专利名称：一种定点删除转基因细胞中的外源基因的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种定点删除转基因细胞中的外源基因
的方法。
背景技术：
自从1997年，体细胞克隆羊"多莉"诞生以来，利用转有目的基因的体细胞做供 体，通过体细胞核移植技术生产转基因家畜逐渐成为生产转基因大动物的主要方法。目前 在获得转有目的基因的体细胞的过程中，普遍采用的方法是将真核抗性基因(也称标记基 因，如neomycin等)与目的基因构建在同一个载体上，通过细胞转染后对标记基因的筛选 从而获得稳定整合了外源目的基因的体细胞。然而，转基因动物中标记基因的存在给转基 因动物的后续研究带来了许多不便[1]。一，目前可以作为真核筛选基因进行转基因动物研 究的标记基因非常有限，当转基因动物中已存在某一选择标记基因时，该标记基因在随后 的再次转基因中就不能再作为选择标记，限制了多基因转基因的研究，尤其在哺乳动物基 因敲除的研究中，常染色体等位基因的双敲除需要两个不同的标记基因，在对另一等位基 因进行敲除前，必须进行标记基因的删除；二，用于高效表达标记基因的外源启动子和增强 子元件的存在可能影响目的基因整合位点附近调控元件的作用，从而可能影响转基因动物 的表型分析。此外，对于乳腺生物反应器研究来说，标记基因的存在使得目的蛋白的分离纯 化和检测增加了一定的难度；对于转基因动物食品安全性评价研究，标记基因的存在增加 了转基因动物及转基因食品对人类健康的潜在危险，使转基因食品安全性评价的研究更为复杂。 因此，培育无标记基因的转基因动物，对转基因动物研究的进一步发展及转基因 动物食品安全具有重大的意义。 Cre重组酶于1981年从Pl噬菌体中发现，属于A Int酶超基因家族。Cre重组酶 基因编码区序列全长1029bp (EMBL数据库登录号X03453)，编码38kDa蛋白质。Cre重组酶 是一种位点特异性重组酶，能介导两个34bp的LoxP位点(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACG AAGTTAT)之间的特异性重组，是LoxP位点间的序列或基因被删除。 目前，对于转基因动物细胞中标记基因的删除多采用1996年Abuin等在小鼠胚胎 干细胞中建立的方法。即用真核表达cre重组酶的载体转染细胞后，用1，3，5-三-苯甲酰 基-2-去氧-2-氟-P-D-核糖(FIAU)筛选标记基因获得删除的细胞。该方法需要在构建 表达载体时引入与FIAU作用的负筛选基因，同时需FIAU进行药物筛选，无疑增加了载体构 建难度和细胞筛选步骤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定点删除转基因细胞中外源基因的方法。 本发明的方法是将荧光蛋白基因与cre基因重组构建表达载体，导入到目的细胞
中，通过检测荧光蛋白来筛选基因被定点删除的细胞。
为实现上述目的，首先构建表达荧光蛋白与cre重组酶重组表达的表达载体。在本发明的一个实施方案中，所采用的荧光蛋白为绿荧光蛋白(GFP)。将构建的表达载体导入目的细胞，通过流式细胞仪分选表达荧光蛋白的细胞，这些细胞就是基因被定点删除的细胞。 在本发明中，被定点删除的基因是指在LoxP-Nn-LOXP (l表示序列长度为n的核苷酸序列)结构当中的DNA序列，其可以是外源基因，或者是标记基因。例如在本发明的一个实施例中，被删除的基因为neo标记基因。 在本发明中，目的细胞是指含有LoxP-Nn-LOXP结构需要将Nn定点删除的细胞。 在本发明中，将表达载体导入目的细胞的手段包括各种转化或转染的方法，例如
磷酸钙、脂质体介导的化学转染方法，基因枪、电穿孔、显微注射等物理方法。 在本发明实施例中，通过构建表达GFP和ere的表达载体，导入稳定整合了
LoxP-neo-LoxP结构的转基因牛耳成纤维细胞，流式细胞仪分选细胞，经鉴定表明，GFP阳
性的细胞neo基因均被删除，而GFP阴性的细胞则含有neo基因。说明，通过本发明方法能
够准确筛选出基因被定点删除的细胞。 本发明方法能够准确筛选出基因被定点删除的细胞，避免了药物筛选，为筛选基因被定点删除的细胞，特别是标记基因删除的细胞的筛选提供了新途径。对培育无标记基因的转基因动物，对转基因动物研究的进一步发展及转基因动物食品安全具有重大的意义。
图1显示的是实施例1构建的表达GFP和ere重组酶的表达载体。
图2显示的是实施例lcre-IRES EGFP酶切鉴定结果。其中1&9， lkb梯度DNA分子量标准；2&3， cre-IRES EGFP质粒Xba I酶切结果，6. lkb ;4&5， cre-IRES EGFP质粒Not工、Xba I双酶切结果，4. 7kb+l， 351bp ;6&7， cre-IRES EGFP质粒Nhe 1、Bsiw I双酶切结果，5. lkb+l， 032bp ;8， cre-IRES EGFP质粒对照。 图3显示的是实施例2cre-IRES EGFP质粒瞬时转染细胞ere重组酶表达的Western blot检测结果。 图4显示的是实施例3cre-IRES EGFP质粒瞬时转染细胞后marker free细胞克隆点的鉴定结果。其中1， Marker ;2-11，不同的Marker free细胞克隆点细胞；12，转有LoxP-NEO-LoxP结构的转基因牛的基因组；13，含有LoxP-NEO-LoxP结构的单标载体；14，正常牛对照；15，空白对照。 图5显示的是实施例4用marker free细胞为供体细胞核移植获得的囊胚的鉴定。其中1， Marker ;2-8， Marker free细胞为供体核移植获得的囊胚；9，转有neo单标的转基因牛的基因组；10，含有neo的单标载体；ll，正常牛对照；12，空白对照。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所使用的载体、菌种、试剂及其来源 pIRES2-EGFP和pIRES-NE0载体(Clontech公司)，pIREShyg3载体(Clontech公司)，PBS185(GibcoBRL)pMD19-T (TaKaRa公司);宿主菌大肠杆菌DH5a本实验室保存；引物合成由上海生工完成；序列测定由北京优博公司完成；LA Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均购自TaKaRa公司；抗ere重组酶抗体购自Abeam公司，HRP标记的二抗购自KPL公司；细胞培养基DMEM、 PBS和胎牛血清购自Gibico公司；脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；蛋白提取细胞裂解液购自碧云天公司。293T细胞(人胎肾细胞)购自北京协和医科大学基础医学研究所细胞中心。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。
实施例lcre重组酶真核表达载体的构建 以PBS 185质粒为模板，设计PCR引物扩增ere重组酶的CDS序列，同时在序列的
两端分别引入Nhel和BsiWI酶切位点。 所设计的上下游引物分别为Nhe I-Cre-F :GAAGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACBsi WI-Cre-R :TCTCGTACGCTAATCGCCATCTTCCAGCAG Cre CDS扩增的反应体系为50 反应体系，其中PBS185质粒1 (200ng/ii 1) ， primer (20pmo1/ yl)各1 ， dNTP (10mM) 6 ii 1 ， 5 X LA PCR Buffer 5 ii 1 ， LA Taq酶(Takara) 0. 3 ii 1 。 反应程序为94t:预变性5min，98t:变性10s，68t:退火延伸lmin，共35个循环，72 °C 10min。 将PCR产物回收连接到pMD19-T载体上，经过测序鉴定正确后，Nhe I和BsiW I双酶切回收1032bp的片段，连接到同样经过Nhe I和BsiW I双酶切的pIREShyg3的多克隆位点上获得pcre-IREShyg载体。 以pIRES2-EGFP质粒为模板，设计PCR引物扩增IRES EGFP序列，在序列的上游引物5'端引入NotI酶切位点，在下游引物上突变掉Not I酶切位点同时引入XbaI酶切位点，上游引物为Not I-IGFP-F :ATAGCGGCCGCACTAGAGGAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCC，下游引物为Xbal-IGFP-R :TGATCTAGAGTCGCGGCGGCTTTAC，反应体系和反应程序同上，将PCR产物回收连接到pMD19-T载体上，经过测序鉴定正确后，Not I和Xba I双酶切回收1351bp的片段，连接到同样经过Not I和Xba I双酶切的pcre-IREShyg载体上，取代pcre-IREShyg载体上IRES hyg序列，构建完成成功表达cre重组酶和GFP但不含真核抗性基因的载体。其酶切鉴定结果如图2所示。 实施例2 293T细胞和牛成纤维细胞转染及cre重组酶的表达检测
2. 1细胞培养及瞬时转染 取牛耳组织剪碎成1mm3左右的小块，DMEM/F12清洗2遍后分批植块于含lmLDMEM/F12+10% FBS的25cm2的培养瓶中，待组织块贴壁牢固后再补加DMEM/F12+10% FBS至6mL，于37°C、5% C02培养箱培养6 7d，每2d换液1次，待细胞生长汇合后，以0. 25%trypsin消化传代2 3次，分批以DMEM/F12+20% FBS+10% DMSO冻存，即培养出牛成纤维细胞。
将293T细胞和牛成纤维细胞分别接种于6孔细胞培养板中，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至70-80%汇合度时，按照说明书要求，用Lipofectamine 2000脂质体将cre重组酶表达载体PBS185和pcre-IRESEGFP转入细胞中。
2. 2Western blot检测cre重组酶的表达 转染后的细胞在37t:培养箱中培养48小时后，用碧云天公司的细胞裂解液裂解，
裂解产物以12， 000rpm离心10分钟后取上清做Western blot杂交。杂交中转有PBS185
的细胞表达的cre重组酶为阳性对照，使用的一抗为小鼠抗cre重组酶的单克隆抗体，二抗
为辣根过氧化氢酶偶联的兔抗鼠抗体。杂交结果表明pcre-IRESEGFP载体在哺乳动物细胞
中能够有效表达cre重组酶(图3)。 实施例3基因删除细胞的筛选及鉴定 lLoxP-Nn_LoxP结构的构建 用引物扩增或酶切连接等方法将两个LoxP位点引物pIRES-NE0载体的Neo表达框两端，构建成pIRES-LoxP-NE0-LoxP，其中LoxP-NEO-LoxP结构两端可引入特殊酶切位点，以用于连接到其它特异表达载体。LoxP-NEO-LoxP结构中的NEO基因还可以用其它任意基因结构(Nn， N代表核苷酸序列，n代表核苷酸数)替代，即构建成LoxP-Nn-LOXP结构。
2细胞培养及瞬时转染 将上述LoxP-Nn-LoxP结构(以LoxP-neo-LoxP结构为例)直接转染牛成纤维细胞，可获得稳定整合LoxP-neo-LoxP结构的转基因牛成纤维细胞，将上述转基因牛成纤维细胞接种于6孔细胞培养板中，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至70-80%汇合度时，按照说明书要求，用Lipofectamine 2000脂质体将cre重组酶表达载体pcre-IRESEGFP转入细胞中。 2转染后细胞的流式分选及单克隆培养 转染后的细胞在37t:培养箱中培养48小时，0. 1 %的胰酶消化，流式细胞仪分选表达GFP的阳性细胞，按照500个细胞/100mm培养皿的密度接种细胞，在含10%胎牛血清的匿EM培养基中培养7至8天至长出明显的单细胞克隆点。
3单细胞克隆点neo基因删除的鉴定 将生长状态良好的单细胞克隆点细胞用0. 1%的胰酶消化转接到48孔细胞培养板中，待细胞长满需要传代时，取2， 000-3， 000个细胞做细胞PCR。设计跨LoxP-neo-LoxP结构的引物，用以鉴定neo基因是否被删除。上游引物SM-14 :AACCTACTCGAGATAACTTC，下游引物SM-1922 :GATGGTCGATAGATAACTTC，如果neo基因没有被删除，应扩增出1. 9kb左右的PCR产物。为了避免在删除neo基因的同时，引入GFP和cre重组酶基因，分别设计了扩增GFP和cre重组酶基因的引物(GFP上游引物TGCAGTGCTTCAGCCGCTAC， GFP下游引游CTCAGGTAGTGGTTGTCGGG ;cre上游引物ACATTTGGGCCAGCTAAAC， cre下游引物CGGAAATCCATCGCTCGACC)用以确定体细胞中无GFP和cre重组酶的整合。细胞PCR结果如图4，结果表明，除11泳道样品以外，其它样品均成功删除neo基因，并且没有GFP和cre重组酶的整合。 4囊胚PCR进一步确定neo基因的删除 根据细胞PCR的结果，随机挑选7个不同neo—GFP—cre—的克隆点细胞作为核移植供体细胞进行体细胞核移植，取发育7天的囊胚分别做单囊胚PCR进一步确认neo基因的删除，PCR结果如图5，所用囊胚均无neo基因的存在，并且没有GFP和ere重组酶基因的随机整合。 由此可见，利用本发明方法构建的表达ere重组酶的载体可以不经过药物筛选直接获得标记基因删除的单细胞克隆点，用这些细胞作为体细胞核移植的供体细胞可以获得标记基因删除的克隆囊胚。
序列表说明 SEQ ID No. l&2是用于扩增ere酶基因CDS序列的引物对；SEQID No. 3&4是用于扩增IRES EGFP序列的引物对；SEQ ID No. 5&6用以鉴定neo基因是否被删除的引物对；SEQID No. 7&8以及SEQ IDNo. 9&10是分别用以扩增GFP和ere重组酶基因的引物对。序列表〈110〉北京济普霖生物技术有限公司〈120〉 一种定点删除转基因细胞中的外源基因的方法〈130>KHP08113406. 3〈160>10〈170>PatentIn version 3.5〈210>1〈211>31〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1gaagctegca tgtccaattt actgacegte c〈210>2〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tctcgtecgc teatcgecat cttccagcag〈210>3〈211>41〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3ategeggecg cactegagga attccgcccc tctccctccc c〈210>4〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4tgatctegag tcgcggcggc tttec
7〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列<400>5aacctactcg agateacttc〈210>6〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉6gatggtcgat agateacttc〈210>7〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7tgcagtgctt cagccgctec〈210>8〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8ctcaggtegt ggttgtcggg〈210>9<211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9acatttgggc cagcte朋c<210>10〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>10
权利要求
一种表达荧光蛋白和cre重组酶的表达载体。
2. 如权利要求1所述的表达载体，其中所述荧光蛋白为绿荧光蛋白。
3. —种定点删除转基因细胞中外源基因的方法，其包括如下步骤用权利要求1或2 所述的表达载体导入目的细胞，流式细胞仪分选表达荧光蛋白的细胞，其中所述目的细胞 含有LoxP-Nn-LOXP结构，Nn为序列长度为n的外源基因。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括进一步培养分选出来的细胞，并用 PCR法鉴定。
5. 如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的外源基因为标记基因。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的标记基因为neo基因。
7. 如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的目的细胞为转基因动物细胞。
8. —种筛选被定点删除基因的细胞的方法，其包括如下步骤用权利要求1或2所述 的表达载体导入目的细胞，流式细胞仪分选表达荧光蛋白的细胞，其中所述目的细胞含有 LoxP-Nn-LOXP结构，Nn为序列长度为n的外源基因。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括进一步培养分选出来的细胞，并用 PCR法鉴定。
10. 如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的外源基因为标记基因。
全文摘要
本发明提供了一种定点删除转基因细胞中外源基因的方法，其通过构建表达荧光蛋白和cre重组酶的表达载体，将该表达载体导入目的细胞中，从而在目的细胞中cre重组酶与荧光蛋白共表达，cre酶定点删除掉LoxP-Nn-LoxP结构中的NnDNA序列，通过检测细胞中荧光蛋白的表达，即达到分选基因被定点删除的细胞。本发明方法能够对外源基因或标记基因进行准确的删除，并能准确分选出基因被定点删除的细胞，避免了使用药物分选，对培育无标记基因的转基因动物，对转基因动物研究的进一步发展及转基因动物食品安全具有重大的意义。
文档编号C12Q1/68GK101760473SQ20081024659
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者丁方荣, 孙秀柱, 戴蕴平, 李宁, 王少华 申请人:北京济普霖生物技术有限公司