一种重组杆状病毒表面展示系统及回收可溶性蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及利用杆状病毒表面展示系统展示可溶性蛋白以及从杆状病毒表面回收可溶性蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒，自20世纪80年代被开发为表达载体依赖，由于其真核表达环境等优点，受到了广泛的重视和研究，在短短不到30年的时间里，杆状病毒表达体系的重组载体构建技术、筛选技术得到了很大程度的改进和简化，成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达载体系之一。在表面展示、类病毒颗粒表达、哺乳动物基因转移、RNA干扰等方面取得了重要的成果。
[0003]杆状病毒基因组为130kb左右，因此可以容纳较大的外源DNA片段。病毒基因组中多角体蛋白基因是病毒感染晚期高效表达的基因，却是病毒复制增殖的非必需区，因此适用于插入外源基因的多拷贝。该基因受强启动子调控，可较高水平表达外源蛋白。外源DNA插入多角体蛋白基因内，使此基因功能丧失，不能再合成多角体蛋白。另外，杆状病毒表面展示系统能够完成翻译后蛋白质的加工修饰，使外源产物具有较高生物学活性。
[0004]杆状病毒表面展示系统在经过不断地研究与改进后，表现出了极为广阔的应用前景，该系统属于高等真核生物展示系统，可弥补原核展示系统的不足，并保持表面展示系统的优点，在高亲和力抗体及多肽药物的筛选、蛋白质抗原表位分析、构建多肽文库和抗体库、新型疫苗研制、基因治疗等方面具有广阔的应用前景。
[0005]虽然目前杆状病毒表面展示系统已经研究的很成熟了，但是目前商业化的杆状病毒-昆虫表达系统的蛋白表达量较低，且表达的蛋白难以分离纯化。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一是为了克服以上的技术缺陷提供一种可溶性蛋白杆状病毒表面展示系统。
[0007]本发明的目的之二是为了提供一种对上述杆状病毒表面展示的可溶性蛋白进行回收的方法。
[0008]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
[0009]—种重组杆状病毒表面展示系统，所述展示系统除含有表达载体外，其特征在于，还包括特定基因片段，所述特定基因片段包括:GP64信号肽、缺失信号肽的目的可溶性蛋白cDNA、蛋白标签、酶切位点以及终止密码子。
[0010]进一步地，所述缺失信号肽的目的可溶性蛋白cDNA基因片段位于GP64信号肽与蛋白标签之间。
[0011]进一步地，所述表达载体为pFastBaclvector。
[0012]进一步地，所述蛋白标签为MyC、His、GST或HA，优选为His标签。
[0013]进一步地，所述终止密码子为TGA，TAA或TAG，优选为TAG。
[0014]利用上述重组杆状病毒表面展示系统回收可溶性蛋白的方法，
[0015]1)构建表达载体及转化大肠杆菌:首先通过基因扩增方法得到含有目的可溶性蛋白核酸序列的基因片段，将得到的基因片段插入到表达载体中，然后转化大肠杆菌，酶切位点选用凝血酶的切割位点；基因片段插入表达载体的步骤包括:首先对表达载体进行消化处理，然后在连接酶的作用下将表达载体与核酸序列进行连接，形成完整的环状质粒，最后将环状质粒转化到大肠杆菌DH5a中；
[0016]2)表达载体验证:在得到大肠杆菌Amp抗性转化株后，挑取部分转化株，在含有Amp浓度为80-120 μ g/mL的LB液体培养基中过夜培养，抽提质粒，使用酶切消化处理质粒DNA ;通过琼脂糖凝胶电泳分析重组质粒是否插入正确的位点，同时用PCR方法对阳性转化株进行分析，最后，将找到的阳性重组子进行测序，验证转化质粒的正确性；
[0017]3)表达目的可溶性蛋白用重组杆状病毒粒子克隆的制备:提取阳性重组子的质粒DNA，并将其转化进入大肠杆菌DHlOBacTMEcoli，转变为杆粒；利用蓝/白斑法筛选出含有重组杆粒的克隆，在LB培养基中培养含有重组杆粒的大肠杆菌，抽提重组杆粒，冻干保存，备用；
[0018]4)昆虫细胞的转染和重组杆状病毒粒子的收集:①sf9细胞计数，取12.5cm2新细胞培养瓶，每瓶加入9 X105个细胞，并以全培培养12-24h，使细胞贴壁；②溶解2yg步骤3)得到的纯化重组杆状病毒质粒于100 μ L无添加成分的Grace’ s培养基中；③将转染试剂充分摇匀后，取10 μ L加入100 μ L无添加成分的Grace’ s培养基中，混匀；④将②和③所得溶液混匀，室温孵育30min，同时以2mL含10% FBS的Grace’s培养基洗涤待转化的细胞并弃去洗涤液；⑤取0.8mL无添加成分的Grace’s培养基加入④所得质粒于转染剂的混合液中，轻轻混匀，总体积约lmL，加入④步洗涤完成的待转化的细胞中，27°C继续培养5h ;⑥移除质粒、转染试剂混合物，加入2mL含10% FBS的Grace’ s培养基，27°C孵育，直至病变现象产生?’⑦5天后，lOOOrpm离心lOmin收集细胞培养液中的重组杆状病毒粒子，转移上清到冻干管中，贴上标签，置于4°C冰箱中避光保存。
[0019]5)重组杆状病毒粒子的扩增以及目的可溶性蛋白的表达:①取适当体积的重组杆状病毒粒子原液加入到汇聚度90%的新鲜传代的sf9细胞中，27°C恒温培养箱中，静置lh，每隔15min轻轻晃动一次；②去掉培养瓶中的培养液，加入新鲜的含10% FBS的Grace’ s培养基，27°C恒温培养箱中恒温培养3天后，lOOOrpm离心lOmin收集细胞培养液中的病毒粒子，转移上清液到冻干管中，贴上标签，置于4°C冰箱中避光存放；④得到的重组病毒粒子重复上述①-③步骤，以获得更高滴度的病毒粒子；⑤加入高滴度的重组杆状病毒粒子到汇聚度达95%的新鲜传代的sf9细胞中，27°C恒温培养箱中，静置lh，每隔15min轻轻晃动一次；⑥去掉培养瓶中的培养液，加入新鲜的含10% FBS的Grace’ s培养基，27°C恒温培养箱中恒温培养?’⑦40-44h后，轻轻倒尽细胞上清培养液，加入预冷的细胞裂解液，冰上静置30min ;⑧收集细胞裂解液，加入等体积的2 X SDS凝胶加样缓冲液上样缓冲液，混匀，100°C保持lOmin SDS-PAGE检测蛋白质的表达情况；
[0020]6)目的蛋白的回收:目的可溶性蛋白展示完成后，将上述步骤5)得到的重组杆状病毒粒子溶液于18000-22000rpm，4°C离心15分钟，收集沉淀，既得表面展示有目的可溶性蛋白的重组杆状病毒粒子，后用少量的纯水重悬重组杆状病毒粒子得重组杆状病毒粒子溶液，用终浓度为500-1000单位/L的凝血酶切割重组杆状病毒粒子表面的可溶性蛋白，使带有特定标签的目的可溶性蛋白与杆状病毒分离，然后用带有特定标签的分离柱对目的蛋白进行回收纯化，最后得到高纯度的目的蛋白。
[0021]本发明提供的一种重组杆状病毒表面展示系统及回收可溶性蛋白的方法，此展示系统可以展示不同种属的可溶性蛋白，利用N端展示技术将可溶性目的蛋白展示在杆状病毒表面，然后利用回收和纯化杆状病毒、酶切使目的蛋白与杆状病毒分开、再利用特定的标签回收目的蛋白，得到蛋白的活性、产量等各个方面都有极大的改进和完善，适用于诊断抗原以及活性蛋白的开发。同时，本发明利用特定的蛋白分离、纯化方法，从杆状病毒表面回收可溶性的目的蛋白，该回收方法可以提高可溶性蛋白的回收效率，适用于大规模的工业应用。
【附图说明】
[0022]图1为本发明实施例1提供的包含目的可溶性蛋白基因序列的特定基因片段，该特定的基因片段包含有:ATG、GP64信号肽、缺失信号肽的目的可溶性蛋白cDNA、9His标签、凝血酶切割位点、TM(跨膜区)、CT(胞内部分)、终止密码子。
[0023]图2为本发明实施例1提供的构建完成的含有目的可溶性蛋白的环状质粒结构示意图。
[0024]图3为本发明实施例1提供的方法与空载质粒实验结果的比对，图中1对应的条带是空载质粒同样实验的结果，图中2对应的条带是采用本发明的方法制备出来的PCV-20RF2蛋白条带实验结果。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。
[0026]实施例1重组PCV-2 0RF2蛋白杆状病毒表面展示及再回收工艺
[0027]1、构建表达载体及转化大肠杆菌。
[0028]首先，用下列引物扩增序列表中SEQ ID N0.1，其中SEQ ID N0.1是PCV-2 0RF2蛋白的全基因序列，序列长度为702bp。
[0029]P1:5，-TCAGGATCCATGACGTATTCCAAGGAGGCG-3’
[0030]P2:5， -GCTCTCGAGTAAGTGGGGGGTCTTTAAG-3?
[0031]以上引物由武汉金开瑞生物工程有限公司自行合成，依照说明溶解于适量灭菌超纯水中，按20 μ L/管分装，保存于-20 °C冰箱备用。
[0032]SEQ ID N0.1序列表中的核苷酸序列扩增完成后，将经过测序验证正确的核苷酸序列为模板，以下列引物扩增模板，得到缺失N端41个氨基酸的核定位信号区的0RF2基因，该扩增片段的长度为579bp。
[0033]P3:5’ -GCTCTCGAGATGAATGGCATCTTC-3’ (下划线为 Xhol 酶切位点)
[0034]P4:5’ -GGGCTGCAGAAGTGGGGGGTCTTTAAG-3’ (下划线为 PstI 酶切位点)。
[0035]基因扩增完成之后，按照PCR产物回收试剂盒的说明书对特定的目标片段序列进行回收、纯化。
[0036]特定片段的序列回收、纯化完成之后将载体质粒与目的基因的限制性酶切反应均参照供应商提供的条件进行(购自英骏公司)。配制酶切反应体系时按照双蒸水、对应的酶切Buffer、PCR产物片段、限制性内切酶(Xhol、PstI)的顺序加入，酶切反应的条件为37°C3.5h。酶切完成后按照方法进行琼脂糖电泳回收，再进行连接反应。连接反应的反应体系如下:在20 μ L的反应体系中，加入1/10总体积的10Χ连接Buffer，再加入一定量的外源片段及载体DNA，再加入1 μ L的连接酶后，加水补齐总体积至20 μ L混匀，混匀置于16 °C连接过夜。
[0037]质粒与目标基因片段连接完成之后即转化感受态的大肠杆菌细胞DH5α。
[0038]2、表达载体验证。
[0039]在得到Amp抗性转化株后，挑取10个转化株，在含有100 μ g/mL Amp的LB培养基中过夜培养，抽提质粒，使用BamHI和Sail消化处理质粒DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析重组质粒是否插入正确的位点，同时用PCR方法对阳性转化株进行分析，最后，将找到的阳性重组子进行测序，验证转化质粒的正确性。
[0040]3、表达PCV-2 0RF2蛋白用杆状病毒粒子克隆的制备。
[0041]提取阳性重组子的质粒DNA，并将其转化进入D