通过Telomelysin-GFP感染人肺癌细胞产生的GFP荧光表达使10MOI Telomelysin-GFP感染人大肠癌来源的SW620细胞，在倒立显微镜和荧光显微镜下随着时间推移观察变化。
其结果是，与H1299细胞的情况相同，确认了表示病毒以时间依赖性增殖的GFP绿色荧光(图8)。
2.通过定量的实时PCR进行的Telomelysin-GFP增殖的验证与H1299细胞的情况相同，使10MOI Telomelysin-GFP感染SW620人大肠癌细胞，自2小时后，26、50、74、98小时后回收细胞，提取DNA、通过实时PCR定量地分析病毒增殖。实时PCR的条件(反应液组成、个循环、时间等)与H1299细胞的情况相同。
其结果是，Telomelysin-GFP在26小时后已经增殖成100万倍，然后大致呈曲线平稳段直至98时间后(图9)。
实施例61.通过Telomelysin-GFP感染正常人肺成纤维细胞(NHLF)而产生的形态学的变化在体外使1MOI和10MOI Telomelysin-GFP感染培养中的正常人肺成纤维细胞(NHLF)，在倒立显微镜下观察直至120小时。
其结果是，没有发现形态学的变化，未诱导细胞死亡(图10)。
2.通过Telomelysin-GFP感染正常人肺成纤维细胞(NHLF)产生的GFP荧光表达如果在荧光显微镜下观察图10的倒立显微镜像，在若干细胞中发现GFP荧光表达，但是如果考虑细胞密度，与癌细胞相比，极稀。因此，认为Telomelysin-GFP在正常细胞中几乎不增殖·复制(图11)。
3.通过定量的实时PCR进行的Telomelysin-GFP增殖的验证如上所述，使10MOI Telomelysin-GFP感染H1299人肺癌细胞、SW620人大肠癌细胞、正常人肺成纤维细胞(NHLF)，随时间推移回收细胞，提取DNA、通过实时PCR定量地分析病毒增殖。
其结果是，癌细胞中，Telomelysin-GFP在24时间后增殖成约100万倍，在72时间后发出显著的GFP荧光，与之相对，NHLF中，在72时间后停止于1000倍程度的增殖，几乎无法检测到GFP荧光(图12)。
实施例7通过荧光成像对Telomelysin-GFP的肿瘤内增殖·复制的检测1.在移植于裸鼠的H1299人肺癌肿瘤内给药107PFU的Telomelysin-GFP，用CCD照相机随时间推移观察GFP荧光表达。
其结果是，在24小时内确认了由Telomelysin-GFP增殖产生的GFP荧光表达，3天后、5天后，其范围和亮度增强(图13)。
2.在移植于裸鼠的H1299人肺癌肿瘤内给药107PFU的Telomelysin-GFP，1周后和3周后摘出皮下肿瘤。用CCD照相机观察到肿瘤全体和切面的GFP荧光表达。
其结果是，即使在摘出肿瘤表面上的荧光表达微弱时，也可以确认在切面上大范围的Telomelysin-GFP的增殖，在3周后的组织中大部分肿瘤整体中确认了荧光(图14)。
3.与上述相同的是，将HT29人大肠癌细胞移植至作为原位模型的裸鼠的直肠壁内，在形成肉眼的肿瘤时给药107PFU的Telomelysin-GFP。用CCD照相机在1周后确认了由Telomelysin-GFP增殖产生的GFP荧光表达，其荧光表达维持至3周后(图15)。
实施例81.在使用裸鼠和HT29人大肠癌细胞的原位直肠癌模型中的组织学的分析将HT29人大肠癌细胞移植至裸鼠的直肠壁内，在形成肉眼的肿瘤时摘出肿瘤，用苏木精和伊红(HE)染色分析。
其结果是，在直肠周围形成肿瘤，而且也在直肠壁内的淋巴管内确认了肿瘤细胞块(图16)。
2.在使用裸鼠和HT29人大肠癌细胞的同所性直肠癌模型中的剖腹所见将HT29人大肠癌细胞移植至直肠壁内后，在形成肉眼的肿瘤时开腹，发现了3条大动脉周围的淋巴结(LN)的肿胀(图17)。
3.通过荧光成像对HT29直肠肿瘤和主动脉旁淋巴结中Telomelysin-GFP的肿瘤内增殖·复制进行的检测用CCD照相机进行荧光成像，在被移植的HT29直肠肿瘤和3个中的1个主动脉旁淋巴结中发现了GFP荧光表达(图18)。
4.通过荧光成像对主动脉旁淋巴结中的Telomelysin-GFP的肿瘤内增殖·复制进行的检测通过CCD照相机进行荧光成像，只在3个主动脉旁淋巴结中的1个中发现了GFP荧光表达(图19)。
5.通过荧光成像对主动脉旁淋巴结中的Telomelysin-GFP的肿瘤内增殖·复制进行的检测对主动脉旁淋巴结进行了组织学分析，其结果是，通过用CCD照相机进行的荧光成像，只在1个GFP荧光表达阳性的对象中检测到了转移肿瘤组织，只在转移阳性淋巴结中确认了Telomelysin-GFP的增殖(图20)。
参考文献Reid T，Galanis E，Abbruzzese J，Sze D，Wein LM，Andrews J，Randlev B，Heise C，Uprichard M，Hatfield M，Rome L，Rubin J，Kirn D.Hepatic arterial infusion of a replication-selective oncolyticadenovirus(dl1520)phase II viral，immunologic，and clinical endpoints.Cancer Res 62(21)6070-9，2002。
工业上利用的可能性根据本发明，可以提供一种癌细胞检测用试剂或癌诊断用试剂和细胞死亡诱导剂。本发明的试剂可以在生物体内以极高敏感度检测癌细胞，因此对于所有导航手术等有用。
序列表自由文本SEQ ID NO.5引物SEQ ID NO.6引物SEQ ID NO.7引物
SEQ ID NO.8引物SEQ ID NO.9引物SEQ ID NO.10引物序列表<110>Oncolys BioPharma Inc.
<120>含有Telomelysin/GFP基因的重组病毒<130>PCT05-0070<150>JP2004-285383<151>2004-09-29<160>24<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>455<212>DNA<213>智人(homo sapiens)<400>1tggcccctcc ctcgggttac cccacagcct aggccgattc gacctctctc cgctggggcc 60ctcgctggcg tccctgcacc ctgggagcgc gagcggcgcg cgggcgggga agcgcggccc 120agacccccgg gtccgcccgg agcagctgcg ctgtcggggc caggccgggc tcccagtgga 180ttcgcgggca cagacgccca ggaccgcgct ccccacgtgg cggagggact ggggacccgg 240gcacccgtcc tgccccttca ccttccagct ccgcctcctc cgcgcggacc ccgccccgtc 300ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc cctccgggcc ctcccagccc ctccccttcc 360tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg cgagtttcag gcagcgctgc gtcctgctgc 420gcacgtggga agccctggcc ccggccaccc ccgcg 455<210>2<211>899<212>DNA<213>腺病毒(adenovirus)
<400>2acaccgggac tgaaaatgag acatattatc tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg 60gccgccagtc ttttggacca gctgatcgaa gaggtactgg ctgataatct tccacctcct 120agccattttg aaccacctac ccttcacgaa ctgtatgatt tagacgtgac ggcccccgaa 180gatcccaacg aggaggcggt ttcgcagatt tttcccgact ctgtaatgtt ggcggtgcag 240gaagggattg acttactcac ttttccgccg gcgcccggtt ctccggagcc gcctcacctt 300tcccggcagc ccgagcagcc ggagcagaga gccttgggtc cggtttctat gccaaacctt 360gtaccggagg tgatcgatct tacctgccac gaggctggct ttccacccag tgacgacgag 420gatgaagagg gtgaggagtt tgtgttagat tatgtggagc accccgggca cggttgcagg 480tcttgtcatt atcaccggag gaatacgggg gacccagata ttatgtgttc gctttgctat 540atgaggacct gtggcatgtt tgtctacagt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 600ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 660cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 720ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 780gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 840cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtg 899<210>3<211>1823<212>DNA<213>腺病毒<400>3ctgacctcat ggaggcttgg gagtgtttgg aagatttttc tgctgtgcgt aacttgctgg 60aacagagctc taacagtacc tcttggtttt ggaggtttct gtggggctca tcccaggcaa 120agttagtctg cagaattaag gaggattaca agtgggaatt tgaagagctt ttgaaatcct 180
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权利要求
1.一种癌细胞检测用试剂，其含有一种重组病毒，在该病毒基因组的E1区域中整合了按如下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的复制盒，并且在该病毒基因组的E3区域中整合了含有编码标记蛋白质的基因以及可以调控该基因的表达的启动子的标记盒。
2.一种癌诊断用试剂，其含有一种重组病毒，在该病毒基因组的E1区域中整合了按如下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的复制盒，并且在该病毒基因组的E3区域中整合了含有编码标记蛋白质的基因以及可以调控该基因的表达的启动子的标记盒。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其用于体内检测、诊断或导航手术。
4.根据权利要求1或2所述的试剂，人端粒末端转移酶的启动子是hTERT启动子。
5.根据权利要求1或2所述的试剂，标记蛋白质是GFP。
6.根据权利要求1或2所述的试剂，可以调控该编码标记蛋白质的基因的表达的启动子是巨细胞病毒启动子或hTERT启动子。
7.根据权利要求1或2所述的试剂，其中，所述的病毒是腺病毒。
8.一种细胞死亡诱导剂，其含有一种重组病毒，该病毒基因组的E1区域中整合了按如下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的复制盒，并且病毒基因组的E3区域中整合了含有编码标记蛋白质的基因以及可以调控该基因的表达的启动子的标记盒。
9.根据权利要求8所述的诱导剂，其中，所述的人端粒末端转移酶的启动子是hTERT启动子。
10.根据权利要求8所述的诱导剂，其中，所述的细胞死亡诱导相关蛋白质选自免疫相关蛋白质、细胞凋亡诱导蛋白质和端粒末端转移酶相关蛋白质中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的诱导剂，其中，所述的免疫相关蛋白质是PA28。
12.根据权利要求10所述的诱导剂，其中，所述的细胞凋亡诱导蛋白质是TRAIL。
13.根据权利要求10所述的诱导剂，端粒末端转移酶相关蛋白质是AU5。
14.根据权利要求8所述的诱导剂，可以调控细胞死亡诱导相关蛋白质的表达的启动子是巨细胞病毒启动子或hTERT启动子。
15.根据权利要求8所述的诱导剂，其中，所述的病毒是腺病毒。
16.根据权利要求8所述的诱导剂，其中，所述的细胞是癌细胞。
17.一种癌细胞的检测方法，其特征在于使权利要求1和3～6任一项所述的试剂感染癌细胞，检测由所述癌细胞发出的荧光。
18.一种癌细胞的检测方法，其特征在于使权利要求2～6任一项所述的试剂感染癌细胞，检测由所述癌细胞发出的荧光。
19.一种诱导靶细胞的细胞死亡的方法，其特征在于使权利要求8～16任一项所述的诱导剂感染靶细胞。
全文摘要
本发明提供一种癌细胞检测用或癌诊断用试剂。具体而言，涉及一种癌细胞检测用试剂，其含有一种重组病毒，其中所述病毒基因组的E1区域中整合了按如下顺序含有人端粒末端转移酶的启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的复制盒，并且病毒基因组的E3区域中整合了含有编码标记蛋白质的基因以及可以调控该基因的表达的启动子的标记盒。
文档编号A61K48/00GK101035906SQ200580032788
公开日2007年9月12日 申请日期2005年9月28日 优先权日2004年9月29日
发明者藤原俊义, 田中纪章, 京哲, 水口裕之, 早川尧夫 申请人:癌康理生物制药株式会社