专利名称：一种便于外源蛋白纯化的原核表达载体及构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种便于进行外源蛋白表达纯化的原核 表达载体的构建方法及应用示范。
背景技术：
利用原核表达系统体外表达某些特定的蛋白是常用的蛋白生产手段之一，其最大 的优点为蛋白产量高、操作简便，目前已有不少成熟的原核表达系统。传统的重组蛋白表达 与纯化通常是在目的蛋白前或后加上特定的标签(如GST tag、His tag等)，形成的融合蛋 白可借助蛋白标签进行亲和层析，层析柱价格昂贵，使得蛋白纯化成本较高，且纯化的融合 蛋白往往需进行体外裂解去除蛋白标签后才能获得很好生物学活性的目的蛋白，常用的裂 解方法主要有化学裂解法(如溴化氰、羟胺、BNPS-3-甲基吲哚等)和酶解法(如fe因子、凝 血酶、肠激酶、胶原酶、凝乳酶等)。化学裂解虽价廉、有效，但由于裂解位点特异性低，还可 能对目的蛋白产生不必要的修饰，该方法逐渐被酶解法代替，而酶解去除标签，所用的裂解 酶价格不但高，还不可避免地混入目的蛋白中，造成新的污染，使得蛋白纯化更加复杂。由 于上述原因，最终获得均一的目的蛋白成本高、周期长，成为制约体外规模化生产目的蛋白 的瓶颈性问题。内含肽(Intein)是蛋白质前体内的肽段，在蛋白质成熟过程中通过精准的自我剪 切以及两侧序列的拼接，从而实现宿主蛋白的成熟。1987年号Neurospora crassa液泡ATP 酶中最早被发现，1989年以后才被Anraku实验室逐渐证实其功能，目前已经发现210个以 上的内含肽，主要分布在低等真核生物、细菌以及病毒的蛋白质中。随着对内含肽剪接机 制的深入研究，在蛋白质工程及其他生物技术领域表现出越来越广阔的应用前景，尤其蛋 白纯化方面，内含肽的发现和应用使得重组蛋白的表达和纯化得到大大改进，将其与其它 蛋白标签，如CBD (Chitin-binding dimain)融合，可通过亲和层析等方法获得融合蛋白， 再利用内含肽的自我剪切功能获得不含任何外源序列的目的蛋白。目前已构建成功多个 内含肽的突变体，可以使得其在特定的条件下(如特定温度，加入硫醇等)发生一侧性剪切， 大大提高蛋白纯化效率和纯度，通过亲和层析和内含肽介导的方法，Mills等人成功纯化出 QACA蛋白，^iao等人成功纯化出绿色荧光蛋白。虽然该方法操作简便，但仍需要使用价格 较高的亲和层析柱，这将重组蛋白的生产成本又推至一定的高度。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供一种新的原核表达载体，该载体适用于外 源重组蛋白的表达、纯化，且纯化操作简便、纯化成本低，对重组蛋白的规模化生产有着很 好的应用前景。本发明所说的原核表达载体是pET-EM，它是在pET30a基础上引入合适的多克隆 位点及Mxe gyrA内含肽、ELP基因，构建得到的新原核表达载体，pET_EM结构如图1所示。本发明还公开了 pET-EM的构建方法，具体包括以下步骤1)用限制性核酸内切酶酶切载体pET30a，大片段连接后，获得载体 pET30a'；
2)引物设计及基因扩增
a.根据MxegyrA内含肽设计一对正反向引物Pl和P2，
Pl 5' -TCCATATGGGTACCCCATGGGCTAGCTCTAGAGGCTCTTCCTGCA TCACGGGA-3，(SEQ ID NO. 1)；
P2 :5，-TTGATATCAGAGCGTGGCTGACGAACCCG-3‘ (SEQ ID NO. 2)； 其中Pl的5’端引入MfeI、^/7l、Afc0I、MeI、i^I、5^7l限制性核酸内切酶酶切位点， 该些酶切位点构成一多克隆位点，供外源基因的插入；P2的5’端引入feoRV限制性核酸内 切酶酶切位点，为构建质粒提供连接端；
b.在P1、P2的作用下，以pYTBll质粒为模板扩增出MxegyrA基因；
3)将扩增的MxegyrA基因，经Ndel、Ecom限制性内切酶酶切后连入载体pET_30a’ 相应的位点，构建载体pET-M ；
mdel限制性内切酶酶切pET-EI-GFP质粒，末端补平后，用5^1酶切，获得的DNA片 段与5^1和双酶切的pET-M载体连接，构建携带多克隆位点、Mxe gyrA内含肽及ELP 基因的重组载体pET-EM。上述方法步骤1)中Sapl和/^_/1酶切后获得的大片段及步骤4)中MfeI限制性 内切酶酶切产物用Klenow大片段DNA聚合酶补平其粘性突出端。上述方法中步骤1)、3)、4)连接时所用的DNA连接酶为T4 DNA连接酶。弹性蛋白样多肽(Elastin-likepolyp印tide, ELP)是一 VPGXG (X 可为任何 氨基酸)五肽组成重复序列，当孵育温度高于相变温度(Phase transition temperature, Tt)时，可自发地从溶液中沉淀析出，而低于八时则呈现可溶状态，当与其他蛋白融合在 一起时，仍具有该特性。本发明利用基因工程技术，将编码目的蛋白基因、内含肽基因以及 ELP基因串联，构建原核表达载体，在大肠杆菌宿主菌中诱导表达三联融合蛋白，超声波破 碎菌体后，低温离心，去除菌体碎片及不溶性蛋白，通过升温使ELP-内含肽-目的蛋白析 出，离心去除可溶性的菌体杂蛋白，重复此过程可获得较纯净的重组融合蛋白。再利用内含 肽在特定条件下的自我剪切活性及ELP融合蛋白的生物特性，经温控离心可将目的蛋白和 ELP-内含肽融合蛋白分离，从而获得纯化的目的蛋白。该过程操作简单，不需要昂贵的亲和 层析柱和裂解酶，有效避免去除蛋白标签时酶蛋白的污染，大大降低了重组蛋白生产成本， 尤其是规模化生产。
图1.载体PET-EM结构示意图。图2.载体pET-EM构建流程图。图 3. PCR 扩增 K205R 基因
M =DNA分子质量标准；1 :PVR产物。图4.重组载体pET-EM-K205R的PCR鉴定，
M1、M2 =DNA分子质量标准；1 重组质粒；2 空载体对照；3 灭菌水对照。图5. SDS-PAGE电泳分析蛋白表达、纯化
4M 蛋白分子质量标准；1 未剪切前的蛋白前体；2 剪切后离心沉淀物；3 剪切离心上清液。图 6. Western blotting 鉴定纯化 K205R 蛋白
1 未裂解融合蛋白；2 裂解后的沉淀；3 裂解后的上清。
具体实施例方式本发明中所涉及的生物材料均为已公开或商品化的材料，具体可通过以下方式获 得，由申请人保存的生物材料自申请日起向公众提供20年
载体pET30a 购于Novagen公司；
载体 pYTBll 购于 NEW ENGLAND BioLabs 公司；
质粒 pET-EI-GFP 美国 Wu Wanyi 博 士 惠赠(B. A. Fong, W. Y. ffu, D. W. Wood. Optimization of ELP-intein mediated protein purification by salt substitution. Protein Expression and Purification, 2009，66(2) :198-202.),申请人保存；
质粒 pGEX-4T-l-K205R 英国 R. Μ. Ε. Parkhouse 博 士 惠赠(S. D. Kollnberger, B. Gutierrez-Castaneda, M. Foster-Cuevas, A. Corteyn and R. Μ. Ε. Parkhouse. Identification of the principal serological immunodeterminants of African swine fever virus by screening a virus cDNA library with antibody. Journal of General Virology, 2002，83:1331-1342.)，申请人保存。实施例一 pET-EM的构建
pET-EM的构建流程如图2，具体步骤如下
1)用限制性核酸内切酶5^I和勒·/〗酶切载体pET30a，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离酶切 产物，胶中DNA回收试剂盒回收酶切大片段，回收产物末端用Klenow大片段DNA聚合酶补 平后，T4 DNA连接酶连接，获得无酶切位点的载体pET30a’ ；
2)根据商品化载体pYTBll上MxegyrA内含肽编码序列，设计合成一对引物 Pl 5' - TCCATATGGGTACCCCATGGGCTAGCTCTAGAGGCTCTTCCTGCA
TCACGGGA-3，(SEQ ID NO. 1)(引物 5，端引入MfeI、^ / I、AfcoI、船el、损aI、5 I 酶切 位点)；
P2 5' -TTGATATCAGAGCGTGGCTGACGAACCCG-3' (SEQ ID N0. 2)(下划线处为引入的 feoRV位点)。以pYTBll质粒为模板，PCR扩增大小约660bp的Mxe gyrA内含肽基因，NdeY、 BcoRY限制性内切酶酶切PCR产物和载体pET-30a’，并用T4连接酶连接酶切产物，构建载 体 pET-M ；
3)NdeI限制性内切酶酶切pET-EI-GFP质粒，酶切后的粘性末端用Klenow大片段DNA 聚合酶补平，再用feci进行酶切，获得一端为feci位点，另一端为平端的ELP基因片段；并 与5^1和双酶切的pET-M载体连接，构建携带多克隆位点、Mxe gyrA内含肽及ELP 基因的重组载体PET-EM (图1)。实施例二 非洲猪瘟病毒K205R基因的原核表达与纯化
1.合成一对引物 Pl :5，-GGTCATATGGTTGAGCCACGCGAACAG-3，(SEQ ID N0. 3)， P2 5'-GGTTGCTCTTCCGCACTTCTTCATCATCTCTTTG-3' (SEQ ID NO. 4)，PCR 方法，从质粒PGEX-4T-1-K205R扩增K205R基因(图3)，回收该DNA片段，限制性内切酶Mfe I和Sap I 双酶切后，插入载体pET-EM，构建重组表达载体pET-EM-K205R (图4)。2.将重组表达载体pET-EM-K205R转化大肠杆菌BLR (DE3)感受态细胞，筛选出 阳性重组菌，接种50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基，37°C摇床(160rpm)中培养0D600为 0. 5时，加入IPTG至终浓度0. 4mM, 20°C诱导24h后，沉淀细菌，在0. 5ml裂解缓冲液(IOmM Tris-HCl, 2mM EDTA, 0. lmg/ml Lysozyme, pH7. 2)反复冻融细菌3次，超声波破碎细菌 (10W，裂解10s，停10s，共3次)，4°C 16000g离心6min，收集上清液。加入等体积0. 8M硫酸 铵，23°C孵育15min，同样温度下16000g离心6min，弃上清，保留沉淀。3.用 0. Iml 切割缓冲液(40mM DTT, 30Mm Hepes, 0. 5M NaCl)悬浮沉淀，4°C切割 40h后，加入等体积的0. 8M硫酸铵溶液，23°C孵育15min，同样温度下16000g离心6min，吸 出上清，4°C保存。4. SDS-PAGE电泳分析上述步骤中蛋白表达及纯化效果，结果显示切割后的上清 液中出现大小约23KD的单一蛋白条带(图5 )，用非洲猪瘟病毒K205R抗体进行Western blotting试验，分析、鉴定该纯化的蛋白，显色后该处出现深棕色条带(图6)，表明该蛋白 与非洲猪瘟病毒K205R抗体发生特异免疫学反应，从而证实用构建的载体pET-EM可方便地 表达、纯化K205R蛋白。
权利要求
1.一种原核表达载体pET-EM，其特征在于它的结构如图1所示。
2.—种构建原核表达载体pET-EM的方法，其特征在于具体构建步骤包括1)用限制性核酸内切酶酶切载体pET30a，大片段连接后，获得载体 pET30a'；2)引物设计及基因扩增a.根据MxegyrA内含肽设计一对正反向引物Pl和P2，Pl 5' TCCATATGGGTACCCCATGGGCTAGCTCTAGAGGCTCTTCCTGCATCACGGGA3’ ；P2 :5’ TTGATATCAGAGCGTGGCTGACGAACCCG3，；其中Pl的5’端引入MfeI、^/7l、Afc0I、MeI、i^I、5^7l限制性核酸内切酶酶切位点， 该些酶切位点构成一多克隆位点，供外源基因的插入；P2的5’端引入feoRV限制性核酸内 切酶酶切位点，为构建质粒提供连接端；b.在P1、P2的作用下，以pYTBll质粒为模板扩增出MxegyrA基因；3)将扩增的MxegyrA基因，经Ndel、Ecom限制性内切酶酶切后连入载体pET_30a’ 相应的位点，构建载体pET-M ；mdel限制性内切酶酶切pET-EI-GFP质粒，末端补平后，用5^1酶切，获得的DNA片 段与5^1和双酶切的pET-M载体连接，构建携带多克隆位点、Mxe gyrA内含肽及ELP 基因的重组载体pET-EM。
3.按权利要求2所述的载体构建方法，其特征在于步骤1)中Seipl和/^_/1酶切后获得 的大片段及步骤4)中MfeI限制性内切酶酶切产物用Klenow大片段DNA聚合酶补平其粘 性突出端。
4.按权利要求2所述的载体构建方法，其特征在于步骤1)、3)、4)连接时所用的DNA连 接酶为T4 DNA连接酶。
全文摘要
本发明涉及一种便于外源蛋白纯化的原核表达载体及构建方法。所说的天表达载体结构如图1所示，它是在载体pET30a基础上，插入多克隆位点及Mxe-ELP基因序列，构建而成。将欲表达得外源蛋白编码基因插入多克隆位点，转化感受态宿主细胞，诱导表达后，利用弹性蛋白样多肽的生物学特点，再借助内含肽MxeGyrA在硫醇存在条件下能自我切割特点，从而分离、纯化出表达的外源蛋白。该表达系统与其他原核表达系统相比，避免使用价格昂贵的层析技术，且操作简单易行，在蛋白生产领域有着极其明显的优势，特别适用于可溶性蛋白的表达纯化。
文档编号C12N15/66GK102080096SQ20101058535
公开日2011年6月1日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者刘文俊, 夏晓莉, 孙怀昌, 张鑫宇, 朱善元, 王健 申请人:扬州大学