专利名称：具有cba启动子的可表达egfp的重组杆状病毒的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。
背景技术：
随着分子生物学技术和方法的发展及应用，杆状病毒已被开发成为高效的真核表达载体系统，用于各种外源基因的表达，并作为一种新型的疫苗、基因治疗载体受到人们的高度重视。目前筛选重组杆状病毒的方法有很多，诸如酵母-昆虫细胞、大肠杆菌-昆虫细胞的穿梭载体的开发、杆状病毒DNA线性化和体外定点酶促重组等。但是这些方法的重组效率较低、重组病毒筛选的周期较长、很难同时分离多个重组杆状病毒、基因表达的效率也很低。
发明内容
本发明是要解决现有重组杆状病毒介导的基因表达效率低的问题，提供具有CBA 启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。本发明具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行一、PCR 扩增 Bacmid DNA 中的 gp64sp 片段；二、PCR 扩增 pCMV-VSVG 中的 VSVGED 片段；三、融合PCR扩增gp64sp-VSVGED融合片段；四、将GV片段引入pMD18_T载体，构建质粒 PMD18-T-GV ；五、构建质粒 pFastBacl-GV ；六、PCR 扩增 pFastBacl-GV 中的 pHGV 片段， 将pHGV片段引入pMD18-T载体，构建质粒pGM18_T-pHGV ；七、PCR扩增质粒pTriEx_2Hygro 中的CBA启动子，将CBA启动子克隆至pMD18-T载体，构建质粒pMD18_T_CBA ；八、构建质粒载体PFastBac [pH_]-pHBOX ；九、构建质粒载体pSD_CBA ；十、构建质粒载体pSD ； 十一、PCR扩增质粒pAAV-LacZ中的L-ITR片段和R-ITR片段，将L-ITR片段引入质粒载体pSD，构建质粒pSD-L-ITR ；十二、将R-ITR片段引入质粒pSD-L-ITR，构建pSD-ITRs ； 十三、PCR扩增质粒pEGFP-C3中的EGFP基因，将EGFP基因克隆至pMD18_T载体，构建质粒pMD18-T-EGFP ；十四、构建质粒pSD_EGFP ；十五、构建质粒pSD_ITRs_EGFP ；十六、质粒 pSD-EGFP和质粒pSD-ITRs-EGFP分别转化DHlOBac细胞，获得重组载体Bacmid-SD-EGFP 和Bacmid-SD-ITRs-EGFP ；十七、利用脂质体介导转染法将Bacmid-SD-EGFP和 Bacmid-SD-ITRs-EGFP 转染 Sf9 细胞，获得重组杆状病毒 BV-SD-EGFP 和 BV-SD_ITRs_EGFP ； 其中步骤一中 PCR 扩增引物为 SD-I 和 SD-2，引物 SD-I 为 5' -CGCGGATCCATGCTACTAGTAAA TCAGTCACACCAAG-3 ‘，引物 SD-2 为 5 ‘ -ATTTTTGGATAGCCCAGTATCCGCAAAGGCAGAATGC-3 ‘； 步骤二中 PCR 扩增引物为 SD-2 和 LM-2，引物 LM-2 为 5 ‘ -CCCAAGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCAT CTCTAT-3‘；步骤三中融合PCR扩增引物为LM-3和SD-2，引物LM-3为5' -CGCGGATCCATGC TACTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3 ‘；步骤六中 PCR 扩增引物为 LM-1 和 LM-2，引物 LM-1 为 5 ‘ -TGCTCTAGATTCGCATCCTCGGTTTTCTG-3 ‘；步骤七中 PCR 扩增引物为 SD-3 和 SD-4，引物 SD-3 为 5' -GCTCTAGAGCCGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAAC-3'，引物SD-4 为 5' -GTGAATTCCGGAGCTCTGCTCGAGCGAGGCCTAGCCGCCGGTCACACGCC-3 ‘；步骤^^一中 PCR 扩增引物为 LM-11 和 LM-12，引物 LM-11 为 5 ‘ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3 ‘，引物 LM-12 为 5 ‘ -TG CTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3 ‘；步骤十三中 PCR 扩增引物为 eGFP-f 和 eGFP-r，引物 eGFP-f 为 5 ‘ -ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3 ‘，引物 eGFP-r 为 5 ‘ -T CAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3‘。本发明在杆状病毒基因组中添加多个调控元件，进行多角度的遗传修饰，使得重组后的杆状病毒具有高转导效率、传递基因在体内和体外中持续较长时间表达。与不添加 VSV-GED, WPRE调控元件及ITRs序列的.BV-SD-controI-EGFP重组杆状病毒相比，经过修饰改造的BV-SD-EGFP重组杆状病毒和BV-SD-EGFP-ITRs重组杆状病毒所介导的EGFP基因的表达效率明显增强。
图1为重组杆状病毒BV-SD-controI-EGFP侵染MYO细胞48小时后EGFP的表达情况；图2为重组杆状病毒BV-SD-EGFP侵染MYO细胞48小时后EGFP的表达情况；图3为重组杆状病毒BV-SD-ITRs-EGFP侵染MYO细胞48小时后EGFP的表达情况；图4为质粒 pCMV-VSVG图谱；图5为质粒pFastBacl图谱；图6为质粒pTriEx-2Hygro图谱；图7为质粒pFastBadpH-]图谱；图8为pAAV_LacZ质粒图谱；图9为质粒pEGFP_C3图谱。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行一、PCR 扩增 Bacmid DNA 中的 gp64sp 片段；二、PCR 扩增 pCMV-VSVG 中的 VSVGED 片段；三、融合PCR扩增gp64sp-VSVGED融合片段；四、将GV片段引入pMD18_T载体，构建质粒 pMD18-T-GV ；五、构建质粒 pFastBacl-GV ；六、PCR 扩增 pFastBacl-GV 中的 pHGV 片段， 将pHGV片段引入pMD18-T载体，构建质粒pGM18_T-pHGV ；七、PCR扩增质粒pTriEx_2Hygro 中的CBA启动子，将CBA启动子克隆至pMD18-T载体，构建质粒pMD18_T_CBA ；八、构建质粒载体PFastBac [pH_]-pHBOX ；九、构建质粒载体pSD_CBA ；十、构建质粒载体pSD ； 十一、PCR扩增质粒pAAV-LacZ中的L-ITR片段和R-ITR片段，将L-ITR片段引入质粒载体pSD，构建质粒pSD-L-ITR ；十二、将R-ITR片段引入质粒pSD-L-ITR，构建pSD-ITRs ； 十三、PCR扩增质粒pEGFP-C3中的EGFP基因，将EGFP基因克隆至pMD18_T载体，构建质粒pMD18-T-EGFP ；十四、构建质粒pSD_EGFP ；十五、构建质粒pSD_ITRs_EGFP ；十六、质粒 pSD-EGFP和质粒pSD-ITRs-EGFP分别转化DHlOBac细胞，获得重组载体Bacmid-SD-EGFP 和Bacmid-SD-ITRs-EGFP ；十七、利用脂质体介导转染法将Bacmid-SD-EGFP和 Bacmid-SD-ITRs-EGFP 转染 Sf9 细胞，获得重组杆状病毒 BV-SD-EGFP 和 BV-SD-ITRs-EGFP ； 其中步骤一中 PCR 扩增引物为 SD-I 和 SD-2，引物 SD-I 为 5 ‘ -CGCGGATCCATGCTACTAGTAAAT CAGTCACACCAAG-3 ‘，引物 SD-2 为 5 ‘ -ATTTTTGGATAGCCCAGTATCCGCAAAGGCAGAATGC-3 ‘；步骤二中 PCR 扩增引物为 SD-2 和 LM-2，引物 LM-2 为 5 ‘ -CCCAAGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTCTAT-3‘；步骤三中融合PCR扩增引物为LM-3和SD-2，引物LM-3为5' -CGCGGATCCATGCTA CTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3 ‘；步骤六中 PCR 扩增引物为 LM-1 和 LM-2，引物 LM-1 为 5 ‘ -T GCTCTAGATTCGCATCCTCGGTTTTCTG-3 ‘；步骤七中 PCR 扩增引物为 SD-3 和 SD-4，引物 SD-3 为 5 ‘ -GCTCTAGAGCCGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAAC-3 ‘，引物 SD-4 为 5 ‘ -GTGAATTCCGG AGCTCTGCTCGAGCGAGGCCTAGCCGCCGGTCACACGCC为-3'；步骤^^一中 PCR扩增引物为 LM-11 和 LM-12，引物 LM-11 为 5 ‘ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3 ‘，引物 LM-12 为 5 ‘ -TG CTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3 ‘；步骤十三中 PCR 扩增引物为 eGFP-f 和 eGFP-r，引物 eGFP-f 为 5 ‘ -ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3 ‘，引物 eGFP-r 为 5 ‘ -T CAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3‘。表达效果验证试验1、质粒载体pSD-control的构建分别对质粒载体pMD18-T-CBA、pFastBac[pH-]进行)(ba I与EcoRI双酶切，获得CBA启动子与pFastBactpH-]片段，胶回收并进行连接，连接产物的转化Ε. coli DH5 α 感受态细胞后，以碱裂解法小量制备质粒，鉴定阳性克隆。以SV40-polyA-up与LM-9为引物，以质粒载体PEGFP-C3为模板扩增SV40-polyA片段，用EcoRI和RsrII将质粒载体 pFastBac [pH-]-CBA与SV40-polyA片段分别进行双酶切，胶回收进行连接，连接产物的转化E. coli DH5a感受态细胞后，提取重组质粒pSD-control。2、按照本实施方式步骤十四和十五的方法构建pSD-control-EGFP，并将 pSD-control-EGFP 转化 DHlOBac 细胞，获得重组载体 Bacmid-SD-control-EGFP，作为对照。3、利用脂质体介导转染法将Bacmid-SD-control-EGFP转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒BV-SD-control-EGFP。利用倒置显微镜观察正常Sf9昆虫细胞及重组病毒转染Sf9 细胞后的细胞病变情况。随后对细胞病变明显的样品进行病毒的回收，于_70°C长期保存。4、病毒的传代及培养Pl代病毒滴度较低，在IXlO6 IX IOWmL之间，扩增后滴度可达IXlO7 1 X 108pfu/mLo取ImL Pl代病毒液加入到处于对数生长期的悬浮培养的IOmL Sf9细胞中， 27°C，70r/min悬浮培养。感染后观察细胞病变，当细胞完全裂解后，lOOOr/min离心20min， 收集上清即为P2病毒储备。再取3mL P2储备感染对数生长期的悬浮培养的30mL Sf9细胞，270C，70r/min悬浮培养，直至细胞100 %出现病变，1000r/min离心20min，上清转入新的离心管中，此病毒液即为P3病毒储备，4°C避光保存。5、鸡原代胚骨骼肌细胞的制备鸡骨骼肌细胞来自培养10-12天的鸡胚细胞，小心的将皮肤从胸肌上剥离，然后将胸肌从骨骼上剥离，用剪子将其剪碎。用PBS组织块冲洗2-3次，剪成l-2mm3的小块。用含有0. 25 %胰蛋白酶和0. 03 % EDTA的PBS溶液37°C消化^iin后，立即加入含血清的DMEM 培养液终止消化，小心弃去液体保留组织块。用2-3mL DMEM培养液将细胞沉淀重新悬浮， 用吸管反复吹打2-3次，用四层纱布过滤。用血球计数板计数，细胞密度调整至3 X IO5个/ mL接种到六孔细胞培养板中，置于37°C，5% CO2培养箱培养。6、重组杆状病毒转染鸡原代胚骨骼肌细胞以每孔IX IO6个细胞将MYO接种到六孔细胞培养板中。置于37°C，5% CO2培养箱培养，细胞呈纤维状单层铺满率达80 %且生长状态良好时，接种病毒。移弃DMEM培养液，用PBS轻轻洗涤细胞表面两次后弃去。设定三个试验组(1)P3代BV-CBA-EGFP重组杆状病毒储液MOI (感染复数)=50，添加丁酸钠至终浓度为5mM ； (2) P3代BV-SD-EGFP重组杆状病毒储液MOI = 50，添加丁酸钠至终浓度为5mM ； (3)P3代BV-SD_EGFP-ITRs重组杆状病毒储液MOI = 50，添加丁酸钠至终浓度为5mM ；接种病毒用量通过此公式计算接种病毒体积(mL) = (Μ0Ι X细胞数)/病毒滴度。接种后置于371，5%0)2培养箱，病毒侵染细胞2 小时后，弃去病毒液。每孔加入3mL维持液(DMEM培养基加2%胎牛血清)，置于37°C，5% CO2培养箱培养48h。7、CBA启动的EGFP重组杆状病毒在鸡原代细胞中表达的检测细胞固定重组杆状病毒侵染鸡骨骼肌细胞4 后向每孔中加入IOOyL 4%多聚甲醛，25°C固定lOmin，弃去全部液体，每孔中加入IOOyL 4%多聚甲醛，25°C固定20min。 弃去全部液体，每孔中加入100 μ L PBS洗三遍，加入50 μ L核染料，25°C静置20min。弃去全部液体，每孔中加入IOOyL PBS洗三遍，使固定后的细胞浸泡在PBS溶液中，4°C保存。荧光图像的获得利用尼康公司生产的TE2000型倒置荧光显微镜观察细胞形态及EGFP表达情况，制备鸡原代骨骼肌细胞(MYO)，至其在六孔细胞营养板上铺满单层时，接种P3代重组杆状病毒储液。设定三个试验组(1)P3代BV-SD-control-EGFP重组杆状病毒储液，MOI = 50 ； (2)P3代BV-SD-EGFP重组杆状病毒储液，MOI = 50 ； (3)P3代 BV-SD-EGFP-ITRs重组杆状病毒储液，感染复数MOI = 50。感染48小时后，观察报告基因表达情况，图1为重组杆状病毒BV-SD-control-EGFP侵染MYO细胞48小时后EGFP的表达情况，图2为重组杆状病毒BV-SD-EGFP侵染MYO细胞48小时后EGFP的表达情况，图3为重组杆状病毒BV-SD-ITRs-EGFP侵染MYO细胞48小时后EGFP的表达情况。从图中可看出，与不添加VSV-GED、WPRE调控元件及ITRs序列的 BV-SD-control-EGFP重组杆状病毒相比，经过修饰改造的BV-SD-EGFP重组杆状病毒和 BV-SD-EGFP-ITRs重组杆状病毒所介导的EGFP基因的表达效率明显增强。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中PCR反应体 %% 50μ L, 2μ L Bacmid DNAUO μ L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 浓度为 0. 2mmol/ μ L 的 dNTP、1 μ L 弓丨物 SD-I、1 μ L 弓丨物 SD_2、0. 5 μ L浓度为 2. 5U/ μ L 的 Primer STAR DNA 聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，55°C退火 k，72°C延伸lmin，共30个循环，再72°C延伸lOmin。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中PCR反应体系为 50 μ L，由 2 μ L 质粒 pCMV-VSVG、10 μ L 5 X Primer STAR Buffer,4 μ L 浓度为 0. 2mmol/y L 的 dNTP、ly L 引物 SD_2、ly L 引物 LM_2、0. 5μ L 浓度为 2. 5U/y L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30个循环，再72°C延伸lOmin。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式所述质粒pCMV-VSVG购自addgene公司，质粒pCMV-VSVG图谱如图4 所示。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中融合PCR 反应体系为 50μ L，由 2μ L gp6hp 片段、2yL VSVGED 片段、10 μ L 5 X Primer STAR Buffer (Mg2+plus)、4 μ L 浓度为 2. 5mmol/ μ L 的 dNTP、1 μ L 浓度为 10 μ M 的引物 LM—3、1 μ L浓度为10 μ M的引物SD-2、0. 5 μ L浓度为2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，55°C退火k，72°C延伸 1.5min，共30个循环，再72°C延伸lOmin。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤四中将GV片段与 PMD18-T载体用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pMD18_T_GV。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤四中连接反应体系为10yL，由3μ L GV片段、IyL pMD18_T载体、5 μ LLigation solution和1 μ L去离子水组成；连接反应条件于16°C连接10 12h。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中用限制性内切酶BamH I和Hind III分别对质粒pFastBacl和质粒pMD18_T_GV进行双酶切，然后用 T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pFastBacl-GV。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤五中双酶切反应体系为20yL，由IyL被酶切质粒(质粒 pFastBacl 或质粒 pMD18-T-GV)、2yL IOXH buffer、。· 5μ L BamH 1,0. 5μ L Hind III 和余量的去离子水组成。本实施方式步骤五中连接反应体系为10yL，由2μ L pi^astBacl双酶切产物、 0. 5 μ LpMD18-T-GV双酶切产物、0. 2 μ LT4DNA连接酶和余量的去离子水组成。本实施方式所述质粒pFastBacl购自addgene公司，质粒pFastBacl图谱如图5 所示。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤六中PCR反应体系为 50yL，由 2yL pFastBacl-GV、10 μ L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 浓度为 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物 LM_1、1 μ L 引物 LM_2、0. 5 μ L 浓度为 2· 5U/μ L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s， 51°C退火k，72°C延伸1.5min，共30个循环，再72°C延伸lOmin。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤六中将PHGV片段与pMD18-T载体用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pMD18_T-pHGV。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤六中连接反应体系为10 μ L，由IyL 恥￥片段、3“1^ pMD18_T载体、5 μ L Ligation solution和1 μ L去离子水组成；连接反应条件于16°C连接10 12h。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤七中PCR反应体系为 50yL，由 2μ L 质粒 PjTriExIHygroUOy L 5 X Primer STAR Buffer、4yL 浓度为 0. 2mmol/y L 的 dNTPU μ L 引物 SD-3U μ L 引物 SD_4、0. 5 μ L 浓度为 2. 5U/μ L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，51°C退火5s，72°C延伸1. 5min，共30个循环，再72°C延伸lOmin。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式质粒pTriEx_2Hygro购自addgene公司，质粒pTriEx_2Hygro图谱如图6所示。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤七中将CBA启动子与pMDIS-T载体用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pMD18_T_CBA。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤七中连接反应体系为10yL，由3μ L CBA启动子、IyL pMD18_T 载体、5 μ L Ligation solution和1 μ L去离子水组成；连接反应条件于16°C连接10 12h。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤八中用限制性内切酶Xba I和Hind III分别对质粒pFastBac [pH-]和pGM18_T-pHGV进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pFastBac[ρΗ-]-ρΗΒ0Χ。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式质粒pFastBac [pH-]购自addgene公司，质粒pFastBac [pH-]图谱如图7所示。本实施方式步骤八中双酶切反应体系为20yL，由IyL被酶切质粒(质粒 pFastBac 或质粒 pGM18-T-pHGV)、2 μ L IOXH buffer.O. 5μ L Xba 1,0. 5μ L Hind III和余量的去离子水组成。本实施方式步骤八中连接反应体系为10yL，由2yL pFastBac [pH-]双酶切产物、0. 5μ LpGM18-T-pHGV双酶切产物、1 μ L IOXligation Buffer.O. 2μ L T4DNA连接酶和余量的去离子水组成。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤九中用限制性内切酶XbaI和EcoRI分别对质粒pFastBac [pH-] -pHBOX和pMD18_T_CBA进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pSD-CBA。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤九中双酶切反应体系为20yL，由IyL被酶切质粒(质粒 pFastBac -pHBOX 或质粒 pMD18-T-CBA)、2 μ L 10ΧΗ buffer、。· 5μ L Xbal.O. 5μ L EcoRI和余量的去离子水组成。本实施方式步骤九中连接反应体系为10 μ L，由0. 5 μ L pFastBac [pH-] -pHBOX双酶切产物、2 μ L pMD18-T-CBA 双酶切产物、1 μ L IOXligation Buffer.O. 2μ L T4DNA 连接酶和余量的去离子水组成。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤十中用限制性内切酶RsrII和EcoRI分别对质粒pSD-CBA和pT-soe2进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒PSD。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤十中双酶切反应体系为20yL，由IyL被酶切质粒(质粒 pSD-CBA或质粒pT-soe2)、2μ L IOXH buffer.O. 5μ L RsrII.O. 5μ L EcoRI 和余量的去离子水组成。本实施方式步骤十中连接反应体系为10yL，由0. 5yL pSD-CBA双酶切产物、 2μ LpT-soe2双酶切产物、1 μ L IOXligation Buffer.O. 2μ L T4DNA连接酶和余量的去离子水组成。本实施方式质粒pT-SOe2的构建方法为(1)片段WPRE的PCR扩增以质粒pWHV8为模板，以LM-8和LM-1 Ob为引物，进行 PCR扩增，PCR反应体系为 50μ L，由 2μ L pffHV8U0y L 5XPrimer STAR Buffer、4yL浓度为 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物 LM_8、1 μ L 引物 LM_10b、0. 5μ L 浓度为 2. 5U/μ L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成。PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30个循环，再72°C延伸IOmin0引物LM-8为5' -CGGAATTCACGCATGCTTGTCGACGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGA-3 ‘，引物 LM-1 Ob 为 5 ‘ -T AAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTAAAACAGGCGGGGAGGCGG-3‘。(2)片段pA的PCR扩增以质粒pEGFP_C3为模板，以LM-IOa和LM-9为引物，进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为 50μ L，由 2μ L pEGFP_C3、10 μ L 5 X Primer STAR Buffer, 4μ L浓度为 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物 LM_10a、l μ L 引物 LM_9、0. 5 μ L 浓度为 2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成。PCR反应条件94°C预变性5min， 94°C变性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30个循环，再72°C延伸IOmin0引物LM-IOa 为 5 ‘ -CCGCCTCCCCGCCTGTTTTAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTA-3 ‘，引物 LM-9 为 5 ‘ -A TACGGTCCGTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCAC-3‘。(3)片段WPRE与pA的融合融合PCR反应体系为50yL，由1.5yL WPRE片段 (37ng) ,4 μ L pA 片段(266ng) UO μ L 5 XPrimer STAR Buffer (Mg2+plus)、4 μ L 浓度为 2. 5mmol/ μ L的dNTP、1 μ L浓度为10 μ M的引物LM-8、1 μ L浓度为10 μ M的引物LM-9、 0. 5 μ L浓度为2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30个循环，再72°C延伸lOmin。对融合PCR产物soe2进行胶回收纯化。引物LM-8为5 ‘ -CGGAATTCACGCATGCTT GTCGACGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGA-3 ‘，引物 LM-9 为 5 ‘ -ATACGGTCCGTAAGATACA TTGATGAGTTTGGACAAACCAC-3‘。(4)片段soe2的TA克隆PCR产物末端加“Α”反应体系为25yL，由2. 5 μ L 10XTaqBuffer,2y L 2. 5mM 的 dNTP Mixture、20 μ L 胶回收产物和 O. 5 μ L 5U/μ L 的 Taq DNA聚合酶组成，72°C反应15分钟。连接反应体系为5 μ L，由0. 5 μ L pMD18_T载体、片段 soe2加“A”产物、Solution I和余量的ddH20组成，16°C条件下连接12h，获得重组质粒 pT-soe2。Solution I为pMD18_T载体配套缓冲液，内含T4DNA连接酶，购买自大连宝生物工程有限公司。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤十一中PCR 反应体系为 50μ L，由 2μ L pAAV-LacZUOy L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 浓度为 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物LM-11、1 μ L引物LM-12、0. 5μ L浓度为 2. 5U/μ L 的Primer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s， 51°C退火k，72°C延伸1.5min，共30个循环，再72°C延伸lOmin。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式pAAV-LacZ 购自 Biovector Science Lab 公司，pAAV-LacZ 质粒图谱如图8所示。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤十一中用限制性内切酶)(bal分别对质粒载体pSD和L-ITR片段进行单酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pSD-L-ITR。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤十一中单酶切反应体系为30 μ L，由20 μ L被酶切质粒或片段(质粒pSD或片段L-ITR)、3yL 10XM buffer、3yL XbaI和余量的去离子水组成。本实施方式步骤i^一中连接反应体系为10 μ L，由1 μ L pSD单酶切产物、3 μ L片段L-ITR单酶切产物、5 μ L T4DNA连接酶和余量的去离子水组成。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤十二中用限制性内切酶Rsr II分别对质粒pSD-L-ITR和R-ITR片段进行单酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pSD-ITRs。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤十二中单酶切反应体系为30 μ L，由20 μ L被酶切质粒或片段(质粒pSD-L-ITR或片段R-ITR)、3yL IOXM buffer、3yL Rsr II和余量的去离子水组成。本实施方式步骤十二中连接反应体系为10 μ L，由2 μ L pSD_L_ITR单酶切产物、 0.5μ L 片段 R-ITR单酶切产物、IyL IOXligation Buffer、。· 2μ L T4DNA 连接酶和余量的去离子水组成。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤十三中PCR反应体系为 50μ L，由 2μ L 质粒 pEGFP-C3、10y L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 浓度为 0. 2mmol/ μ L 的 dNTP、1 μ L 引物 eGFP-f、1 μ L 引物 eGFP_r、0. 5 μ L 浓度为 2. 5U/ μ L 的 Primer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，51°C退火5s，72°C延伸1. 5min，共30个循环，再72°C延伸lOmin。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式质粒pEGFP-C3购自上海研域化学试剂有限公司，质粒pEGFP_C3图谱如图9所示。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤十三中将EGFP 基因和pMD18-T载体用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pMD18_T_EGFP。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤十三中连接反应体系为10yL，由3yL EGFP基因、IyL pMD18_T 载体、5 μ L T4DNA连接酶和余量的去离子水组成。
具体实施方式
十九本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤十四中构建质粒pSD-EGFP是用限制性内切酶EcoRI和Mil分别对质粒pSD和pMD18_T_EGFP进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pSD-EGFP。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤十四中双酶切反应体系为20 μ L，由IyL被酶切质粒(质粒pSD 或质粒 pMD18-T-EGFP)、2yL 10Xbuffer、0. 5 μ L EcoRI.O. 5μ L Sail 和余量的去离子水组成。本实施方式步骤十四中连接反应体系为10yL，由0.5yL pSD双酶切产物、 2yLpMD18-T-EGFP 双酶切产物、IyL IOXligation Buffer.O. 2μ L T4DNA 连接酶和余量的去离子水组成。
具体实施方式
二十本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤十五中构建质粒pSD-ITRs-EGFP是用限制性内切酶EcoRI和MlI分别对质粒pSD-ITRs和pMD18_T_EGFP 进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pSD-ITRs-EGFP。其它与具体实施方式
一相同。本实施方式步骤十五中双酶切反应体系为20 μ L，由IyL被酶切质粒(质粒 pSD-ITRs 或质粒 pMD18-T-EGFP)、2μ L 10Xbuffer,0. 5 μ L EcoRI.0. 5μ L Sail 和余量的去离子水组成。本实施方式步骤十五中连接反应体系为10 μ L，由2 μ L pSD_ITRs双酶切产物、 0. 5yLpMD18-T-EGFP 双酶切产物、IyL IOXligation Buffer、0. 2 μ L T4DNA 连接酶和余量的去离子水组成。
具体实施方式
二十一本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤十六将 100 μ LDHlOBac感受态细胞分装于2个离心管中，分别加入5 μ L的质粒pSD-EGFP和5 μ L 的质粒pSD-ITRs-EGFP混勻，冰中放置30min，然后42°C热休克45s，立即冰浴2min，分别加入预先温育的900 μ L S. 0. C培养基，370C 225r/min振荡培养4h，用S. 0. C培养基对细胞做梯度稀释(ΙΟ—1，ΙΟ"2, ΙΟ"3)，每个梯度中取100 μ L涂于LB琼脂平板(含50 μ g/mL卡那霉素，7 μ g/mL 庆大霉素，10 μ g/mL 四环素，100 μ g/mL X-gal 和 40 μ g/mL IPTG.)，37°C培养48h，筛选白色克隆，并进行鉴定分析，含有EGFP基因的重组阳性Bacmid即为重组载体 Bacmid-SD-EGFP和Bacmid-SD-ITRs-EGFP。其它与具体实施方式
一相同。
权利要求
1.具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，按以下步骤进行一、PCR 扩增 Bacmid DNA 中的 gp64sp 片段；二、PCR 扩增 pCMV-VSVG 中的 VSVGED 片段；三、融合PCR扩增gp64sp-VSVGED融合片段；四、将GV片段引入pMD18_T载体，构建质粒 pMD18-T-GV ；五、构建质粒 pFastBacl-GV ；六、PCR 扩增 pFastBacl-GV 中的 pHGV 片段， 将pHGV片段引入pMD18-T载体，构建质粒pGM18_T-pHGV ；七、PCR扩增质粒pTriEx_2Hygro 中的CBA启动子，将CBA启动子克隆至pMD18-T载体，构建质粒pMD18_T_CBA ；八、构建质粒载体PFastBac [pH_]-pHBOX ；九、构建质粒载体pSD_CBA ；十、构建质粒载体pSD ； 十一、PCR扩增质粒pAAV-LacZ中的L-ITR片段和R-ITR片段，将L-ITR片段引入质粒载体pSD，构建质粒pSD-L-ITR ；十二、将R-ITR片段引入质粒pSD-L-ITR，构建pSD-ITRs ； 十三、PCR扩增质粒pEGFP-C3中的EGFP基因，将EGFP基因克隆至pMD18_T载体，构建质粒pMD18-T-EGFP ；十四、构建质粒pSD_EGFP ；十五、构建质粒pSD_ITRs_EGFP ；十六、质粒 pSD-EGFP和质粒pSD-ITRs-EGFP分别转化DHlOBac细胞，获得重组载体Bacmid-SD-EGFP 和Bacmid-SD-ITRs-EGFP ；十七、利用脂质体介导转染法将Bacmid-SD-EGFP和 Bacmid-SD-ITRs-EGFP 转染 Sf9 细胞，获得重组杆状病毒 BV-SD-EGFP 和 BV-SD_ITRs_EGFP ； 其中步骤一中 PCR 扩增引物为 SD-I 和 SD-2，引物 SD-I 为 5 ‘ -CGCGGATCCATGCTACTAGTAAA TCAGTCACACCAAG-3 ‘，引物 SD-2 为 5 ‘ -ATTTTTGGATAGCCCAGTATCCGCAAAGGCAGAATGC-3 ‘； 步骤二中 PCR 扩增引物为 SD-2 和 LM-2，引物 LM-2 为 5 ‘ -CCCAAGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCAT CTCTAT-3‘；步骤三中融合PCR扩增引物为LM-3和SD-2，引物LM-3为5' -CGCGGATCCATGC TACTAGTAAATCAGTCACACCAAG-3 ‘；步骤六中 PCR 扩增引物为 LM-1 和 LM-2，引物 LM-1 为 5 ‘ -TGCTCTAGATTCGCATCCTCGGTTTTCTG-3 ‘；步骤七中 PCR 扩增引物为 SD-3 和 SD-4，引物 SD-3 为 5' -GCTCTAGAGCCGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAAC-3'，引物SD-4 为 5' -GTGAATTCC GGAGCTCTGCTCGAGCGAGGCCTAGCCGCCGGTCACACGCC-3 ‘；步骤i^一中 PCR 扩增引物为 LM-11 和 LM-12，引物 LM-11 为 5 ‘ -TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3 ‘，引物 LM-12 为 5 ‘ -TG CTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG-3 ‘；步骤十三中 PCR 扩增引物为 eGFP-f 和 eGFP-r，引物 eGFP-f 为 5 ‘ -ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG-3 ‘，引物 eGFP-r 为 5 ‘ -T CAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3‘。
2.根据权利要求1所述具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法,其特征在于步骤一中PCR反应体系为50yL，由2μ L Bacmid DNAUO μ L 5 X Primer STAR Buffer、4 μ L 浓度为 0. 2mmol/ μ L 的 dNTP、l μ L 引物 SD-1、1 μ L 引物 SD_2、0. 5 μ L 浓度为2. 5U/y L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30个循环，再72°C延伸IOmin0
3.根据权利要求1所述具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤二中PCR反应体系为50μ L，由2μ L质粒pCMV-VSVG、10μ L 5 X Primer STAR Buffer、4y L 浓度为 0. 2mmol/y L 的 dNTP、l μ L 引物 SD-2U μ L 引物 LM_2、0. 5 μ L 浓度为 2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性 5min，94°C变性 10s，55°C退火 5s，72°C延伸 lmin，共 30 个循环，再 72°C延伸 IOmin0
4.根据权利要求1所述具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法， 其特征在于步骤三中融合PCR反应体系为50yL，由2μ L 8 64印片段、2111^ VSVGED片段、.10 μ L 5 XPrimer STAR Buffer (Mg2+plus)、4 μ L 浓度为 2. 5mmol/μ L 的 dNTP、1 μ L 浓度为10 μ M的引物LM-3、1 μ L浓度为10 μ M的引物SD-2、0. 5 μ L浓度为2. 5U/ μ L的Primer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s， 55°C退火k，72°C延伸1.5min，共30个循环，再72°C延伸IOmin0
5.根据权利要求1所述具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤六中PCR反应体系为50μ L，由2μ L pFastBacl-GVUOy L 5XPrimer STAR Buffer、4y L 浓度为 0. 2mmol/y L 的 dNTP、1 μ L 引物 LM_1、1 μ L 引物 LM_2、0. 5 μ L 浓度为 2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性 5min，94°C变性 10s，51°C退火 5s，72°C延伸 1. 5min，共 30 个循环，再 72°C延伸 IOmin0
6.根据权利要求1所述具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤七中PCR反应体系为50 μ L，由2 μ L质粒PiTriExjHygroUO μ L 5 X Primer STAR Buffer、4y L浓度为 0. 2mmol/μ L 的 dNTP、1 μ L 引物 SD-3、1 μ L 引物 SD_4、0. 5 μ L浓度为2. 5U/y L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，51°C退火5s，72°C延伸1. 5min，共30个循环，再72°C延伸IOmin0
7.根据权利要求1所述具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤i^一中 PCR 反应体系为 50 μ L，由 2 μ L pAAV-LacZUO μ L 5 X Primer STAR Buffer、4y L 浓度为 0. 2mmol/y L 的 dNTP、1 μ L 引物 LM_11、1 μ L 引物 LM_12、0. 5 μ L 浓度为2. 5U/y L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性 5min，94°C变性 10s，51°C退火 5s，72°C延伸 1. 5min，共 30 个循环，再 72°C延伸 IOmin0
8.根据权利要求1所述具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法， 其特征在于步骤十三中PCR反应体系为50yL，由2 μ L质粒pEGFP_C3、10 μ L 5XPrimer STAR Buffer,4 μ L 浓度为 0. 2mmol/ μ L 的 dNTP、1 μ L 弓 | 物 eGFP-f、1 μ L 弓 | 物 eGFP-r、 0. 5 μ L浓度为2. 5U/ μ L的I^rimer STAR DNA聚合酶和余量的去离子水组成；PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性10s，51°C退火5s，72°C延伸1. 5min，共30个循环，再72°C 延伸lOmin。
全文摘要
具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，涉及一种具有CBA启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。解决现有重组杆状病毒介导的基因表达效率低的问题。方法依次构建pMD18-T-GV、pFastBac1-GV、pGM18-T-pHGV、pMD18-T-CBA、pFastBac[pH-]-pHBOX、pSD-CBA、pSD、pSD-L-ITR和pSD-ITRs；构建pMD18-T-EGFP；构建pSD-EGFP；构建pSD-ITRs-EGFP；转化DH10Bac细胞，获得重组载体；转染，获得重组杆状病毒。经过修饰改造的重组杆状病毒所介导的EGFP基因的表达效率明显增强。
文档编号C12N15/66GK102533861SQ20121001279
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者平文祥, 楼庄伟, 葛菁萍, 高冬妮 申请人:黑龙江大学