含人类骨保护素基因的重组慢病毒载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种制备重组慢病毒载体的方法。更具体 地，涉及含有人类骨保护素基因的重组慢病毒及其制备方法以及该重组慢病毒载体在制备 治疗牙周骨缺损材料中的用途。
【背景技术】
[0002] 牙周病是发生在牙齿支持组织的炎症性、破坏性疾病，以牙槽骨的吸收破坏为主 要特征。在临床治疗中通过牙周病的基础治疗、牙周手术（根面处理技术、引导性牙周组织 再生术、骨移植）和药物治疗，对消除致病因素、促使炎症减轻有一定疗效，但难以恢复正 常的牙槽嵴高度、形成新附着。
[0003] 组织工程技术为牙周组织再生提供了新方法。生长因子是组织工程的重要因素， 它们能调控包括牙周来源在内的多种细胞的增殖、迁移、分化和外基质的合成，在牙周组织 再生的修复中发挥重要作用。但是传统的组织工程方法应用生长因子时，多将生长因子局 部注射或复合细胞和支架材料后植入体内，由于生长因子多为蛋白质或多肽，在体内极易 降解，生物半衰期短，容易被体液冲走或稀释，因此难以保持局部有效治疗浓度。
[0004] 基因治疗为生长因子持续、稳定表达提供了新方法。借助基因治疗的手段（如转 基因技术），将生长因子的基因转移到牙周组织相关靶细胞内，当基因导入靶细胞后，这些 细胞便可以充当微型"生物工厂"，持续释放细胞因子，促使靶细胞的表型向再生方向分化； 并通过自分泌或旁分泌作用对细胞自身以及周围未转染的细胞产生作用，促使整个缺损区 的所有细胞活化，从而提高牙周组织再生的成功率。
[0005]目前利用组织工程和基因治疗技术以及两者相结合促进牙周组织修复再生已成 为牙周领域的研究热点。有部分学者利用该技术在牙周病治疗、促进牙槽骨新生方面进行 了研究，通过牙周膜细胞（Periodontalligamentcell^roLCj体外培养，并将骨形成蛋 白（Bonemorphogeneticprotein，BMPs)或血小板生长因子（Platelet-derivedgrowth factor，TOGF)等促进骨形成基因转染至牙周膜细胞，回植到牙周组织缺损处，发现有促进 牙槽骨形成的作用。然而，牙周组织是由牙骨质、牙周膜、牙槽骨与牙龈共同构成的三维结 构，牙周病是细菌等各种病原因素对这四者的共同破坏，虽然通过牙周手术，包括使用牙周 组织工程方法在提供修复用细胞、促进组织形成等方面有一定作用，但是，在病变牙周组织 中主要是各种刺激因素导致的大量破骨细胞活化，抑制了牙周组织的成骨能力，使组织修 复无法达到理想效果。因此，单一依靠促进骨形成来治疗牙周病效果未尽人意。
[0006]骨保护素（osteoprotegerin，0PG)是近年来发现的一种能阻止破骨细胞分化、 成熟，抑制骨吸收的关键因子。骨保护素是核因子kB受体活化因子配体（receptor activatorofnuclearfactorkBligand，RANKL)的天然诱傅受体，能竞争性地与核因 子kB受体活化因子配体结合，阻断核因子kB受体活化因子（Receptoractivatorof nuclearfactor-kB，RANK)与核因子kB受体活化因子配体间的相互作用，从而抑制破骨 细胞的形成和活化，抑制骨吸收。研究发现，核因子KB受体活化因子配体水平升高可以导 致牙周组织的破坏；检测牙周病患者龈沟液显示，RANKL/OPG比率比健康人群明显升高；细 菌产生的毒素或是组织表达的炎症介质也是通过影响RANKL/OPG比率而影响组织修复的。 这些研究结果表明，OPG/RANKL/RANK系统在牙周骨代谢中是重要的分子调节机制之一。
[0007] 牙周组织中最重要的一种细胞是roixs，有学者研究发现roixs可以表达骨保护素 和核因子kB受体活化因子配体，在没有受到外界刺激时骨保护素表达较核因子kB受体 活化因子配体强，不利于破骨生成，以维持牙周内环境的稳定。揭示了H)LCS是通过0PG/ RANKL系统来调节牙槽骨代谢的。由于H)LCS位于牙槽骨和牙骨质之间，其分泌的骨保护素 可能在抵御炎症组织中核因子kB受体活化因子配体介导的骨吸收中发挥一定的防御功 能。
[0008] 近年来，国内外学者利用骨保护素防治因破骨细胞过度活化而引起的骨吸收疾病 做了大量研究，发现骨保护素可有效抑制骨质疏松性骨吸收、恶性肿瘤骨转移破坏等骨质 吸收疾病。但使用骨保护素治疗牙周骨缺损还未见报道。
【发明内容】
[0009] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0010] 发明人将组织工程化骨植入兔牙周骨缺损处，以磷酸三钙作为生长空间，植 入的牙周膜干细胞在局部分化成成骨细胞、成牙骨质细胞和成纤维细胞，直接参与牙周骨 组织的再生；同时植入的牙周膜干细胞在体内存活、发生迁移、吞噬及分泌细胞外基质，并 吸引体内细胞至缺损区域，从而促进了牙周骨组织再生；另外植入的牙周膜干细胞不断分 泌骨保护素蛋白，通过抑制核因子KB受体活化因子配体与破骨细胞表面的核因子KB受 体活化因子结合，抑制破骨细胞活化，抑制牙槽骨吸收，从而提高牙周骨愈合过程。
[0011] 本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种含有 人类骨保护素基因（hOPG)的重组慢病毒载体。
[0012] 根据本发明的一个方面，本发明提供了 一种含有人类骨保护素基因重组慢病毒载 体的制备方法。根据本发明实施例，该方法包括：
[0013] (1)合成人类骨保护素基因的编码序列区域；
[0014] (2)将人类骨保护素基因的编码序列区域克隆连接到T载体上；
[0015] (3)使用第一引物从连接骨保护素的T载体扩增两端含有酶切位点的人类骨保护 素基因的编码序列片段；
[0016] (4)将步骤（3)得到的基因片段连接到pIRES-EGFP载体上，获得0PG-IRES-EGFP 载体；
[0017] (5)将步骤⑷制备的0PG-IRES-EGFP重组载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆；
[0018] (6)使用第二引物从阳性克隆扩增出0PG-IRES-EGFP序列，亚克隆到载体 pcDNA6. 2w上；
[0019] (7)将步骤（6)制备的重组载体上的所述0PG-IRES-EGFP序列经BP重组到入门载 体上，再经LR重组到pLenti6. 3/V5载体上，得到pLenti6. 3-hOPG-IRES-EGFP重组载体。
[0020] 发明人惊奇的发现，本发明制备载体的方法简单，易于操作，并且利用该方法可以 获得重组慢病毒载体，该案重组慢病毒载体能够实现转染基因在体内持续、稳定的表达；并 能用于极难转染的干细胞和原代细胞。
[0021] 重组慢病毒载体根据本发明实施例，本发明制备方法中选用的酶切位点是Bgll 和BamHI。
[0022] 根据本发明实施例，本发明实施例前述的第一引物序列为：SEQN0 1(命名为 SF-F1)、SEQN0 2(命名为SF-R1)，第一引物的具体序列如下：
[0023]SF-F1 :5, -AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3'（SEQNO1);
[0024]SF-R1 :5, -ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3,（SEQNO2);
[0025] 由此，扩增的精确率好、效率高。
[0026] 根据本发明实施例，本发明实施例前述的第二引物序列为：SEQN0 3(命
[0027]名为SF-F)、SEQN0 4(命名为SF-R2)，第二引物的具体序列如下：
[0028]SF-F:5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGC G-3'（SEQN0 3);
[0029]SF-R2:5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTGTACAGCTCATCCATGCCG-3'（S EQN0 4)。
[0030] 由此，扩增特异性好、效率高。
[0031] 根据本发明的另一方面，本发明提供了一种含骨保护素基因的重组慢病毒载体。 根据本发明实施例，该载体是根据本发明实施例前述的方法制备的。
[0032] 发明人惊奇的发现，本发明的重组慢病毒载体能够实现转染基因在体内持续、稳 定的表达；并能用于极难转染的干细胞和原代细胞，转导效率高。
[0033] 根据本发明又一方面，本发明还提供了pLenti6. 3-h0PG-IRES-EGFP重组载体在 制备含有人类0PG基因的重组慢病毒中的用途。
[0034] 发明人惊奇地发现，利用本发明的重组载体制备的重组慢病毒，能够实现转染基 因在体内持续、稳定的表达；并能用于极难转染的干细胞和原代细胞；同时，以该慢病毒为 载体的基因转染不影响种子细胞与支架材料的黏附及其正常的生长。
[0035] 根据本发明实施例，所述重组慢病毒是将本发明前述构建的重组载体与慢病毒包 装蛋白表达载体共转染包装细胞，并将包装细胞裂解获得所述重组慢病毒。由此，转染效率 商。
[0036] 根据本