专利名称：Egfp基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。
背景技术：
随着分子生物学技术和方法的发展及应用，杆状病毒已被开发成为高效的真核表达载体系统，用于各种外源基因的表达，并作为一种新型的疫苗、基因治疗载体受到人们的高度重视，但现存的杆状病毒介导的外源基因表达量与工业化大生产的要求有较大差距。 并且持续表达的时间较短，转导效率低等，这些因素都限制了杆状病毒表达系统的应用。因此，杆状病毒表达系统的研究的重点就在于将外源基因表达时间延长，表达效率、转导效率提高。从而为改进型重组杆状病毒在脊椎动物细胞表达外源基因及新型重组活载体疫苗的研究奠定了基础。
发明内容
本发明是要解决目前重组杆状病毒质粒载体转导效率低、表达效率较工业生产要求差距大、表达时间短等问题，提供EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。本发明EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行一、以质粒peglk为模板，WK2和WK3为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EFla基因；二、将EFla基因与pMD18_T载体连接，得到质粒pT-EFl α ；三、分别对质粒pT-EFl α和pFB_VSVGED_WPRE进行双酶切， 将酶切后获得的目的片段EFl α和酶切后的pFB-VSVGED-WPRE连接，得到质粒pWK ；四、以 PAAV-LacZ为模板，La和Lb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测， 采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得L-ITR基因，分别对L-ITR基因和pWK进行单酶切， 将酶切后的L-ITR和pWK连接，连接产物即为pWK-L-ITR ’五、以pAAV_LacZ为模板，Ra和1 为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得R-ITR基因，分别对R-ITR基因和pWK-L-ITR进行单酶切，将酶切后的R-ITR和 pWK-L-ITR连接，连接产物即为pWK-ITR ；六、以pEGFP_C3为模板，pEGFP-f和pEGFP-r为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EGFP基因，分别对EGFP基因和pWK_ITR进行双酶切，将酶切后的EGFP和pWK_ITR 连接，连接产物即为EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP ；其中步骤一中PCR扩增所用引物 WK2 序列为 5，-TGCTCTAGACGTGAGGCTCCGGTGCCC-3，，引物 WK3 序列为 5，-CCGGA ATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAAATGGAAGAAAAAA-3，；步骤四中 PCR 扩增所用弓丨物 La 序列为 5，-TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3，，引物 Lb 序列为 5，-TGCTCTAGAGTAA TTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3，；步骤五中 PCR 扩增所用引物 Ra 序列为 5，-ATACGG TCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG-3，，引物 Rb 序列为 5，-ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGG CG-3，；步骤六中 PCR 扩增所用引物 pEGFP-f 序列为 5，-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3 ，，引物 pEGFP-r 序列为 5’ -TCAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3，。
本发明通过添加VSV-GED、WPRE和ITR元件，成功构建EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP，WPRE增强了外源基因的表达效率，VSV-GED增强了病毒的转导效率， ITR延长了表达时间。
图1为重组杆状病毒BV-pWK (-) -EGFP侵染OL细胞48小时后EGFP的表达情况； 图2为图1相应的细胞核染色的OL细胞；图3为重组杆状病毒BV-pWK-EGFP侵染OL细胞 48小时后EGFP的表达情况；图4为图3相应的细胞核染色的OL细胞；图5为重组杆状病毒 BV-pffK-ITR-EGFP侵染OL细胞48小时后EGFP的表达情况；图6为图5相应的细胞核染色的OL细胞；图7为peglk质粒图谱；图8为pFB_VSVGED_WPRE质粒图谱；图9为pAAV_LacZ 质粒图谱；图10为PEGFP-C3质粒图谱。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行一、以质粒peglk为模板，WK2和WK3为引物，进行PCR扩增，对 PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EFl α 基因；二、将EFl α基因与pMD18-T载体连接，得到质粒pT_EFl α ；三、分别对质粒 PT-EFl α和pFB-VSVGED-WPRE进行双酶切，将酶切后获得的目的片段EFlα和酶切后的 pFB-VSVGED-WPRE连接，得到质粒pWK ；四、以pAAV_LacZ为模板，La和Lb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得L-ITR 基因，分别对L-ITR基因和pWK进行单酶切，将酶切后的L-ITR和pWK连接，连接产物即为 PffK-L-ITR ’五、以pAAV-LacZ为模板，Ra和Rb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得R-ITR基因，分别对R-ITR基因和pWK-L-ITR进行单酶切，将酶切后的R-ITR和pWK-L_ITR连接，连接产物即为pWK_ITR ； 六、以pEGFP-C3为模板，pEGFP-f和pEGFP-r为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EGFP基因，分别对EGFP基因和 PffK-ITR进行双酶切，将酶切后的EGFP和pWK-ITR连接，连接产物即为EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP ；其中步骤一中PCR扩增所用引物WK2序列为5，-TGCTCTAGACG TGAGGCTCCGGTGCCC-3，，引物WK3序列为 5，_CCGGAATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAA ATGGAAGAAAAAA-3 ’；步骤四中 PCR 扩增所用引物 La 序列为 5 ’ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCT CACATGT-3，，引物 Lb 序列为 5，-TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3，；步骤五中 PCR 扩增所用引物序列为 5，-ATACGGTCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG-3，，引物 1 序列为 5’ -ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGGCG-3，；步骤六中 PCR 扩增所用引物 pEGFP-f 序列为 5，-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3，，引物 pEGFP-r 序列为 5，-TCAGTCGACTCACT TGTACAGCTCGTCCATGCC-3，。本实施方式所述质粒peglk购自hvitrogen公司，peglk质粒图谱如图7所示； 所述pFB-VSVGED-WPRE购自addgene公司，pFB-VSVGED-WPRE质粒图谱如图8所示；所CN 102533862 A
述pAAV-LacZ购自Biovector Science Lab公司，pAAV-LacZ质粒图谱如图9所示；所述 PEGFP-C3购自上海研域化学试剂有限公司，PEGFP-C3质粒图谱如图10所示。EGFP基因重组表达载体转导效率验证实验IJfEFl α基因和pFastBac [ρΗ_]均采用Mil和EcoRI进行双酶切，将酶切产物 pFastBac [ρΗ_]和EFl α用Τ4 DNA连接酶连接，将连接有EFl α的pFastBac [ρΗ_]命名为 pffK-FB-[pH-]-EFl α，并对其进行酶切鉴定。然后以pEGFP_C3为模板，LM9和pA为引物扩增 polyA 基因，引物 LM9 序列为 5，-ATACGGTCCGTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCAC-3，，引物 PA 序列为 5，-CGGAATTCACGCATGCTTGTCGACTAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTT-3，，进行 poIyA与pffK-FB-[pH-]-EFl α的酶切连接，将连接有PolyA的EcoRI命名为pWK(-)，即阴性对照质粒，并用RsrII和EcoRI进行双酶切检测。所述pFastBac[pH_]购自addgene公司。2、按照本实施方式的方法，以pEGFP-C3为模板，pEGFP-f和pEGFP_r为引物扩增 EGFP基因，用限制性内切酶Mil和EcoRI分别对EGFP、pWK、pffK-ITR和pWK(-)进行双酶切。酶切产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收目的条带，并将酶切后的EGFP和酶切后的pWK、pWK-ITR、pffK(-)分别进行连接，连接产物命名为pWK-EGFP、pffK-ITR-EGFP和 pWK(-)-EGFP，并用Mil和EcoRI分别进行酶切鉴定。3、重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-EGFP转染Sf9细胞首先分别将pWK-EGFP、pWK-ITR-EGFP 和 pWK (-) -EGFP 转化 Ε. coli DHlOBac 感受态细胞，挑取阳性的重组菌落，提取重组Bacmid质粒，制备3种重组杆状病毒穿梭载体 Bacmid-EGFP。再用3种重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-EGFP分别转染Sf9细胞，收获重组杆状病毒P1。在处于对数生长期的Sf9细胞悬液中以10%的接种量加入Pl病毒液，27°C， 70r/min悬浮培养至Sf9细胞病变明显，收获并保存含病毒的上清液P2。再用P2液体扩增获取P3液体，获取大量的病毒上清，测定滴度后用来进行重组杆状病毒的表达。4、重组杆状病毒侵染OL细胞将培养的OL细胞用胰酶消化吹散后接种于96孔细胞培养板，以2X IO4个细胞 /孔接种到96孔细胞培养板上，37°C培养1 后加入感染复数为40 (multiplicity of infection, MOI)的CMV-IE-GFP杆状病毒P3储备，开始病毒的侵染，37°C培养1 后更换新鲜DMEM完全培养液。分别在重组杆状病毒侵染后培养12h、Mh、48h、72h，96h对EGFP表达情况进行观察。5、绿色荧光蛋白的检测首先进行细胞固定及核染色，然后利用尼康公司生产的TE2000型倒置荧光显微镜观察细胞形态及EGFP表达情况，采集细胞的数字图像。图1为重组杆状病毒 BV-pffK (-) -EGFP侵染OL细胞48小时后EGFP的表达情况，图2为图1相应的细胞核染色的 OL细胞，图3为重组杆状病毒BV-pWK-EGFP侵染OL细胞48小时后EGFP的表达情况，图4 为图3相应的细胞核染色的OL细胞，图5为重组杆状病毒BV-pWK-ITR-EGFP侵染OL细胞 48小时后EGFP的表达情况，图6为图5相应的细胞核染色的OL细胞。经试验证实，重组杆状病毒BV-pWK-EGFP的转导效率为57. 3 %，重组杆状病毒BV-pWK-ITR-EGFP的转导效率为69. 1 %，比阴性对照BV-pWK(-)-EGFP的转导效率提高了 32. 6 %。与对照组 pWK (-) -EGFP 和 pWK-EGFP 相比，pWK-ITR-EGFP 增强了外源基因的表达效率；对照组pWK (-) -EGFP和pWK-EGFP的表达时间分别为邪h和144h，而本发明pWK-ITR-EGFP的表达时间为21他。本实施方式所构建的重组杆状病毒表达载体 PffK-ITR-EGFP通过添加WPRE增强了外源基因的表达效率、VSV-GED增强了病毒的转导效率，ITR延长了表达时间。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成
成分用量质粒peglk3 |iL20μΜ 引物 WK2Ιμ 20μΜ 引物 WK3Ιμ IOxTaq Buffer5μLIOmMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL无菌水35.5|iLPCR 扩增条件为94°C变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 1. 2min， 共30个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中连接的体系如下
成分用量EFloc基因3 |iLpMD18-T 载体Ιμ Solution I5 |iL无菌水Ιμ 连接反应条件为16°C连接12h。其它与
具体实施例方式本实施方式所述Solution I为pMD18_T载体配套缓冲液，内含T4DNA连接酶，购买自大连宝生物工程有限公司。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中质粒 ρΤ-EFl α双酶切的体系如下
成分用量
质粒 pT-EFloc10|iLXbal2.5 |iL
EcoRl2.5|iL·
IOxMBuffer5μL
无菌水30|iL酶切反应条件为37°C水浴，2h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中 pFB-VSVGED-WPRE双酶切的体系如下
成分用量pFB-VSVGED-WPRE5 |iLXbal2.5|iLEcoRl2.5|iLIOxMBufFer5μL无菌水35μL酶切反应条件为37°C水浴，2h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中连接的体系如下
成分用量目的片段EFla3 |iL酶切后的 pFB-VSVGED-WPRE5 |iLIOXLigation BufferΙμ T4 DNA连接酶0.4|iL无菌水0.6|iL连接反应条件16°C连接12h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤四中PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成
成分 pAAV-LacZ 0.8mmol^L 引物 La 0.4μιηο1/μ 引物 Lb IOxTaq Buffer
用量 2μL Ιμ Ιμ 5μLIOmMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL无菌水36.5|iL
PCR 扩增条件为94°C变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 0. 2min，共20个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤四中L-ITR基因单酶切的体系如下
成分用量L-ITR基因10|iLXbal2.5|iLIOxMBuffer5μL无菌水32.5|iL
酶切反应条件37°C水浴，2h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤四中pWK单酶切的体系如下
成分用量pWK10|iLXbal2.5|iLIOxMBuffer5μL无菌水32.5|iL
酶切反应条件37°C水浴，2h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤四中连接的体系如下
成分用量酶切后的L-ITR3μL酶切后的pWK5μLIOXLigation BufferΙμ T4 DNA连接酶0.4|iL无菌水0.6|iL
连接反应条件16°C连接12h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成
成分用量pAAV-LacZ2|iL0.8mmol^L 弓丨物 RaΙμΣ0.4μιηο1/μ 引物 RbΙμΣIOxTaq Buffer5|iLIOmMdNTP4|iL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL无菌水 36.5μ
PCR 扩增条件为94°C变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 0. 2min， 共20个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中R-ITR基因单酶切的体系如下
成分用量R-ITR基因10|iLRsrll2.5|iLIOXHBuffer5|iL无菌水 32.5μ
酶切反应条件37°C水浴，2h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中 PffK-L-ITR单酶切的体系如下
成分用量pWK-L-ITR10|iLRsrll2.5|iLIOXHBuffer5|iL无菌水 32.5μ
酶切反应条件37°C水浴，2h。其它与具体实施方式
一相同。
系如下
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中连接的体成分用量酶切后的R-ITR3 |iL酶切后的pWK-L-ITR5 |iLIOXLigation BufferΙμ T4 DNA连接酶0.4|iL无菌水0.6|iL连接反应条件16°C连接12h。其它与具体实施方式
一才丨具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤六中PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成
成分用量pEGFP-C33 |iL20μΜ 引物 pEGFP-fΙμ 20μΜ 引物 pEGFP-rΙμ IOxTaq Buffer5μLIOmMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL无菌水35.5|iLPCR扩增条件为94°C变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 45s，共 30 个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤六中EGFP基因
双酶切的体系如下
成分用量
EGFP 基因10|iL
SaK2.5μL
EcoRl2.5|iL·
IOXHBuffer5μL
无菌水30|iL酶切反应条件37°C水浴，2h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤六中pWK-ITR
双酶切的体系如下成分用量
pWK-ITR10|iL
Sail2.5μL
EcoRI2.5|iL· IOXHBuffer 5μL 无菌水 30|iL酶切反应条件37°C水浴，2h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤六中连接的体系如下
成分用量酶切后的EGFP3 |iL酶切后的pWK-ITR5 |iLIOXLigation BufferΙμ T4 DNA连接酶0.4|iL无菌水0.6|iL 连接反应条件37°C连接池。其它与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行一、以质粒Peglk为模板，WK2和WK3为引物，进行 PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EFl α基因；二、将EFl α基因与pMD18_T载体连接，得到质粒pT_EFl α ；三、分别对质粒pT-EFl α和pFB-VSVGED-WPRE进行双酶切，将酶切后获得的目的片段EFl α和酶切后的 pFB-VSVGED-WPRE连接，得到质粒pWK ；四、以pAAV_LacZ为模板，La和Lb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得L-ITR 基因，分别对L-ITR基因和pWK进行单酶切，将酶切后的L-ITR和pWK连接，连接产物即为 PffK-L-ITR ；五、以pAAV-LacZ为模板，和Rb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得R-ITR基因，分别对R-ITR基因和pWK-L-ITR进行单酶切，将酶切后的R-ITR和pWK-L_ITR连接，连接产物即为pWK_ITR ； 六、以pEGFP-C3为模板，pEGFP-f和pEGFP-r为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EGFP基因，分别对EGFP基因和 PffK-ITR进行双酶切，将酶切后的EGFP和pWK-ITR连接，连接产物即为EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP ；其中步骤一中PCR扩增所用引物WK2序列为5，-TGCTCTAGACG TGAGGCTCCGGTGCCC-3，，引物 WK3 序列为 5，-CCGGAATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAA ATGGAAGAAAAAA-3 ’；步骤四中 PCR 扩增所用引物 La 序列为 5 ’ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCT CACATGT-3，，引物 Lb 序列为 5，-TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3，；步骤五中 PCR 扩增所用引物 Ra 序列为 5，-ATACGGTCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG-3，，引物 1 序列为 5’ -ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGGCG-3，；步骤六中 PCR 扩增所用引物 pEGFP-f 序列为 5，-ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3，，引物 pEGFP-r 序列为 5，-TCAGTCGACTCACT TGTACAGCTCGTCCATGCC-3，。
2.根据权利要求1所述的EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量质粒 peglk3μL20μΜ 引物 WK2\μL20μΜ 引物 WK3\μLIOxTaq Buffer5μLIOmMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5|iL无菌水35.5μ PCR扩增条件为94°C变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸1. 2min，共30 个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。
3.根据权利要求1所述的EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤四中PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量pAAV-LacZ2μ \0.8mmol^L 引物 LalμL\0.4pmol>L 引物 Lb\μL10xTaq BufFer5μL10mMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5pL无菌水36.5μ 〇尺扩增条件为94で变性5min，94°C变性308，56で退火308，72で延伸0. 2min,#20 个循环，再72で延伸10min，4°C保温。
4.根据权利要求1所述的EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步 骤五中PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量pAAV-LacZ2μ 0.8mmol^L 引物 RalμL0.4pmol>L 引物 Rb\μL10xTaq BufFer5μL10mMdNTP4μL5υ/μ Taq DNA 聚合酶0.5pL无菌水36.5μ 〇尺扩增条件为94で变性5min，94°C变性308，56で退火308，72で延伸0. 2min,#20 个循环，再72で延伸10min，4°C保温。
5.根据权利要求1所述的EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步 骤六中PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量pEGFP-C33μL20μΜ 引物 pEGFP-f\μL20μΜ 引物 pEGFP-r\μL10xTaq BufFer5μL10mMdNTP4μL 5υ/μ Taq DNA 聚合酶 0.5pL无菌水35.5μ PCR扩增条件为94°C变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，共30个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。
全文摘要
EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。是要解决目前重组杆状病毒质粒载体转导效率低、表达效率较工业生产要求差距大、表达时间短等问题。方法；一、PCR扩增EF1α基因；二、构建质粒pT-EF1α；三、构建质粒pWK；四、PCR扩增L-ITR基因，构建pWK-L-ITR；五、PCR扩增R-ITR基因，构建pWK-ITR；六、PCR扩增EGFP基因，构建EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP。本发明通过添加VSV-GED、WPRE和ITR元件，增强了外源基因的表达效率，增强了病毒的转导效率，延长了表达时间。
文档编号C12N15/66GK102533862SQ20121001281
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者平文祥, 楼庄伟, 葛菁萍, 高冬妮 申请人:黑龙江大学