专利名称：提高家蚕杆状病毒表达系统外源蛋白质表达水平的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术、杆状病毒基因表达系统，尤其是涉及一种利用提高 家蚕杆状病毒表达系统外源蛋白质表达水平的方法。
背景技术：
家蚕杆状病毒基因表达系统是目前高效的真核表达系统之一。其工作原理
是利用家蚕杆状病毒BmNPV —种晚期高效表达的基因一多角体基因，能够被 外源基因取代而不影响病毒的复制，从而将外源基因插入到多角体基因启动子 的后面进行表达。在野生型病毒中，多角体蛋白的表达水平可以达到感染细胞 的总蛋白的30—50%。虽然，利用该系统已经进行了上千种外源基因的表达， 但与病毒本身的多角体基因的表达水平相比，外源目的蛋白质的表达水平远远 没有达到像多角体蛋白质的水平。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用提高家蚕杆状病毒表达系统外源蛋白质表 达水平的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下
1) 以家蚕杆状病毒BmNPV基因组为模板，通过PCR技术克隆多角体启动 子和多角体基因PolyhedrinN-端从起始密码子ATG开始的编码50个氨基酸，即 150个核苷酸的基因序列，然后通过体外连接的方法，在其C端与报告基因一绿 色荧光蛋白基因EGFP进行连接，成为一个融合基因；随后将该融合基因克隆 入杆状病毒供体质粒pFas氾acHTa，构建完成一个重组的杆状病毒供体载体；
2) 然后利用已经构建的适用于家蚕的杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，其工 作原理为重组杆状病毒通过细菌转座子的基因定位转移作用，在大肠杆菌内 实现基因的转移重组，获得重组病毒。
3) 重组病毒系统由供体质粒、含有家蚕杆状病毒BmBacmid基因组的感受 态细菌DH10BmBac构成，其产生重组病毒的原理是首先将外源目的基因克 隆入供体质粒，然后将供体质粒转化入DH10BmBac感受态细胞中，通过细菌 转座子的定点转位作用，将启动子和目的基因一并转入家蚕杆状病毒基因组而 产生重组病毒DNA，最后转染家蚕培养细胞而获得含有目的基因重组病毒。
本发明具有的有益效果是利用重组病毒作为载体，感染家蚕培养细胞，在细胞内进行蛋白质的表达，
感染96小时后分析蛋白质表达情况。结果表明，通过与多角体基因N-端序列的 融合，外源基因的表达水平得到了提高，增加的幅度为2—3倍。与外源基因单 独表达相比，显著提高了外源基因的表达水平，从而大大提高了家蚕杆状病毒 表达系统的工作效率。
图1是用于Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒图谱。
图2是构建的表达EGFP的重组病毒感染家蚕培养细胞和家蚕幼虫的情况。
(a)感染BmN培养细胞。左边为未感染的正常细胞，右边为感染后96 h的
感染情况；(b)感染家蚕幼虫。左边为对照，右边为接种96 h后出现症状的病蚕。 图3是融合表达EGFP的重组病毒感染家蚕培养细胞后的蛋白质分析。 采用12%SDS-PAGE。图标为M，表示蛋白质标准分子量，CK，表示对
照，即没有融合表达、仅表达EGFP基因，1，表示采用本申请专利技术、用
融合表达的蛋白质情况。箭头表示EGFP蛋白，由于融合了部分多角体基因序
列，分子量有所增加。
具体实施例方式
以家蚕杆状病毒BmNPV基因组为模板，通过PCR技术克隆多角体启动子 和多角体基因Polyhedrin N-端从起始密码子ATG开始的编码50个氨基酸，即 150个核苷酸的基因序列，然后通过体外连接的方法，在其C端与报告基因一绿 色荧光蛋白基因EGFP进行连接，成为一个融合基因。随后将该融合基因克隆 入杆状病毒供体质粒pFastBacHTa,构建完成一个重组的杆状病毒供体载体。然 后利用我们己经构建的适用于家蚕的杆状病毒Bac-to-Bac表达系统(已获授权 专利，专利号200310108781.8)，其工作原理为重组杆状病毒可以通过细菌 转座子的基因定位转移作用，在大肠杆菌内实现基因的转移重组，快速获得重 组病毒。该系统由供体质粒、含有家蚕杆状病毒BmBacmid基因组的感受态细 菌DH10BmBac构成，其产生重组病毒的原理是首先将外源目的基因克隆入 供体质粒，然后将供体质粒转化入DH10BmBac感受态细胞中，通过细菌转座 子的定点转位作用，将启动子和目的基因一并转入家蚕杆状病毒基因组而产生 重组病毒DNA，最后转染家蚕培养细胞而获得含有目的基因重组病毒(参见论 文:吴小锋，曹翠平，鲁兴萌。2006，利用细菌转座子构建适用于家蚕的Bac-to-Bac 快速基因表达系统。蚕业科学，32 (2): 183-188)。然后利用重组病毒作为载体， 感染家蚕培养细胞，在细胞内进行蛋白质的表达，感染96小时后分析蛋白质表具体实施例
1、 研究材料杆状病毒供体质粒pFastBacHTa (图1)购自美国Invitrogen 公司。含有绿色荧光蛋白基因EGFP的质粒pBI-EGFP购自美国BD公司。各种 限制性内切酶、连接酶等分子生物学操作试剂购自日本Takara公司。家蚕培养 细胞BmN细胞由本研究室继代保存，细胞培养基TC-100为Gibico公司产品， 胎牛血清(FBS)购于杭州四季青生物工程材料有限公司。细胞用添加10%胎牛 血清的培养基、27'C恒温培养。
2、 工作流程
以家蚕杆状病毒BmNPV基因组为模板，通过PCR技术克隆多角体启动子 和多角体基因Polyhedrin N-端从起始密码子ATG开始的编码50个氨基酸，即 150个核苷酸的SEQ ID NO.l所示的基因序列，引物设计为前导引物为 ATTTGTACGTAATTAACGATAC (SnaBI限制性内切酶位点)，后续引物为 GATCTTCTAGGATCCTACATG (BamHI限制性内切酶位点)。将此PCR克隆 的片段用首尾分别为SnaBI和Bamffl的限制性内切酶消化，纯化后克隆入也用 同样酶切的供体质粒pFastBacHTa中，这样构建的重组质粒命名为pFastBacHTa —PH50。采用PCR技术，以pBI-EGFP为模板克隆绿色荧光蛋白基因EGFP如 SEQIDN0.2所示，引物设计为前导引物AATGGATCCATGGTGAGCAAG (BamHI内切酶位点)，后续引物CACTAAAGCTTTTACTTGTACAG (HindIII 内切酶位点)，随后将此PCR产物用Bamffl和HindIII酶切，克隆入用同样酶切 的pFastBacHTa — PH50中，这样构建的重组质粒命名为pFastBacHTa — PH50/EGFP。这样就将多角体蛋白基因N-端的150个核苷酸的基因序列与绿色 荧光蛋白基因EGFP进行了融合。成为一个融合基因。然后将该质粒转化入含 有家蚕杆状病毒BmBacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在含有 抗生素的培养板上培养过夜，翌日通过蓝白斑筛选获得阳性菌斑，随后从阳性 菌斑从抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组，将此DNA转染入 家蚕培养细胞BmN， 120小时后分离培养基上清液，获得重组病毒。然后利用 重组病毒作为载体，感染家蚕培养细胞，在细胞内进行蛋白质的表达，感染96 小时后分析蛋白质表达情况。感染的情况见图2，左边为感染前(对照)的细胞 和家蚕幼虫，右边为重组病毒感染的细胞和家蚕幼虫。
3、 结果由图3可知，通过与多角体基因N-端序列的融合，外源基因的 表达水平得到了提高，增加的幅度为2—3倍。与外源基因单独表达相比，显著 提高外源基因的表达水平，从而大大提高了家蚕杆状病毒表达系统的工作效率。
5基因序列表 <110>浙江大学
〈120〉提高家蚕杆状病毒表达系统外源蛋白质表达水平的方法
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3. 1
<210> 1
<211〉 150
<212〉 腿
<213〉家蚕杆状病毒
<400〉 1
atgccg犯ttattcatacacCCCC￡LCC3tCgggcgtactt60
tgggctgtcttatcaaaaacgccaagcgca3gaeigc3cctagtcgaacat120
gaacaagagg agaagcaatg ggatcttcta150
<210> 2
<211〉 720
〈212〉 腿
<213〉绿色荧光蛋白基因
〈400〉 2
atggtgagcagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60
ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcg鄉gcgagggcgatgccacctac120
ggc朋gctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180
ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240
cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccg犯ggctacgtccaggagcgcaccatcttc300
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gtg犯ccgceitcgagctgaagggcatcgacttca鄉aggacggcaacatCCtggggC6LC420
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tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660
ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacg站ctgtacaagtaa720
权利要求
1、一种提高家蚕杆状病毒表达系统外源蛋白质表达水平的方法，其特征在于该方法的步骤如下1)以家蚕杆状病毒BmNPV基因组为模板，通过PCR技术克隆多角体启动子和多角体基因Polyhedrin N-端从起始密码子ATG开始的编码50个氨基酸，即150个核苷酸的基因序列，然后通过体外连接的方法，在其C端与报告基因-绿色荧光蛋白基因EGFP进行连接，成为一个融合基因；随后将该融合基因克隆入杆状病毒供体质粒pFastBacHTa，构建完成一个重组的杆状病毒供体载体；2)然后利用已经构建的适用于家蚕的杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，其工作原理为重组杆状病毒通过细菌转座子的基因定位转移作用，在大肠杆菌内实现基因的转移重组，获得重组病毒。3)重组病毒系统由供体质粒、含有家蚕杆状病毒BmBacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac构成，其产生重组病毒的原理是首先将外源目的基因克隆入供体质粒，然后将供体质粒转化入DH10BmBac感受态细胞中，通过细菌转座子的定点转位作用，将启动子和目的基因一并转入家蚕杆状病毒基因组而产生重组病毒DNA，最后转染家蚕培养细胞而获得含有目的基因重组病毒。
全文摘要
本发明公开了一种提高家蚕杆状病毒表达系统外源蛋白质表达水平的方法。利用家蚕杆状病毒BmNPV多角体基因N-段部分基因序列，将其与外源目的基因进行融合，构建产生新的重组基因工程病毒，然后在家蚕培养细胞内进行重组蛋白质的表达，发现能够大幅度提高外源蛋白质的表达水平。利用重组病毒作为载体，感染家蚕培养细胞，在细胞内进行蛋白质的表达，感染96小时后分析蛋白质表达情况。结果表明，通过与多角体基因N-端序列的融合，外源基因的表达水平得到了提高，增加的幅度为2-3倍。与外源基因单独表达相比，显著提高了外源基因的表达水平，从而大大提高了家蚕杆状病毒表达系统的工作效率。
文档编号C12N15/866GK101629187SQ20091010213
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月17日 优先权日2009年8月17日
发明者吴小锋, 相兴伟, 琳 陈 申请人:浙江大学