重组质粒、利用该重组质粒制备的重组杆状病毒以及该病毒在疫苗制备中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种经改造的杆状病毒质粒即重组质 粒，利用该重组质粒制备的含目的基因（间日疟传播阻断候选抗原PVS25基因）的重组杆状 病毒，该重组杆状病毒的制备方法，该重组杆状病毒表达的融合蛋白，以及该重组杆状病毒 和该融合蛋白在间日疟传播阻断疫苗制备中的应用。
【背景技术】
[0002] 间日疟是由间日疟原虫引起的周期性发作的急性传染病，特点是间隔48小时反 复发作。如今面世的集中抗疟疾药物也由于抗药性疟原虫以及耐杀虫剂传播蚊的出现而面 临挑战。制备疟疾疫苗也就成为了能有效控制疟疾传播的主要手段。其中传播阻断疫苗是 以蚊阶段疟原虫特异表达的虫体表面蛋白作为抗原免疫人体，使之产生抗蚊阶段疟原虫表 面蛋白的特异性抗体。间日疟传播阻断候选抗原Pvs25是疟疾研究的主要靶点，其在不同 地区的痕疾病毒株间具有很商的保守性。
[0003] 现在的生物技术常用的生物体是各种种类的酵母菌核大肠杆菌，但是通过大肠杆 菌表达出来的Pvs25蛋白在传播阻断实验中并没有检测到有明显的免疫原性和免疫保护 性，而用酵母其中的毕赤酵母表达的Pvs25蛋白可以有很好的表达，得到的抗体也可以检 测到免疫原性和保护性，而且已经进入了临床I期，但是在进入下一期临床的时候，人体产 生了排斥反应。现如今表达的哺乳动物表达系统可以看到效果，但是表达量很低，成本相对 较高，不满足大量生产需要。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种重组杆状病毒 质粒，利用该重组质粒构建表面展示间日疟传播阻断候选抗原PVS25的重组杆状病毒，通 过简单地分离纯化病毒粒子，制备抗体具有良好的抗体效价，能够为间日疟传播阻断疫苗 的研究提供参考。在家蚕BmN细胞中传代培养细胞获得F3代病毒，以此F3代病毒接种家蚕 BmN，从细胞中分离纯化获得病毒粒子，其可以直接作为疫苗，免疫Balb/c小鼠，间接ELISA 检测抗体效价能达到1:25600。此种方法相比较原核的和其他的真核表达系统生产疫苗的 方法具有安全性好、生产成本低、易于大规模生产操作的特点。
[0005] 本发明所采用的技术方案为：
[0006] 一种重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM，该重组质粒由一段重组序列插入到 pFastBacDual质粒中构建而成，所述重组序列为根据CMV、Pph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列间加入Xba I酶切位点和Xho I酶切位点，CMV-F前加入Kpnl酶切位点，TM-R 后加入Hindlll酶切位点形成，所述重组序列全长为923bp，如SEQ ID N0:1所示。
[0007] 具体地，所述重组序列插入到pFastBacDual质粒的Kpnl酶切位点和Hindlll酶 切位点之间。
[0008] 本发明进一步提供利用上述重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM构建的重组 杆状病毒BmPvs25,该重组杆状病毒由间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到重组质 粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组， 获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞 内包装得到表面展示有间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒。
[0009] 具体地，所述Pvs25基因插入到重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba I 酶切位点和Xho I酶切位点之间。
[0010] 具体地，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。
[0011] 穿梭载体Bacmid(即Baculovirusplasmid)为带有杆状病毒基因组的质粒，可在 细菌和昆虫细胞之间穿梭，是Bac-to-bac杆状病毒表达系统的成员之一，该系统还包括供 体质粒和辅助质粒及大肠杆菌，为现有技术。
[0012] 载体pFastBacDual是Bac-to-bac表达系统的供体质粒，可以插入外源基因并在 辅助质粒编码的转座酶作用下，将外源基因插入到Bacmid中。载体pFastBacDual已经商 品化；CMV启动子为哺乳动物启动子，将其插入杆状病毒后，杆状病毒可以在哺乳动物里表 达外源基因。
[0013] 上述重组杆状病毒BmPvs25的制备方法，包括以下步骤：
[0014] (1)通过PCR扩增的方法得到间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因，然后将Pvs25 基因连接到重组质粒PFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的XbaI酶切位点和XhoI酶切位点 之间，得到重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25-TM;
[0015] (2)将重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25_TM转化含杆状病毒穿梭 载体Bacmid的大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、 四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-48h后挑取白斑，白 斑继续培养24-48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定；
[0016] (3)取步骤（2)鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕 BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为 表面展示间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25。
[0017] 上述重组杆状病毒BmPvs25所表达的融合蛋白SP-Pvs25-TM，由间日疟传播阻断 候选抗原Pvs25的N端接gp64分泌性信号肽（SP)、C端接gp64跨膜结构域（TM)构成，其 氨基酸序列如SEQIDN0 :8所示。
[0018] 本发明进一步提供上述重组杆状病毒BmPvs25在间日疟传播阻断疫苗制备中的 应用。简单纯化病毒粒子后免疫Balb/c雌鼠获得抗体，间接ELISA测效价可达到1:25600。
[0019] 本发明还进一步提供重组杆状病毒BmPvs25所表达的融合蛋白SP-Pvs25-TM在间 日疟传播阻断疫苗制备中的应用。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
[0021] (1)本发明通过分析间日疟传播阻断候选抗原PVS25基因，发现其含有4个 EGF-1ike结构域，但是本发明中所用到的是经过优化后的编码138个氨基酸的Pvs25序列。 利用此经过改造后的Pvs25序列作为家蚕表面展示系统的研究，可以作为一种模型用于其 他间日疟传播阻断疫苗的研究。
[0022] (2)本发明将间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因与家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64 基因融合，家蚕杆状病毒囊膜蛋白GP64含有两个高度疏水区：N-末端的分泌性信号肽（SP) 和C-末端的跨膜结构域（TM)，与跨膜结构域相连的是亲水性结构域，可以把病毒囊膜与宿 主细胞膜内的糖蛋白连接在一起，从而使本发明实现了目的Pvs25蛋白在病毒衣壳上的表 面展示。
[0023] (3)本发明构建的表面展示间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒， 可以利用家蚕BmN细胞作为生物反应器和家蚕杆状病毒表面展示高效表达系统表达具有 极高的临床应用价值的间日疟传播阻断候选疫苗，通过家蚕杆状病毒表达系统高效表达 Pvs25蛋白。本方法适用于大规模生产，降低了成本，且产量高，所生产的间日疟传播阻断疫 苗应用价值大。
[0024] (4)目前Pvs25疫苗尚无利用杆状病毒表面展示技术生产，家蚕杆状病毒表达系 统是真核表达，具有翻译后修饰功能，能使表达的蛋白其结构更接近于其天然构象，使其更 加具有免疫活性，通过简单地分离纯化病毒粒子，免疫Balb/c小鼠，获得的抗体具有良好 的抗体效价。
【附图说明】
[0025] 图1所示的是载体pFastBacDual的结构示意图。
[0026] 图2所示的是重组质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM电泳鉴定图，其中M:DNA 分子量标准；1 :CMV-Pph-SP-TM基因PCR扩增产物，箭头位置为目的序列，923bp;2:重组载 体双酶切产物。
[0027] 图3所示的是重组转座质粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25_TM的PCR鉴定电 泳图，其中M:DNA分子量标准，1 :Pvs25目的基因PCR扩增产物，2 :Pvs25目的基因双酶切 产物。
[0028] 图4所示的是重组杆状病毒BmPvs25的PCR产物电泳鉴定图，其中M:DNA分子量 标准；1.M13F和M13R为上下游引物PCR结果；2.M13F和TM基因下游引物PCR结果；3.CMV 上游引物和M13R为引物PCR结果。
[0029] 图5所示的是重组杆状病毒BmPvs25的Pvs25蛋白WesternBlot检测结果图，其 中M:蛋白分子量标准，1:接种重组BmPvs25的发病细胞，2:正常细胞。
[0030] 图6所示的是激光共聚焦鉴定融合重组病毒在家蚕BmN细