专利名称：：一种含vvyp肽的珠肽粉的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种珠肽粉的制备方法，具体而言涉及一种含有Val-Val-Tyr-Pro肽的珠肽粉的制备方法，以及由该制备方法制得的珠肽粉。本发明还涉及珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽在制备具有抗紧张作用的保健食品或医药品中的用途。
背景技术：
：珠蛋白(英文名为"globin")又称球蛋白，是具有携带氧能力的蛋白质。在脊椎动物体内有两种类型即存在于血液中的血红蛋白和肌肉中的肌红蛋白。珠肽粉即珠蛋白分解物，也被称为珠蛋白肽，是珠蛋白的深加工产品，主要是利用生物的方法，改造珠蛋白分子为低分子的肽，使其生理和营养功能得到显著改善和提高。与传统珠蛋白相比，珠肽粉的生产工艺较复杂，成本价格较高，但其具有易消化吸收、能迅速供给机体能量、无蛋白变性、无残渣、液体粘性小和受热不凝固等特性，但尤其重要的是其含有生物活性肽，具有一系列独特的生理功能。例如，本发明人在日本专利特开平9-255698(专利文献l)中提到，珠蛋白分解物中的Val-Val-Tyr-Pro肽具有抑制血中甘油三酸酯浓度的作用，可预防或治疗人或动物的肥胖症、高血脂症及其并发的高血压症和动脉硬化等循环器官类疾病。在日本专利特表2008-519758(专利文献2)中提到，珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽具有降低处于高血糖状态的受试者血糖水平的作用，可用于预防或治疗由高血糖引起的疾病。在日本专利特开2007-137816(专利文献3)中提到，珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽具有抑制处于高胆固醇状态或该前阶段的患者的胆固醇再上升的作用，可用于预防或治疗由于胆固醇再上升导致的高胆固醇状态引起的病态或疾患，例如高胆固醇血症、动脉硬化症等。除此之外，还有报道称珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽具有降血压作用。以上可以看出，Val-Val-Tyr-Pro肽作为珠肽粉的主要活性成分之一，具有各种生理活性。其含量的高低成为衡量珠肽粉品质的重要指标。但是，根据现有的珠肽粉制备方法，获得的Val-Val-Tyr-Pro肽的含量偏低，因此如何获得具有高含量的Val-Val-Tyr-Pro肽的珠肽粉产品成为亟待解决的问题。另一方面，在现代社会中，人们承受着由高度发达的复杂科学技术或剧烈变化着的社会环境带来的各种紧张、不安及应急能力低下等。特别是在国际化的社会中形成了复杂的人际关系也会引起精神紧张。已经有报道说精神紧张会引起各种症状。另外，在疾病的治疗中，例如糖尿病、高血压等疾病的治疗中，精神紧张往往是病情恶化，达不到应有治疗效果的主要原因之一。紧张、不安和应急能力低下影响着人们的生活和健康，引起了广泛的关注和研究，并开始建立了各种评价方法。其中高架式站台法(非专利文献4)因为操作简单，不需要特殊装置，相关性好而引起广泛关注。然而目前作为预防和减轻由紧张引起的精神和身体症状的药物，使用的是化学合成药物，如安定药、抗焦虑药和安眠药等。但是，这些药物会有成瘾性和副作用，故不适合日常使用来防止由紧张引起的精神和身体症状。因此，人们需要一种具有抗紧张作用的、日常可以连续食用的、没有任何安全性问题并能够减轻和防止由紧张引起的精神和身体症状的食品和药物。参考文献专利文献1特开平9一255698号公报专利文献2特表2008—519758号公报专利文献3特開2007—137816号公报非专利文献4高架式站台实验法适于评价紧张抵抗性的简便的行动解析法，日本药理学杂志，Vol.132(2008)，No.4:213-21
发明内容本发明的提供了一种制备Val-Val-Tyr-Pro肽含量高的珠蛋白水解物的方法。本发明还提供根据所述方法制备的珠蛋白水解物以及由该珠蛋白水解物制备的能够日常连续服用而不会有任何安全性问题，并能减轻和防止紧张引起的精神和身体症状的抗紧张剂；以及珠蛋白水解物或Val-Val-Tyr-Pro肽在制备具有抗紧张作用的保健食品或医药品中的用途。本发明的具体内容如下一种含Val-Val-Tyr-Pro肽的珠肽粉的制备方法，其步骤包括(1)第一步酶水解将珠蛋白原料与水混合拌均，调节pH至第一pH，所述第一pH为16，加入蛋白酶A;在第一温度2070。C下进行第一反应；(2)第二步酶水解再将pH调节至第二pH，所述第二pH为16，在第二温度207(TC下进行第二反应；(3)回收步骤终止反应，回收产品；其中，第一pH大于第二pH。更具体而言，本发明的珠肽粉是珠蛋白如血红蛋白、肌红蛋白等的水解产物。所述珠蛋白原料的来源没有限制，可为多种动物类型来源，如牛，猪，羊，人，马等。可以使用含有大量肌红蛋白的家畜肉、鱼肉和类似物作为珠蛋白的来源。此外，所述珠蛋白原料可与水以任意比例混合。优选地，珠蛋白原料与水混合的重量体积比为lkg:050L;更优选地为lkg:l10L;更优选地为lkg:l25L。优选地，所述第一pH为36;更优选为35;进一步优选为34。优选地，所述第二pH为l5;更优选为14;进一步优选为13。其中，第一pH大于第二pH。在一个优选的实施例中，第一pH大于第二pH为0.5pH以上；在另一个优选的实施例中，第一pH大于第二pH为1.0pH以上。优选地，在进行第二步酶水解之前，还可再加入蛋白酶B。所述蛋白酶A和蛋白酶B可相同或不同。本发明对所述蛋白酶的种类和来源没有限制，例如来自黑曲霉的酸性蛋白酶，来自枯草芽孢杆菌的酸性蛋白5酶，来自海洋酵母菌的酸性蛋白酶，来自鱼消化道的胃蛋白酶，来自猪的胃蛋白酶等。本发明所述的蛋白酶A还可为复合蛋白酶。优选地，所述蛋白酶A为来自微生物的酸性蛋白酶；更优选为来自黑曲霉的酸性蛋白酶。优选地，所述蛋白酶A的加入比例以每千克珠蛋白计加1万~2000万单位；更优选为每千克珠蛋白原料加10万1000万单位；进一步优选为每千克珠蛋白原料加50万500万单位。优选地，所述第一温度为3065""C;更优选为406(TC。优选地，所述第二温度为3065"C;更优选为406(TC。所述第一温度和所述第二温度可相同或不同。优选地，所述第一反应的时间为0.548小时，所述第二反应的时间为0.148小时。所述第一反应的时间进一步优选为0.530小时；更优选为0.5~5小时。所述第二反应的时间进一步优选为0.5~30小时；更优选为0.55小时。所述第一反应和所述第二反应的时间可相同或不同。此外，在所述回收步骤中，终止反应可通过本领域公知的方法进行。例如，通过加热一段时间停止反应，或者通过添加酸或者碱来调节pH进行等。具体而言，回收步骤可包括脱臭、脱色、过滤、灭菌、喷雾干燥等步骤，这些步骤可采用本领域公知的方法进行。从而根据目标产品的等级或纯度要求，制成各种满足标准的珠肽粉。本发明还提供一种根据上述方法制备的珠肽粉，所述方法所述珠肽粉的Val-Val-Tyr-Pro肽的含量为4mg/g以上。优选地，所述Val-Val-Tyr-Pro肽的含量为6mg/g以上。更优选地，所述Val-Val-Tyr-Pro肽的含量为7mg/g以上。本发明还提供一种抗紧张剂，其包括珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽作为有效成分。所述抗紧张剂可为药物、食品。本发明还提供一种珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽在制备具有抗紧张作用的保健食品或医药品中的用途。本发明还提供一种珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽在制备具有抗不安作用的保健食品或医药品中的用途。本发明还提供一种珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽在制备具有抗应急能力低下作用的保健食品或医药品中的用途。本发明还提供一种珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽在制备在糖尿病治疗中具有抗紧张作用的保健食品或医药品中的用途。所述紧张(stress)包括在日常工作生活压力或患病压力下，人体所出现的紧张、不安和应急能力低下等一系列症状。另外，当本发明的抗紧张剂为药物时，本发明的药物组合物可完全由珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽组成。当药物组合物与其他物质组合进行制备时，珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽的量不受限制，只要它足以发挥抗紧张、不安或应急能力低下等作用。通常，本发明的药物组合物与药理学可接受的载体和添加剂组合在一起进行制备。载体的例子是赋形剂、稀释剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、崩解抑制机、吸收促进剂、润滑剂、助溶剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂和根据药物组合物(制剂)给药的剂型通常使用的类似载体。添加剂的例子是稳定剂、防腐剂、缓冲剂、等渗调节剂、整合剂、pH调节剂、表面活性剂、着色剂、合成香料、调味剂、增甜剂和根据制剂给药的剂型通常使用的类似添加剂。药物组合物的单位剂量形式(药物制剂的剂型)可以根据给药途径加以适当选择。药物组合物大体上可以分成口服药物、经肺药物、经鼻药物、舌下药物、胃肠外药物(注射、滴注)或类似物。药物组合物可以根据己知方法混合、成形或制备成为固体剂型如片剂、丸剂、分散剂、粉剂、颗粒剂、胶囊等；液体剂型如溶液、悬液、乳液、糖浆剂、酏剂等。药物组合物可以制备成干燥产物的形式，当使用时通过加入适当载体成为液体。可以根据己知方法将药物组合物制备成任何这些形式。当本发明的抗紧张剂为食品时，所述食品包括被批准用于特殊保健用途的食品。前述具有抗紧张性功能的特殊保健用食品的特征是含有一定量的珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽，其量能有效地预防或改善紧张、不安、应急能力低下等症状。食品的包装和广告可以带有该作用(抗紧张(stress))的介绍。7本发明的食品组合物可以完全由珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽组成。当食品组合物与其他物质组合进行制备时，珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽的量不受限制，只要其足以表现出抗紧张、不安或应急力低下等的作用。本发明的食品组合物可以与可在食品中使用的载体和添加剂组合进行制备。这些食品组合物包括通过将珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽与食品可接受载体和添加剂混合制备的片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂、分散剂、粉剂、溶液(饮料)等形式的补充剂和类似物。本发明的食品组合物还包括含有珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽的产品，其可以采取普通食品和饮料的形式。图1是实施例1获得的珠肽粉的反相色谱图。图2是珠肽粉及Val-Val-Tyr-Pro肽的小鼠紧张抑制率图。具体实施例方式以下给出的制备实施例和试验实施例更详细地对本发明进行说明，但本发明的范围不限于这些实施例。在下列实施例中，除非特别指出，"%"代表"重量百分比(^%)"。在具体实施方式中，为了描述方便，将Val-Val-Tyr-Pro肽简称为VVYP。珠肽粉的制备方法以下详细描述使用牛红细胞制备珠肽粉的方法。并与现有方法进行比较。向100kg新鲜的牛红细胞中加250升水，进行充分的溶血。用磷酸将pH调节至2.8后，将2.6乂107单位来自黑曲霉(Aspergillusniger)的酸性蛋白酶(商品名HKB-X，生产公司HBIEnzymesInc)加入到溶液中，在5(TC下反应4小时。反应后，反应溶液在80。C下加热30分钟终止反应。此后，将氢氧化钙的悬浮水溶液加入至反应溶液中，将pH调节至6.5。然后，加入10kg硅藻士，混合物用压滤器过滤。将得到的滤液喷雾干燥，从而产生23kg粉末状珠肽粉。实施例1向100kg新鲜的牛红细胞(其中珠蛋白含量为85%)中加250升水，进行充分的溶血。用磷酸将pH调节至3.8后，将2.6X107单位来自黑曲霉的酸性蛋白酶加入到溶液中，在5(TC下反应2小时。再加入磷酸将pH调节至2.8后，在5(TC下反应2小时。反应后，反应溶液在8(TC下加热30分钟终止反应。此后，将氢氧化钙的悬浮水溶液加入至反应溶液中，将pH调节至6.5。然后，加入10kg硅藻士，混合物用压滤器过滤。将得到的滤液喷雾干燥，从而产生24kg粉末状珠肽粉。实施例2向100kg新鲜的牛红细胞(其中珠蛋白含量为85%)中加250升水，进行充分的溶血。用磷酸将pH调节至5.8后，将1.5><109单位来自黑曲霉的酸性蛋白酶加入到溶液中，在25。C下反应0.5小时。再加入磷酸将pH调节至4.2后，在25t:下反应0.5小时。反应后，反应溶液在80。C下加热30分钟终止反应。此后，将氢氧化钙的悬浮水溶液加入至反应溶液中，将pH调节至6.5。然后，加入10kg硅藻士，混合物用压滤器过滤。将得到的滤液喷雾干燥，从而产生24.8kg粉末状珠肽粉。实施例3向100kg新鲜的牛红细胞(其中珠蛋白含量为85%)中加250升水，进行充分的溶血。用磷酸将pH调节至2.4后，将2><106单位来自黑曲霉的酸性蛋白酶加入到溶液中，在25'C下反应20小时。9再加入磷酸将pH调节至1.5后，在25'C下反应20小时。反应后，反应溶液在8(TC下加热30分钟终止反应。此后，将氢氧化钙的悬浮水溶液加入至反应溶液中，将pH调节至6.5。然后，加入10kg硅藻士，混合物用压滤器过滤。将得到的滤液喷雾干燥，从而产生23.6kg粉末状珠肽粉。上述实施例中VVYP肽可通过以下方法获得(l)离子交换，(2)超滤，(3)在酸性条件下通过反相柱色谱分离，和(4)在中性条件下通过反相色谱分离。以下，以反相色谱为例，纯化VVYP肽。<反相色谱>仪器高速液相色谱仪(WatersAlliance2695-2996(Waters制造))柱Z0RBAXSB-C8小4.6X150mm(AgilentCo.，Ltd.)洗脱液含0.1体积％三氟乙酸的37体积％乙腈水溶液流速0.8mL/分温度25°C检测紫外吸收230nm标准品VVYP肽(上海再创生物科技有限公司)注入量20图1是采用上述条件测定的实施例1获得的珠肽粉的反相色谱图。通过计算峰面积，得出基于珠肽粉的VVYP肽的产率显示于表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表1可见，通过本发明的方法，活性肽VVYP的含量显著提高，获得了活性肽VVYP的含量提高了3倍以上的珠肽粉。实施例4根据本发明方法制备的珠肽粉的活性作用在对脂肪负荷小鼠的血中中性脂肪上升的抑制作用上，分别使用实施例1的珠肽粉与根据现有技术制备的珠肽粉进行试验，具体如下。将84只ICR小鼠(6周龄，体重约28g)禁食过夜，分成4组。小鼠数量分别为，脂肪非负荷组6只，脂肪负荷对照组22只，根据现有方法制得的珠肽粉脂肪负荷组29只，实施例l的珠肽粉脂肪负荷组27只。对根据现有方法制得的珠肽粉脂肪负荷组以及实施例1的珠肽粉脂肪负荷组，向每只小鼠分别强制经口投与250mg橄榄油和12.5mg，25mg,50mg的上述两种珠肽粉。180分钟后，通过甘油三脂E-Testwako(triglycerideE-Testwako)(酶法，和光纯药工业制造)测定血中中性脂肪浓度。另外，用水代替橄榄油和珠肽粉，对脂肪非负荷组仅投与水；用水代替珠肽粉，对脂肪负荷组投与橄榄油和水。并用相同的方法测定此时血中中性脂肪的浓度。使用获得的中性脂肪测定值，通过下式算出抑制率。抑制率(％)=(脂肪负荷对照组一被验物各投与组)/(脂肪负荷对照组—脂肪非负荷组)XIOO然后，计算将血中中性脂肪的上升抑制50%的投与量，作为ID5()。比较各方法的效果，如表2所示，实施例1的珠肽粉的抑制效果增强约3倍。进一步说明，根据本发明的方法提高了活性肽的含量。表2脂肪負荷小鼠的珠蛋白水解物的血中中性脂肪上昇抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例5小鼠的抗紧张作用给ICR雄性小鼠(9周龄，体重约34g)腹腔注射100mg/kg的链脲佐菌素，3天后，再次腹腔注射150mg/kg的链脲佐菌素。链脲佐菌素注射首日开始10日后，通过caressist(血糖仪)(Roche公司)测定尾静脉血的血糖值。将400mg/dL以上的小鼠用于试验。使用上述的模型小鼠，通过高架式站台法，以竦縮时间为指标，测定抗紧张作用。在黑色的实验台上不设置围栏，将高16cm，直径11.5cm的透明玻璃制烧杯上下反转设置，烧杯的底部作为站台。将小鼠放置于站台上，将除呼吸以外观察不到其他运动的状态定义为竦縮行为。以小鼠体重为指标，将lg/kg实施例1和现有方法制备的珠肽粉，以及2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg的WYP强制经口投与，l小时后放置于站台上，用秒表测定30分钟间的竦縮行为的持续时间。另外，还设有仅投与水的对照组，其测定方法与上文相同。结果在表3，图2中示出。实施例1的珠蛋白水解物的抗紧张性约为现有方法制备的珠蛋白水解物的抗紧张性的3倍。并且从图2中可得出，小鼠的紧张抵抗性与VVYP的含量成线性关系。表3小鼠的紧张抵抗性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>05试验例l:安全性试验将实施例1中制备的氨基酸序列为Val-Val-Tyr-Pro的肽口服投予雄性和雌性ICR小鼠，其用量为10g/kg(最高容许剂量)或更高，没有一例死亡，从而表明该肽的安全性。试验例2:制备含VVYP肽的食品(1)制备奶粉将10毫克制备实施例l中制备的氨基酸序列为Val-Val-Tyr-Pro的肽加入到100g婴儿奶粉配方中，从而得到具有抗紧张、不安等症状的奶粉。(2)制备巧克力将50毫克制备实施例l中制备的氨基酸序列为Val-Val-Tyr-Pro的肽加入到100g巧克力中，从而得到具有抗紧张、不安、应急力低下等功能的巧克力。(3)制备绿茶饮料将80千克绿茶叶加入到300升热水(80°C)中，在该温度下提取4分钟。将得到的提取物冷却并离心。收集清亮的上清液作为绿茶提取物。向此提取物中加入O.4kg维生素C，然后加入50g制备实施例l中制备的氨基酸序列为Val-Val-Tyr-Pro的肽。加入热水至最终体积为1000升。混合物加热至WC或更高的温度，装入金属罐，蒸馏灭菌(125'C，5分钟)，从而得到绿茶饮料。(4)制备口香糖使用以下配方制备口香糖。<口香糖配方>香糖胶基25.0重量份蔗糖63.8重量份玉米糖浆IO.O重量份甘油l.O重量份WYP肽0.2重量份l^FIOO.O重量份首先将香糖胶基、糖、玉米糖浆和甘油混合。然后加入制备实施l中制备的氨基酸序列为Val-Val-Tyr-Pro的肽，使用混合机在5(TC下将该混合物进行均匀捏合。冷却后，通过轧辑对混合物进行压模，从而得到含有VVYP肽作为活性成分的口香糖棒，每根棒中该肽的比例为5mg。SEQUENCELISTING<110>浙江普洛医药科技有限公司<120>—种含VVYP肽的珠肽粉的制备方法<130><160>1<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>4<212>PRT<213>牛<400>1ValTyrTyrPro141权利要求1.一种含Val-Val-Tyr-Pro肽的珠肽粉的制备方法，包括以下步骤(1)第一步酶水解将珠蛋白原料与水混合拌均，调节pH至第一pH，所述第一pH为1～6，加入蛋白酶A；在第一温度20～70℃下进行第一反应；(2)第二步酶水解再将pH调节至第二pH，所述第二pH为1～6，在第二温度20～70℃下进行第二反应；(3)回收步骤终止反应，回收产品；其中，第一pH大于第二pH。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应的时间为0.5~48小时，蛋白酶A的加入量为以每千克珠蛋白计加12000万单位；所述第二反应的时间为0.1~48小时。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶A为来自黑曲霉的酸性蛋白酶。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的第一pH为36,所述的第二pH为1~5。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的第一温度为3065'C，所述的第二温度为3065。C。6—种根据权利要求1所述的方法制备的珠肽粉，所述珠肽粉的Val-Val-Tyr-Pro肽的含量为4mg/g以上。7.—种抗紧张剂，其包括珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽作为有效成分。8.珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽在制备具有抗紧张作用的保健食品或医药品中的用途。9.珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽在制备具有抗不安作用的保健食品或医药品中的用途。10.珠肽粉或Val-Val-Tyr-Pro肽在制备具有抗应急能力低下作用的保健食品或医药品中的用途。全文摘要本发明公开了一种含Val-Val-Tyr-Pro肽的珠肽粉的制备方法，包括(1)第一步酶水解将珠蛋白原料与水混合拌均，调节pH至第一pH，为1～6，加入蛋白酶A；在第一温度20～70℃下进行第一反应；(2)第二步酶水解再将pH调节至第二pH，为1～6，在第二温度20～70℃下进行第二反应；(3)回收步骤终止反应，回收产品；其中，第一pH大于第二pH。根据本发明方法获得的珠肽粉中Val-Val-Tyr-Pro肽含量显著提高，生理功能的效率更高。另外，本发明还公开了由该珠肽粉制备的能够日常连续服用而不会有任何安全性问题，并能减轻和防止紧张引起的精神和身体症状的抗紧张剂。文档编号C12P21/06GK101633945SQ20091010214公开日2010年1月27日申请日期2009年8月20日优先权日2009年8月20日发明者徐新良,香川恭一申请人:浙江普洛医药科技有限公司