昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法
【专利摘要】本发明公开了一种昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，将家蚕质型多角体病毒（BmCPV）的多角体基因（polyhedrin）以及目的蛋白基因分别构建至pFastBac?Dual载体上的PH和P10启动子下面，通过重组获得同时表达多角体和目的蛋白的杆状病毒。本发明利用杆状病毒表达系统，同时将质型多角体蛋白基因和目的蛋白基因分别构建到pFastBacTMDual载体的PH与p10启动子下，并在目的蛋白与信号肽之间引入柔性链接肽，通过与病毒骨架重组，获得重组杆状病毒。通过该单一病毒感染Sf9或Sf21昆虫细胞，直接可以在细胞内产生所需要的包裹型蛋白，并且这种重组型的病毒也同样可以获得扩增。
【专利说明】昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种对蛋白质进行包裹的方法。
【背景技术】
[0002]昆虫病毒多角体(polyhedra)是指昆虫病毒在感染宿主细胞后产生的多面体粒子，其主要用来包裹病毒粒子。它的功能是保护包裹的病毒颗粒免受不良环境的破坏，比如:高温、干燥、辐射等，以及它对各种蛋白分解酶也有抗性，并且在酸性条件下极其稳定，而在碱性环境下易溶解并释放出病毒粒子[I]。依据多角体在细胞内形成的部位可以分为核型多角体或质型多角体。近来国内外的研究发现质型多角体可以包裹异源蛋白，比如:Ijiri等人将蛋白激酶C (protein kinase C)包裹进入了质型多角体中，并发现包裹型的蛋白激酶C相对于没有经过包裹的蛋白有更强生物学活性和持续的药物缓释效果[2];被多角体包裹的表皮生长因子(epidermal growth factor)不仅药效延长了，而且其能抵抗高强度的射线破坏[3];曹翠平等人利用多角体包埋外源蛋白时发现，经过包埋的EGFP蛋白(绿色荧光蛋白)放置2个月后仍能检测到绿色荧光，而干燥处理30min后同样能检测到蛋白活性[4]。这些研究表明多角体是耐酸、抗辐射、抗干燥并具有包裹异源活性蛋白特性的优良载体。
[0003]目前国外文献报道 中关于多角体包裹目的蛋白的技术手段多是通过构建两个重组杆状病毒，即一个专一表达质型多角体病毒多角体蛋白(包裹蛋白)的杆状病毒，另一个专一表达目的蛋白的杆状病毒，通过调节两种病毒的比例混合感染Sf9昆虫细胞，再从细胞中分离出多角体。该种方法不适合从昆虫细胞中收集大量的多角体，由于很多细胞在混合感染的时候只感染了一种 病毒，所以会形成较多空多角体，以至于包裹效率低。国内学者主要通过家蚕Bacmid表达系统， 采用家蚕本身的多角体蛋白包裹目的蛋白，这种方案产生的多角体量大，并且可以通过家蚕本身生产，但采用家蚕本身多角体包裹的目的蛋白并不专一，其中包裹了大量家蚕病毒粒子，不适合现在国际上通过多角体专一包裹目的蛋白的发展趋势，也不能应用于现代医药蛋白或疫苗抗原的包裹需求。
[0004]在细胞内实现多角体对目的蛋白的包裹过程需要一个信号肽蛋白的辅助，目前的技术手段基本上采用在目的蛋白的N端加上一段VP3蛋白N末端42-93个氨基酸或者Hl螺旋作为信号肽，由于这些蛋白结构比较大，可能会影响很多目的蛋白的正确折叠过程，造成目的蛋白失去生物学活性。
[0005]大多数的生物活性蛋白，如:GM_CSF、干扰素、白介素、亚单位疫苗等，目前主要以注射给药，治疗不方便，也难以长期给药，由其是养殖场。我们尚未见到利用昆虫生产多角体包裹药物方面的研究报道。
[0006]上文中涉及的参考文献如下:
[0007][l]Belloncik, S.and H.Mori, Cypoviruses.The insectviruses, 1998:p.337-369.(Belloncik, S.and H.Mori,质型多角体病毒。昆虫病毒杂志，1998:p.337-369)。[0008][2]Ijiri, H., et al., Immobilization of protein kinase C into cypoviruspolyhedra.Journal of insect biotechnology and sericology.79(1):p.1-1.(H.;Hamada, N.;Kotani,E.;Mori,H.固定蛋白激酶C到质型多角体上。昆虫生物技术与蚕学杂志。2010.79(1):p.1-1.)。
[0009][3]Ijiri, H., et al., Structure-based targeting of bioactive proteinsinto cypovirus polyhedra and application to immobilized cytokines for mammaliancell culture.Biomaterials, 2009.30(26):p.4297-4308.(Coulibalyb, Gento Nishimura等。基于结构的定点固定生物活性蛋白至质型多角体上并应用固定的化的细胞因子培养哺乳动物细胞培养。生物材料杂志，2009，30 (26):p.4297-4308.)。
[0010][4]曹翠平，郭爱芹等.利用BmNPV多角体包埋外源蛋白的观察.蚕业科学，2009.35(004):p.790—795。
【发明内容】
[0011]本发明所要解决的技术问题是提供一种多角体高效专一包裹目的蛋白的方法。
[0012]为了解决上述技术问题，本发明提供一种昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法:将家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体基因(polyhedrin)以及目的蛋白基因分别构建至pFastBac Dual载体上的PH和PlO启动子下面，通过重组获得同时表达多角体和目的蛋白的杆状病毒。
[0013]作为本发明的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法的改进:在目的蛋白基因前面加入81-90bp Hl定位信号序列以及6-12个GGS (甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)柔性连接肽。
[0014]作为本发明的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法的进一步改进:该方法通过构建的重组杆状病毒在昆虫细胞sf9或甜菜夜蛾上实现目的蛋白的包装过程。
[0015]作为本发明的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法的进一步改进:由Hl信号肽与柔性连接肽构成的引导基因的序列为SEQ ID N02所述。
[0016]作为本发明的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法的进一步改进:Hl (信号肽)+Flexible peptide (柔性链接肽)+eGFP的序列为SEQ ID N04所述。
[0017]本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的病毒，所述病毒直接感染sf9或sf21细胞，在细胞内直接产生多角体包裹型的目的蛋白，每个细胞内含10-50个多角体，直径在1-2 u m，并且病毒液能继续用于感染细胞或注射甜菜夜蛾。
[0018]作为本发明的病毒的改进:该病毒直接可以注射4-5龄甜菜夜蛾，3-5天后甜菜夜蛾发生液化，每头幼虫可以产生1-2亿个多角体包裹的目的蛋白，直径在1-2 Pm。
[0019]作为本发明的病毒的进一步改进:所述的目的蛋白为多角体包裹型，具有生物学功能，并且为单基因编码的蛋白质。
[0020]本发明的目的之一是提供该重组病毒的制备方法。
[0021]本发明是按下述方案实现的:以绿色荧光蛋白eGFP作为包装的模式目的蛋白，通过全基因合成技术分别合成质型多角体蛋白polyhedrin基因、引导肽基因(含Hl信号肽+柔性连接肽)、eGFP基因(序列分别为序列表中的SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03)。
[0022]本发明具体为通过甜菜夜蛾昆虫或者细胞实现昆虫病毒多角体对其他目的蛋白进行高效包裹，采用该方法可以大幅度提高多角体对目的蛋白的包裹效率，不仅可以在体外培养的昆虫细胞sf9和sf21内包裹，也可以在甜菜夜蛾体内大量包裹。该技术可以应用于蛋白类药物或疫苗抗原的包裹【技术领域】。
[0023]由于多角体这种蛋白包装材料具有很好的抗酸、耐高温等特点，所以将其用于那些具有用量小、活性高、易失活的蛋白进行包装可能对提高其稳定性以及口服给药方面会是一个突破；亚单位疫苗，一般是某种病原的一段肽或蛋白成分，直接通过口服很引起动物粘膜免疫反应，因为口服后很容易被消化系统的酶降解，所以包裹技术为亚单位疫苗直接通过口服引起动物粘膜和全身性免疫反应提供了新的途径。因此，本研究内容对于拓展蛋白类药物或亚单位疫苗在临床上的应用范围以及为今后开发更多的口服蛋白药物提供技术支持，具有重要的实际应用价值。
[0024]本发明的发明点具体为:
[0025]1、构建了一种新型杆状病毒，该病毒具有在昆虫细胞Sf9内同时表达多角体蛋白与目的蛋白，并且目的蛋白是被多角体完全包裹，该多角体在细胞内大小为1-2 U m,每个细胞内可以产生50-200个该颗粒.(国内外包装主要采用分别表达多角体蛋白与目的蛋白的两种杆状病毒混合感染制备包裹目的蛋白的多角体。我们的发明改进后，将多角体蛋白与目的蛋白同时放在一种杆状病毒中，简化了其方法，提高了包装效率)。
[0026]2、构建了一种新型杆状病毒，该病毒具有感染甜菜夜蛾昆虫的能力，能在其体内产生大量的多角体颗粒，并且目的蛋白被多角体包裹。其在细胞内的大小与分布同感染Sf9细胞结果类似。(目前国内外在昆虫上实现多角体包裹目的蛋白上没有报道。我们的发明提供的该新型杆状病毒实现了在甜菜夜蛾昆虫上多角体对目的蛋白的包裹过程。)
[0027]3、构建了一种新型杆状病毒，该病毒具有同时表达多角体蛋白与目的蛋白的能力，特点:(1)多角体蛋白基因插入到载体pFastBac Dual质粒，由载体上Polyhedrinpromoter启动；(2)目的蛋白基因插入到载体pFastBac Dual质粒，由载体上PlO启动子启动，并且在包裹目的蛋白的N端加上一段引导肽序列，引导肽由信号肽与柔性链接肽组成。
[0028]综上所述，本发明利用杆状病毒表达系统，同时将质型多角体蛋白基因和目的蛋白基因分别构建到pFastBacTMDual载体的PH与plO启动子下，并在目的蛋白与信号肽之间引入柔性链接肽，通过与病毒骨架重组，获得重组杆状病毒。通过该单一病毒感染Sf9或Sf21昆虫细胞，直接可以在细胞内产生所需要的包裹型蛋白，并且这种重组型的病毒也同样可以获得扩增。相对于国外通过两种病毒按照比例进行混合感染相比，具有工艺简单，产生的包裹型蛋白效率更高，另外在产生包裹型蛋白的同时重组病毒粒子也同样获得了扩增，更适合通过昆虫细胞发酵大规模制备多角体包裹型蛋白；其次通过上述方法制备的重组杆状病毒可以直接皮下注射四龄甜菜夜蛾，通过昆虫体细胞来生产更多的多角体包裹型蛋白，其效率高、同时成本要大大低于通过昆虫细胞发酵过程。【专利附图】
【附图说明】
[0029]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0030]图1为方案流程图。
[0031]图2为细胞内多角体的产生对比图(200倍数下显微镜拍照)；
[0032]左图为Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒感染，右图为对照细胞。[0033] 图3为荧光下观察多角体内的eGFP的包裹情况图(200倍数下显微镜拍照)；
[0034]Al与A2为细胞内多角体分别在可见光与荧光下拍照的图片，图BI与B2为从细胞中分离获得的多角体分别在可见光与荧光下拍照的图片。
[0035]图4为甜菜夜蛾昆虫感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒后在其体内产生包含eGFP蛋白的多角体颗粒结果。
[0036]Cl为四龄甜菜夜蛾感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒4天后虫体发生液化结果。
[0037]C2为四龄甜菜夜蛾感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒4天后虫体组织涂片后可见光下对多角体颗粒镜检结果。(100倍数下显微镜拍照)；
[0038]C3为四龄甜菜夜蛾感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒4天后虫体组织涂片后突光下对多角体颗粒镜检结果。(100倍数下显微镜拍照)；
【具体实施方式】
[0039]实施例方法、
[0040]1、材料:
[0041]草地贪夜蛾细胞(sf9)、pFastBac Dual质粒、DHlOBac均购自美国Invitrogen公司；
[0042]DH5 a菌株购自TaKaRa公司；
[0043]家香质型多角体病毒(Bombyxmori cypovirus,BmCPV)的多角体(polyhedrin)基因(gb IM19112.11、如序列表中的NOl所述)、由Hl信号肽与柔性连接肽构成的引导基因(如序列表中的N02所述，本发明所特设)、eGFP基因(gb | KC710230.11、如序列表中的N03所述)均由上海生物工程公司人工合成；
[0044]备注说明:在序列表的N02中，l_90bp为Hl定位信号肽，91_126bp为柔性连接肽(带下划线)。
[0045]高保真Tag酶、各种限制性内切酶、dNTP、酶连试剂盒、DNA胶回收试剂盒等均购自TaKaRa 公司；
[0046]Sf-900II SFM无血清培养基、Cellfectin II Reagent转染试剂均购自Invitrogen 公司；
[0047]2、引物设计与PCR扩增:
[0048]根据人工合成的polyhedrin基因设计一对引物，
[0049]上游引物P1:5，一CGCGGATCCATGGCAGACGTAGCAGGAAC—3’，带有 BamH I 酶切位点；
[0050]下游引物P2:5’ 一CCCAAGCTTTCACTGACGGTTACTCAGAG— 3’，带有 Hind III 酶切位点。
[0051]依据人工合成的带有Hl+柔性连接肽+eGFP的序列设计一对引物:
[0052]上游引物P3:5 ’ — TCCCCCGGGATGGCAGACGTAGCAGGAAC— 3 ’，带有 Smal I 酶切位占.[0053]下游引物P4:5 ’ 一 CGGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA— 3 ’，带有 Kpn I 酶切位点。
[0054]上述引物均由上海生物工程公司合成。
[0055]PCR 反应体系为:dNTPs (2mM) 2.0 U L,弓丨物(IOuM)各 0.5 ii L，IOXrTaqbuffer2.5 ii L，模板 DNA (20ng/ul) 1.0u L, Taq DNA 聚合酶(5U/ul) 0.2 y L，双蒸水补至25 u Lo
[0056]PCR 反应条件为:94°C 5min，(预变性);94°C 30s’，55°C 30s’，72°C lmin’，共 35个循环；72°C IOmin。
[0057]PCR扩增产物通过凝胶回收试剂盒回收PCR产物，于_20°C保存备用。
[0058]3、重组转移载体的构建与鉴定:
[0059]将凝胶回收的polyhedrin基因和pFastBac Dual质粒经过Bam HI和Hind III双酶切后分别回收，polyhedrin基因定向克隆于FastBac Dual的PH启动子下游，构建的重组转移载体pFastBacDual/polyhedrin,转化至DH5 a , PCR和酶切鉴定。[0060]将上述pFastBac Dual/polyhedrin质粒和带定位信号肽的eGFP基因的PCR产物经Smal I和Kpn I双酶切后分别回收，并将引导基因与eGFP基因定向克隆至pFastBac Dual/polyhedrin的PlO启动子下游，构建获得重组转移载体pFastBac Dual/polyhedrin-eGFP,最后转化DH5 a，送上海生物工程公司测序鉴定。
[0061]4、重组Bacmid质粒的构建与鉴定:
[0062]将pFastBac Dual/polyhedrin-eGFP 和对照质粒 pFastBac dual 分别转化
E.coli DHlOBac 感受态细胞，菌液涂于含有 X-Gal (40 iig/ml)、IPTG (24 y g/ml)、卡那霉素(50118/1111)、庆大霉素(100118/1111)和四环素(30iig/ml)的培养基平板上，经蓝白斑筛选，分别挑取白色菌落、提取质粒，送上海生工测序鉴定，鉴证正确后命名为重组质粒Bacmid-polyhedrin—eGFPo
[0063]5重组Bacmid转染sf9细胞及其表达分析:
[0064]根据Cellfectin转染试剂说明书，将重组质粒Bacmid-polyhedrin-eGFP(21^)、0611€6(^111转染试剂(21^)与100 ill不含抗生素无血清昆虫细胞培养基(Gibcosf-900II SFM)混匀，室温下孵育45min，转染处于对数生长期的sf9细胞，置28°C培养5h后吸去转染混合物，加入含抗性(青霉素0.008g/100ml，链霉素终浓度0.01g/100ml)和血清的昆虫细胞培养基中继续培养72h以上，出现病变(即细胞内充满颗粒，细胞附着力减弱，开始脱壁上浮并个别细胞解体成颗粒状物散落细胞培养液中)后，并观察细胞内多角体的产生以及荧光下观察多角体内的eGFP的包裹情况并计数，并收集细胞上清为Pl代病毒液。以此为毒种，再去感染sf9细胞以扩增病毒,收获病毒液为P2代病毒。
[0065]结果如下:
[0066]I)、细胞内多角体的产生如图2所示；该方法获得的Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒在细胞内产生大量的多角体颗粒，图2中，左图为Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒感染，通过计数，每个细胞内可以产生10-50个多角体，右图为对照细胞，细胞内没有发现多角体颗粒。(20倍数下显微镜拍照)。【对照细胞为正常细胞，细胞内不产生多角体颗粒。】
[0067]2)、荧光下观察多角体内的eGFP的包裹情况如图3所示；该方法获得的Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒在细胞内产生大量的多角体颗粒，并且包裹了 eGFP目的蛋白，图Al与A2为细胞内多角体分别在可见光与荧光下拍照图片，图BI与B2为从细胞中分离获得的多角体分别在可见光与荧光下拍照的图片。图片证明了该方法可以在细胞产生大量的多角体并且可以高效率的包裹目的蛋白eGFP (20倍数下显微镜拍照)。
[0068]6、重组杆状病毒在甜菜夜蛾幼虫中的表达分析
[0069]将甜菜夜蛾幼虫虫卵在27°C孵化成幼虫，分装于24孔板内，以人工饲料喂养至四龄时，每头幼虫注射P2病毒1-3 ii 1,3-4天后收集死亡和液化的幼虫，经过研磨和过滤，直接涂片进行显微镜拍照观察并对多角体进行计数。
[0070] 备注说明:
[0071 ] 1、人工饲料是指从武汉病毒研究所购买，用于喂养昆虫的饲料。
[0072]2、液化是指昆虫发生病变的一种现象，整个虫体水肿并且柔软，用针刺表皮后会流出大量液体。
[0073]结果如下:
[0074]该方法获得的Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒可以在昆虫甜菜夜蛾上产生大量的多角体颗粒，并且包裹了 eGFP目的蛋白。图Cl为注射病毒后虫体液化结果:虫体带绿色；图C2与C3为液化虫体经过直接涂片后在可见光与荧光下观察结果；结果说明通过该方法获得病毒可以直接注射甜菜夜蛾来获得包裹型多角体，并且可以在幼虫上产生大量的包裹了 eGFP目的蛋白的多角体，经过计数每头幼虫可以产生约1-2亿个多角体颗粒。(40倍数下显微镜拍照)。
[0075]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:将家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体基因(polyhedrin)以及目的蛋白基因分别构建至pFastBac Dual载体上的PH和PlO启动子下面，通过重组获得同时表达多角体和目的蛋白的杆状病毒。
2.根据权利要求1所述的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:在目的蛋白基因前面加入81-90bp Hl定位信号序列以及6-12个GGS(甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)柔性连接肽。
3.根据权利要求2所述的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:所述方法通过构建的重组杆状病毒在昆虫细胞sf9或甜菜夜蛾上实现目的蛋白的包装过程。
4.根据权利要求1、2或3所述的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是: 由Hl信号肽与柔性连接肽构成的引导基因的序列为SEQ ID N02所述。
5.根据权利要求4所述的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是: Hl (信号肽)+Flexible peptide (柔性链接肽)+eGFP的序列为SEQ ID N04所述。
6.根据权利要求4所述的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:重组质粒为 Bacmid-polyhedrin-eGFP。
7.利用如权利要求1~6任一所述方法制备而得的病毒，其特征是:所述病毒直接感染sf9或sf21细胞，在细胞内直接产生多角体包裹型的目的蛋白，每个细胞内含10-50个多角体，直径在1-2 U m，并且病毒液能继续用于感染细胞或注射甜菜夜蛾。
8.根据权利要求7所述的病毒，其特征是:该病毒直接可以注射4-5龄甜菜夜蛾，3-5天后甜菜夜蛾发生液化，每头幼虫可以产生1-2亿个多角体包裹的目的蛋白，直径在1-2 u m0
9.根据权利要求8所述的病毒，其特征是:所述的目的蛋白为多角体包裹型，具有生物学功能，并且为单基因编码的蛋白质。
【文档编号】C12R1/93GK103614417SQ201310595964
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】袁林, 郭建军, 杨一兵, 魏国汶 申请人:江西省科学院微生物研究所