一种沉默df-1细胞系中ifnar1基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种沉默DF-1细胞系中干扰素受体1 (Interferon receptor 1， IFNAR1)基因的方法，用于提高禽流感病毒在该细胞系中的增殖滴度，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着集约化养殖业的迅猛发展，禽流感等家禽重要疫病正成为公共卫生安全领域 的焦点，从源头上控制疫病是当前防控策略的重中之重。实践证明，疫苗免疫和快速检测是 防控重大动物疫病最有效的措施。由于禽流感病毒细胞培养的滴度较低，目前国内仍主要 采用禽胚生产疫苗，效率低、耗能高，存在外源病毒的污染的可能。我国农业"十二五"规划 已将重大动物疫病防控技术研宄和农产品安全生产与质量控制技术研宄列入重大关键技 术攻关。
[0003] DF-1细胞是一种稳定的、无肿瘤基因的、可传代的鸡胚成纤维细胞系，细胞形态呈 纤维状，该细胞缺少禽白血病病毒，肉瘤病毒内源性基因，被广泛用于动物病毒研宄、疫苗 研制及癌症研宄等诸多领域。干扰素（Interferon，IFN)是机体细胞受到病毒或其他诱生 剂作用而产生的具有抗病毒、免疫调节、抗细胞增殖等生物学活性的分泌型糖蛋白，主要分 为 IFN-a、IFN-0、IFN-y。其中 IFN-a、IFN-0 的细胞表面受体为 I 型 IFNAR，由 IFNAR1 和IFNAR2两条链组成，其中IFNAR1是IFNAR的一个重要亚单位蛋白，与干扰素结合及生 物信号转导有关。研宄表明，IFN与细胞表面受体特异性结合经JAK-STAT途径介导信号 传导，通过PKR、Mx和ADAR-1等途径发挥抗病毒作用。因此，建立一种沉默DF-1细胞系中 IFNAR1基因的方法，可有效提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度，从而降低疫苗生 产成本，对于我国禽流感的预防和控制具有重要现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有禽流感疫苗生产中存在的不足，提供一种沉默DF-1细 胞系中IFNAR1基因的方法，可提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的抗原量达5-10倍，不仅 可以解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流感生物反应器细胞培养 技术的研发进程。
[0005] 本发明的技术方案是：一种沉默DF-1细胞系中IFNAR1基因的方法，其特征是：
[0006] (1)根据IFNAR1基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA 水平上敲低IFNAR1基因表达的siRNA ;
[0007] (2)构建表达上述筛选的IFNAR1基因siRNA(IFNARlRNAi基因）的慢病毒载体；
[0008] (3)通过上述慢病毒载体，将IFNAR1基因siRNA(IFNARlRNAi基因）导入DF-1细 胞系，沉默IFNAR1基因的表达，提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度。
[0009] 进一步地，所述步骤（1)的筛选方法是：将设计的多个siRNA插入pLKO.1-TRC克 隆载体中，转染DF1细胞，再收获并提取细胞总RNA，采用荧光定量PCR方法筛选mRNA水平 干扰IFNAR1基因的有效siRNA。
[0010] 进一步地，所述步骤（1)筛选得到的siRNA为sh3 : 5，-TAGGATCACAGAAGAAGTAAA-3,;
[0011] 进一步地，所述步骤（2)的慢病毒载体为LV-IFNARl-RNAi ;
[0012] 上述慢病毒载体的构建方法为，包括以下步骤：
[0013] 1)根据上述siRNA的DNA序列设计合成单链DNA oligo,退火配对产生双链，再通 过两端所含的酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体GV248中，将连接产物转入制备 好的细菌感受态细胞，PCR方法鉴定阳性重组质粒GV248-IFNAR1;
[0014] 上述双链为：
[0015] I FNAR 1 -RNAi - 1：5 '-CCGG TAGGATCACAGAAGAAGTAAA CTCGAGTTTACTTCTTCTGTGATCCTA TTTTTG-3,,
[0016] IFNARl-RNAi-2 W -AATTCAAAAA TAGGATCACAGAAGAAGTAAA CTCGAGTTTACTTCTTCT GTGATCCTA-3r；
[0017] 2)大量提取重组质粒GV248-IFNAR1，与辅助质粒pHelperl. 0、pHelper2.0混合后 通过脂质体（Lip〇feCtamine2000)转染293T细胞，收集培养48h的细胞上清液，经离心，上 清液过滤后得到慢病毒载体LV-IFNARl-RNAi。
[0018] 进一步地，所述步骤（3)通过慢病毒载体LV-IFNARl-RNAi将IFNAR1基因 siRNA(IFNARlRNAi基因）介导入DF-1细胞系，包括以下步骤：
[0019] 1)将DF-1细胞接种至细胞培养皿中，待生长密度达70 %时，接种慢病毒 LV-IFNARl-RNAi；
[0020] 2)以含10yg/mL聚凝胺的10%FBSDMEM培养基稀释LV-IFNARl-RNAi至终浓度 为5X106PFU/mL，进而通过10倍倍比稀释，获得至少3个不同的病毒滴度，分别接种至DF-1 细胞中；同时设定阳性病毒对照；
[0021] 3)将接种LV-IFNARl-RNAi的DF-1细胞置37°C条件下5%0)2维持培养4h，更换 为含5% FBS DMEM培养基，继续培养至48h，更换含4 yg/mL嘌呤霉素的10%FBS DMEM培 养基，筛选出阳性细胞克隆。
[0022] 本发明具有下列优点：
[0023] 1.本发明将三个shRNA构建至pLKO.1-TRC克隆载体中，通过转染收获并提取细胞 总RNA，采用荧光定量PCR筛选mRNA水平干扰IFNAR1基因的有效siRNA，为筛选siRNA提 供了一种快速、准确、高通量的方法。
[0024] 2.本发明利用慢病毒载体系统，将干扰IFNAR1基因的shRNA快速连接到慢病毒载 体系统，通过转染获得一种含有IFNARIRNAi基因的慢病毒。
[0025] 3.本发明通过慢病毒将IFNARIRNAi介导至DF-1细胞系，建立一种沉默DF-1细胞 系中IFNAR1基因的方法，可提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的抗原量达5-10倍，大大降 低疫苗生产成本，不仅能解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流感 生物反应器细胞培养技术的研发进程。
【附图说明】
[0026] 图1是设计筛选的三个siRNA在IFNAR1基因的位置及筛选出的有效siRNA (sh3);
[0027] 图2是pLKO. 1质粒经Age I和EcoR I双酶切琼脂糖凝胶电泳产物，其中M泳道 为DNA marker DL 15000 ;第1泳道为pLKO. 1质粒Age I和EcoR I酶切产物；
[0028] 图3是pLKO. 1-TRC-IFNAR1质粒经EcoR I和Nco I双酶切鉴定产物，其中M泳道 为DNAmarkerDL 15000;第1泳道为pLKO. 1-TRC-IFNAR1质粒经EcoR I和Nco I双酶切 产物；
[0029] 图4是IFNAR1有效shRNA筛选荧光定量PCR检测的A Ct值；
[0030] 图5是荧光显微镜下观察慢病毒LV-IFNARl-RNAi感染293T细胞；其中左图为普 通光视野，右图为荧光视野；
[0031] 图6是禽流感病毒1215株在DF-1、DF-1 A IFNAR1细胞中TCID5Q测定。
【具体实施方式】
[0032] 一、干扰IFNAR1基因转录的siRNA筛选
[0033] 1、干扰IFNAR1基因的shRNA的寡核苷酸序列的设计与合成
[0034] 根据Genbank中登录的IFNAR1基因序列以及addgene慢病毒载 体构建程序，于 http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/ 网站设计 3 个 RNA干扰靶点序列的siRNA(如图1所示），同时设立对照组Scramble，序 列如下：shl :5 ' -AAATGTGGCTAATTTCTGTGT-3 ' (SEQ No. 1) ；sh2 ：5 r -TA CGACGATAATACCTCACAA-3，（SEQ No. 2) ;sh3 :5，-TAGGATCACAGAAGAAGTAAA-3，(SEQ No. 3) ;Scramble :CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG(SEQ No. 4)，根据 pLKO. 1-TRC 克隆载体特性，将 siRNA的DNA序列与其相应的互补序列以loop序列连接形成正义链和反义链，并在两端引 入接头序列，通过退火形成shRNA。序列由宝生物工程（大连）有限公司合成。
[0035] 2、干扰IFNAR1基因pLKO. 1-TRC-IFNAR1载体的构建与鉴定
[0036] 参考Addgene公司pLKO. 1-TRC克隆载体说明书操作，将pLKO. 1-TRC克隆载体于 37°C经Age I酶切2h，回收载体片段于37°C以EcoR I继续酶切2h，分别获得7kb、1. 9kb的 片段（如图2所示）。回收7kb片段与退火形成的shRNA序列16°C连接过夜，转化感受态 菌DH5 a，挑取单克隆菌落，经过夜培养后提取质粒pLKO. 1-TRC-IFNAR1，以EcoR I及Nco I双酶切鉴定，1 %琼脂糖凝胶电泳获得2kb、5kb的片段（如图3所示）。鉴定的阳性的克 隆利用 pLKO. 1 测序引物（5' -CAA GGC TGT TAG AGA GAT AAT TGG A-3' SEQ No. 5)进行测 序。
[0037] 3、检测引物设计与合成
[0038] 采用SYBR Green I荧光定量PCR(ABI 7300)扩增靶基因IFNAR1，同时设定内参 0 -actin。其中IFNAR1片段长度为183bp，参考NM_204859. 1序列；0 -actin片段长度为 113bp，参考NM_205518. 1序列，引物序列如下：
[0039] IFNAR1F ：TCTGATCTGGCACCCTCGAC (SEQ No. 6)；
[0040] IFNAR1R：CAGTGATGCCACAATCAAGACAAC (SEQ No. 7)；
[0041] 0 -actin F ：ATTGTCCACCGCAAATGCTTC (SEQ No. 8)
[0042] 0 -actinR：AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC (SEQ No. 9)〇
[0043] SYBR Green I荧光定量PCR所用引物采用ACt验证靶基因与内参扩增的平行性， 以上引物序列由宝生物工程（大连）有限公司合成。
[0044] 4、质粒 pLKO. 1-TRC-IFNAR1 的转染
[0045] 转染前24h制备DF-1单层细胞于12