纯化的多孔菌属漆酶及编码该酶的核酸的制作方法

专利名称：纯化的多孔菌属漆酶及编码该酶的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码一种真菌氧化还原酶的分离核酸片段，以及由该片段所产生的纯化酶。更具体地讲，本发明涉及编码一种酚氧化酶，特别是担子菌-多孔菌属的漆酶的核酸片段。
背景技术：
漆酶(苯二醇氧氧化还原酶)是含多个铜的酶，它能催化酚类物质的氧化。漆酶对合适酚类底物的氧化作用，会导致芳氧基中间体的产生，所产生的中间体通过最终聚合，形成由二聚、低聚和多聚反应产物组成的混合物。这种反应在导致黑素、生物碱、毒素、木素和腐殖酸形成的生物合途径中实际上起着重要作用。漆酶可由很多种真菌产生，包括子囊菌，如曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)和柄孢壳菌属(Podospora)，半知菌纲的葡萄孢属(Botrytis)，和担子菌，如金钱属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、香菇属(Lentinus)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、多孔菌属(Polyporus)和完全丝核菌属(Rhizoctonia)。漆酶具有很大范围的底物专一性，而且，各种不同真菌的漆酶在其氧化酚类底物的能力方面通常仅有量的差别。由于其底物的多样性，漆酶一般具有很多潜在的工业应用前景。其中包括木素改性、纸张强化、洗涤剂中染料转移的抑制、苯酚聚合作用、果汁生产、酚醛树脂的生产、及废水处理。
由不同真菌菌种制成的漆酶，虽然催化能力相似，但具有不同的温度和pH最佳值，而且，温度和pH最佳值也会根据具体的底物而有所不同。已经分离得到多种上述真菌漆酶，而且，编码其中几种酶的基因也已被克隆。例如，Choi等(Mol.Plant-Microbe Interactions 5119-128，1992)披露了编码粟树枯萎真菌Cryphonectria parasitica的漆酶的基因的分子特征和克隆。Kojima等(J.Biol.Chem.26515224-15230，1990；JP2-238885)披露了白腐担子菌Coriolus hirsutus漆酶的两种等位形式。Germann和Lerch(Experientia 41801，1985；PNAS USA838854-8858，1986)报道了对粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)漆酶基因的克隆和部分序列分析结果。Saloheimo等(J.Gen.Microbiol.1371537-1544，1985；WO92/01046)披露了对来自真菌Phlebia radiata的漆酶基因的结构分析结果。
所做的在异源真菌系统中表达漆酶基因的尝试，通常获得极低的产率(Kojima等，Supra；Saloheimo等，Bio/Technol.9987-990，1991)。例如，在实验室规模的发酵中，Phlebia radiata漆酶在Trichoderma reesei中进行的异源表达，在每升发酵液中仅有20mg活性酶(Saloheimo，1991，supra)。尽管漆酶具有巨大的商业潜力，但是，能否大量表达这种酶是决定其商业应用前景的关键。以前所做的在重组宿主中表达担子菌漆酶的尝试中，只得到极低的产率。本发明要提供在曲霉属中表达良好的新的担子菌漆酶。

发明内容
本发明涉及一种DNA结构，该结构带有一段编码一种多孔菌属漆酶的核酸序列。本发明还涉及分离到的由上述核酸序列编码的漆酶。这种漆酶最好基本上是纯的。“基本上是纯的”是指一种漆酶中基本上(即≥90％)不含其它非漆酶蛋白。
为促进上述新漆酶的生产，本发明还提供了带有要求保护的核酸序列的载体和宿主细胞，这种载体和宿主细胞可用于所述漆酶的重组生产。所述核酸序列与转录和翻译信号可操纵地连接，这些信号可指导所述漆酶蛋白在所选择的宿主细胞中表达。优选的宿主细胞是真菌细胞，曲霉属的细胞为最佳宿主细胞。本发明漆酶的重组生产是这样实现的在适合漆酶蛋白表达的条件下培养用本发明的结构转化或转染的宿主细胞，并从培养物中回收所述漆酶蛋白。
本发明的漆酶可用于很多需要对酚类物质进行氧化的工业方法中。所述方法包括木素加工、果汁生产、苯酚聚合和酚醛树酯生产。


图1表示带有LCC1(SEQ ID No.1)的基因组克隆21GEN的DNA序列和该序列的翻译。
图2表示带有LCC2(SEQ ID No.3)的基因组克隆23GEN的DNA序列和该序列的翻译。
图3表示带有LCC3(SEQ ID No.5)的基因组克隆24GEN的DNA序列和该序列的翻译。
图4表示带有LCC4(SEQ ID No.7)的基因组克隆31GEN的DNA序列和该序列的翻译.
图5表示带有LCC5(SEQ ID No.9)的基因组克隆41GEN的DNA序列和该序列的翻译.
图6表示载体pMWR1的结构。
图7表示载体pDSY1的结构。
图8表示载体pDSY10的结构。
图9表示由pDSY2所产生的漆酶的pH曲线；(A)丁香醛连氮氧化作用；(B)ABTS氧化作用。
图10表示用漆酶和H2O2分别处理各种用于染发的染料前体的比较，测量DL*。
图11表示用漆酶和H2O2分别处理各种用于染发的染料前体的比较，测量Da*。
图12表示用漆酶和H2O2分别处理各种用于染发的各种染料前体和改性剂的比较，测量DL*。
图13表示分别用漆酶和H2O2染过的头发的洗涤稳定性的比较。
图14表示分别用漆酶和H2O2染过的头发的耐晒性。
具体实施例方式
Polyporus pinsitus是一种担子菌，又被称为绒毛样栓菌(Trametesvillosa)。多孔菌早先就已被确认为漆酶生产菌(Fahraeus和Lindeberg，Physiol.Plant.6150-158，1953)。不过，尚未见从Polyporus pinsitus中提纯漆酶的报道。业已证实Polyporus pinsitus能产生至少两种不同的漆酶，而且可将编码这两种酶的基因用于在简便的宿主系统，如曲霉属中以较高的产率生产这种酶。另外，还分离到能编码漆酶的3个其它基因。
通过对各种真菌菌株的初步筛选表明，P.pinsitus是一种漆酶产生菌，P.pinsitus产生漆酶是由2，5-二甲代苯胺诱导的。首先，从诱导的菌株的上清液中分离漆酶。阴离子交换层析证实，一种约为65kD(在SDS-PAGE上测得)的蛋白质具有漆酶活性。对该酶进行充分纯化，以便得到几种内肽序列，和N-末端序列。初步的序列资料表明，这种漆酶与Coriolus hirsutus的漆酶以及一种未鉴定的担子菌漆酶有明显的同源性(Coll等，Appl.Environ.Microbiol.594129-4135，1993)。根据上述序列信息设计出PCR引物，并对从P.pinsitus中分离的cDNA进行PCR。通过PCR获得了一条预计大小的带，而且，分离得到的与纤维素酶信号序列连接的片段被证实可在米曲霉(A。Oryzae)中表达一种活性漆酶，但表达水平很低。上述PCR片段之一还被用作筛选P.pinsitus cDNA文库的探针。以这种方式鉴定得到100个以上的阳性克隆。对这些阳性克隆进行特征分析，并对最长克隆的末端测序；在这些克隆中，没有发现一个具有完整长度。
还进行了分离完整长度克隆的进一步努力。用按上述方法分离到的最完整的cDNA片段检测一个5-6kb BamHI大小选择的P.pinsitus基因组文库。初步筛选证实，克隆24GEN(LCC3)与该cDNA有同源性，但它不是该cDNA编码的漆酶，而且也不是完整长度。随后筛选一个7-8kb BamHI/EcoRI大小选择的文库表明，至少有两种漆酶；部分序列分析表明，一种被称为21GEN(LCC1)的克隆与所分离的原始部分cDNA克隆相同，而另一种被称为31GEN(LCC4)的克隆是一种新的，以前未鉴定过的漆酶。用LCC1作为探针再次筛选一个EMBL4基因组文库，鉴定了一类含有完整的LCC1插入片段及其5′和3′侧翼区的克隆。用LCC3筛选EMBL文库鉴定了另外两个编码漆酶的克隆，这两个克隆是以前未被鉴定过的，被称为41GEN(LCC5)和23GEN(LCC2)，它们在结构上也与另外3个克隆LCC1、LCC3和LCC4不同。上述每种漆酶的核酸序列和预测的氨基酸序列分别在图1-5和序列号SEQ ID No.1-10中给出。在表2中对每种漆酶的结构组织进行了比较。这些漆酶通常在约4-5.5的酸性pH条件下具有最佳活性。
将LCC1用于产生表达载体，再将所产生的载体用于转化曲霉属的各种菌种。在所有试验过的菌种中转化都取得了成功，但表达水平在黑曲霉(Aspergillus niger)中最高。在摇瓶培养中，能产生浓度为15mg/l或15mg/l以上的漆酶，而在实验室规模的发酵罐中，获得了超过300mg/l的产率。与先前用其它漆酶和其它真菌宿主细胞获得的漆酶水平相比，上述产率代表了一种重大改进。
根据本发明，通过上述方法或本领域中任何其它已知方法，利用本发明所提供的信息，可获得编码一种漆酶的多孔菌属基因。该基因可利用一种表达载体以活性形式表达。适用的表达载体，带有一个能使该载体稳定整合到宿主细胞基因组上或能使该载体在宿主细胞中独立于该宿主细胞的基因组之外进行自主复制的因子，而且最好还带有一个或一个以上便于选择转化宿主细胞的表型标记。该表达载体还可以包括编码启动子、核糖体结合位点、翻译起始信号的各种操纵序列，并可有选择地带有一个阻抑基因或各种激活基因。为了让表达的蛋白能够分泌，可将编码一种信号序列的核苷酸插在基因编码序列之前。为了在操纵序列指导下进行表达，将有待按照本发明使用的漆酶基因与所述操纵序列在正确的阅读框架中进行可操纵连接。可结合到质粒载体上、并可指导漆酶基因转录的启动子序列，包括但不限于原核β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)和tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)。还可从“Useful Proteins from recombinant bacteria”(Scientific American，1980，24274-94)一文和SamDrook等所著的Molecular Cloning(1989)一书中找到其它可供参考的信息。
携带本发明DNA结构的表达载体，可以是有利于进行重组DNA方法的任何载体，载体的选择通常取决于将被导入所选载体的宿主细胞。因此，所述载体可以是一种自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，如质粒或染色体外因子，微型染色体或人工染色体。另外，所述载体可以是这样的当它被导入宿主细胞后能整合到宿主细胞基因组上，并与其所整合的染色体共同复制。
在该载体上，漆酶DNA序列与一个合适的启动子序列可操纵地连接。该启动子可以是任何在所选择的宿主细胞中具有转录活性的DNA序列，并可由编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因衍生而来。用于指导本发明的DNA结构转录，特别是在细菌宿主中转录的合适的启动子的例子有大肠杆菌(E.coli)lac操纵子的启动子、StreptomgcesCoelicolor琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣型芽胞杆菌(BacillusLicheniformis)α-淀粉酶基因(amgL)启动子、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦淀粉酶基因(amgM)启动子、淀粉液化杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)启动子或枯草杆菌(Bacillus Subtilis)xylA和xylB基因启动子。在酵母宿主中，一种有用的启动子是eno-1启动子。为了在真菌宿主中转录，可以使用的启动子的例子有由编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因衍生而来的启动子。优选TAKA-淀粉酶和glaA启动子。
本发明的表达载体还可包括一个合适的转录终止子，而且，在真核生物中，与编码本发明漆酶的DNA序列可操纵地连接的聚腺苷酸化序列。终止序列和聚腺苷酸化序列可以源自与上述启动子相同的来源。所述载体还可以包括一个使该载体能够在上述宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列的例子包括质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
所述载体还可以包括一个选择标记，例如一个基因，该基因的产物能够弥补宿主细胞的某种缺陷，如来自枯草杆菌或地衣型芽胞杆菌的dal基因；或是一种能赋予抗生素抗性，如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。曲霉属选择标记的例子包括amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC和hygB，一种能产生潮霉素抗性的标记。用于曲霉属宿主细胞的优选选择标记是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记。常用的哺乳动物标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。另外，还可以通过共转化实现选择，例如在WO91/17243中所披露的。
一般，希望表达能够产生一种胞外产物。因此，本发明的漆酶可以包括一个前导区，它使得表达的蛋白质能分泌到培养基里。如果需要，该前导区可以是本发明漆酶的天然前导区，或是被其它前导区或信号序列所取代，通过取代编码相应前导区的DNA序列可很容易地实现上述目的。例如，所述前导区可来源于获自曲霉菌的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、获自芽胞杆菌的淀粉酶基因、获自Rhizomucer miehei的脂肪酶或蛋白酶基因、获自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子编码基因或小牛前凝乳酶原基因.特别理想的是，当宿主是真菌细胞时，所述前导区为米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶的信号序列，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶信号，Rhizomucor miehei脂肪酶信号，芽包杆菌NCIB11837生麦淀粉酶、嗜热芽胞杆菌α-淀粉酶、或地衣型芽胞杆菌枯草溶菌素的信号序列.
用于把本发明的DNA结构分别与启动子、终止子和其它因子连接的方法，以及将连接后的DNA序列插入带有复制所需的信息的合适载体的方法，是本领域技术人员所熟知的(例如，Sambrook等，MolecularCloning，1989)。
带有上述本发明的DNA结构或表达载体的本发明的细胞，能很好地用作重组生产本发明的酶的宿主细胞。该细胞可用本发明的DNA结构进行转化，通过将DNA结构整合到宿主染色体上而顺利地进行。这种整合被一般视为一种优点，因为该DNA序列更倾向于稳定地维持在细胞中。所述DNA结构与宿主染色体的整合可通过常规方法实现，例如，通过同源或异源重组。另外，还可用上文中与不同类型宿主细胞一起论及的表达载体转化所述细胞。
所述宿主细胞可选自原核细胞，如细菌细胞。合适的细菌的例子包括革兰氏阳性细菌，如枯草杆菌、地衣型芽胞杆菌、Bacillus lentus、短杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽胞杆菌(Bacillusalkalophilus)、淀粉液化芽胞杆菌、凝固芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)、环状芽胞杆菌(Bacillus Circulans)、Bacillus lantus、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)或铅色链霉菌(Streptomyces lividans)或灰色链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。细菌的转化可通过已知方法来实现，例如通过原生质体转化或通过使用感受态细胞.
所述宿主细胞也可以是真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或最好是真菌细胞，真菌细胞包括酵母和丝状真菌。例如，可选用的哺乳动物细胞包括CHO或COS细胞。酵母宿主细胞可选自酵母属或裂殖酵母属的一个种，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。能采用的丝状真菌，可选自曲霉属的一个种，如米曲霉或黑曲霉。另外，还可以把镰孢菌(Fusarium sp.)，如尖镰孢(F.oxysporum)用作宿主细胞。真菌细胞可以通过一种包括原生质体形成和原生质体转化的方法转化，在原生质体转化之后，以一种已知方式再生细胞壁。在欧洲专利EP238023中披露了一种转化曲霉属宿主细胞的适宜方法。Malardier等(1989)披露了一种转化镰孢菌的合适方法。
因此，本发明提供了一种生产本发明的重组漆酶的方法，该方法包括在有利于所述漆酶产生的条件下培养上述宿主细胞，从该细胞和/或培养基中回收所述漆酶。用于培养上述细胞的培养基可以是任何适于这种宿主细胞生长并能表达本发明的漆酶的常规培养基。合适的培养基可从供应商那里购买或按照公开的配方(例如，可参看American TypeCulture Collection目录)制备。
在一种优选实施方案中，在有过量铜的条件下，在培养中实现了漆酶的重组生产。尽管加入培养基中的微量元素通常含有少量的铜，但结合本发明所做的实验表明，补加铜可以使活性酶的产率增加很多倍。理想的是，以可溶形式把铜加进培养基中，最好是以可溶性铜盐形式加入，如氯化铜、硫酸铜或乙酸铜。培养基中铜的最终浓度应在0.2～2mM范围内，最好在0.05～0.5mM范围内。这方法可用于提高任何重组生产的真菌漆酶，以及其它含铜酶，特别是氧化还原酶的产率。
可通过常规方法从培养基中回收所产生的酶，该方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞；用盐，如硫酸氨沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分；随后用各种层析方法进行提纯，如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。理想的是，通过SDS-PAGE测得所提取的蛋白质的纯度约为90％，在食品、果汁或洗涤剂方面的应用中，纯度最为重要。
在一种特别优选实施方案中，在真菌宿主细胞，如曲霉属细胞里实现了漆酶的表达。正如将要在下面的实施例中详细讲述的，把漆酶基因连接在一种带有米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和构巢曲霉amdS选择标记的质粒上。另外，admS也可以在另一种质粒上，将这种质粒用于共转化。按照Yelton等(PNAS USA811470-1474，1984)的方法，用上述质粒转化曲霉菌宿主细胞，如米曲霉或黑曲霉宿主细胞.
特别值得一提的是，在本发明中以曲霉菌为宿主细胞所得到的多孔菌属漆酶的产率出乎意料地明显高于先前报道过的在其它宿主细胞中表达其它漆酶的产率。预计，在生产来自其它担子菌，如草盖菌属(Coriolus)或栓菌属(Trametes)的漆酶时，将曲霉菌属用作宿主细胞，也能产生比以前所能达到的量更大的酶。因此，本发明还包括在曲霉属重组宿主细胞中生产上述类多孔菌属漆酶。
本领域技术人员可以理解，本发明并不局限于使用本文所披露的核酸片段，例如在图1-5中披露的核酸片段。很明显，本发明还包括编码与图1-5所示相同的氨基酸序列的核苷酸序列，但这种序列由于遗传密码的简并而与图中所示的核苷酸序列有所不同。此外，在说明书和权利要求书中对图1-5的说明应当被理解为既包括所示出的基因组序列，又包括相应的cDNA和RNA序列，而本文所采用的“DNA结构”和“核酸序列”应当被理解成包括所有这类变形。“DNA结构”一般被理解成单链或双链DNA分子，这种DNA结构可以从天然存在的基因中分离出它的一部分，或对其进行修饰，以使其含有以天然状态下没有的方式结合和并列的DNA片段。
另外，本发明还包括其它多孔菌属漆酶，如存在于Polyporuspinsitus中的其它形式的漆酶，以及由Fries所定义的多孔菌属的定义范围内的其它真菌中所存在的漆酶，或Long等(1994，ATCC Names ofIndustrial Fungi，ATCC，Rockville，Maryland)所定义的多孔菌属的同物异名真菌中所存在的漆酶。通过采用在本发明实施例中所述的方法，可以从本文所列举的来源之外的、公开销售的多孔菌属菌株鉴定和分离漆酶基因。另外，这里所披露的序列可用于设计引物和/或探针，将其用于通过标准PCR或Southern杂交技术分离漆酶基因。其它名称的多孔菌包括，但不局限于P.zonatus、P.alveolaris、P.arcularius、P.australiensis、P.badius、P.biformis、P.brumalis、P.ciliatus、P.colensoi、P.eucalyptorum、P.meridionalis、P.Varius、P.palustris、P.rhizophilus、P.rugulosus、P.squamosus、P.tuberaster和P.tumulosus.还包括同物异名的漆酶，例如，多孔菌属的种或株的变形或完整形式。公众可很容易地从很多培养物保藏中心得到多孔菌属菌株，例如，可从ATCC获得ATCC26721、9385、11088、22084；可从DSM获得DSM1021、1023和1182；可从CBS获得CBS687.70、166.29、101.15、276.31、307.39、334.49和332.49。本发明还包括任何改变形式的核苷酸序列及其所编码的蛋白质，这种蛋白质与图2-5中所示的任一氨基酸序列的同源性至少约为80％、至少约为85％较为理想，至少约为90-95％最为理想，而且在实质上它具有本文所示序列的漆酶活性。上述类型中可以使用的变体包括，例如，已进行过保守氨基酸取代的蛋白质，这种取代不会明显影响该蛋白质的活性。保守取代是指同一类型的氨基酸可被这一类型的其它氨基酸所取代。例如，非极性脂族残基Ala、Val、Leu和Ile之间可以互相替换，碱性残基Lys和Arg之间或酸性残基Asp和Glu之间也可以相互替换。类似地，Ser和Thr互为保守取代基，Asn和Gln互为取代基。本领域技术人员可以理解，可以在对该分子的功能起关键作用的区域之外进行这种取代，并且仍能得到有活性的酶。例如用本发明实施例中所述的标准ABTS氧化方法，能够很方便地测定所保留的需要的活性。
所述蛋白质可用在许多不同的工业方法中。这些方法包括在溶液中的木素聚合，所述木素包括硫酸盐纸浆和木素硫酸盐，通过聚合产生具有较高分子量的木素.这种方法披露于下列文献中Holzforschung(Jin等，45(6)，467-468，1991)；US-4,432,921；EP 0275 544；PCT/DK93/00217(1992)。
本发明的漆酶还可用于牛皮纸桨中木素的原位解聚，从而产生一种木素含量较低的纸浆。漆酶的这种用途，是对现行用氯解聚木素的一种改进，现行方法会产生氯化芳族化合物，这种化合物是由造纸厂生产的对环境有害的付产品。这类用途披露于下列文献中，例如，CurrentOpinion in Biotechnology 3261-266，1992；J.Biotechmol.25333-339，1992；Hiroi等，Svensk papperstidning 5162-166，1976。
对染料或染料前体及其它有色化合物的氧化作用，会导致该化合物脱色。可将漆酶用于这种目的，在不希望染料在织物间转移的情况下，使用漆酶特别有利，例如在纺织业和洗涤剂业中。用于染料转移抑制和染料氧化的方法披露在以下文件中WO 92/01406、WO 92/18683、EP 0495836和Calvo，Mededelingen Van de Faculteit Landbouw-Wetenschappen/Rijiksuniversitet Gent.561565-1567，1991；Tsujino等，J.Soc.Chem.42273-282，1991。
所述漆酶特别适用于染发。在这一用途中，漆酶与染料前体(最好在毛发上)接触，从而实现对染料前体的有控制的氧化，将所述前体转化成染料或色素产生化合物，如醌类化合物。所述染料前体最好是属于下列三大化合物家族之一的一种芳族化合物二胺、氨基苯酚(或氨基萘酚)和苯酚。上述染料前体可单独使用或组合使用。共聚作用的中间体，至少有一种必须是邻-或对-二胺或氨基苯酚(主要中间体)。其例子见下文的第V部分，而且还披露在US-3,251,742中，该专利的内容被用作本文的参考。在一种实施方案中，原料不仅包括所述酶和主要中间体，而且还包括一种改性剂(成色剂)(或多种成色剂的组合物)，所述改性剂通常是间-二胺、间-氨基苯酚、或多酚。在所述漆酶的存在下，所述改性剂再与主要中间体反应，将其转化成有色化合物。在另一种实施方案中，所述漆酶可直接用于所述主要中间体，将中间体氧化成有色化合物。在任何情况下，所述染色方法都可用一种或一种以上主要中间体单独进行或与一种或一种以上改性剂一起进行。各种成分的用量与类似成分的常见商业用量一致，而各种成分的比例可相应变化。
所述漆酶的应用，是对传统的H2O2的使用的一各种改进，在使用H2O2时会损伤毛发，而且使用它还需要高pH，这样也会损伤毛发。相反，与漆酶的反应可在碱性、中性或者甚至在酸性pH条件下进行，而且氧化所需的氧气来自空气，而不是进行苛刻的化学氧化作用。使用所述多孔菌属漆酶所产生的结果，不论在显色方面，还是在耐洗性和耐晒性方面，都可与使用H2O2所产生的效果媲美。另一种商业优势是，可用一个容器包装在没有氧气的条件下同时盛放漆酶及其前体，这种安排不可能用于H2O2的包装。
本发明的漆酶还可用于存在于液体中的酚类或苯胺类化合物的聚合作用。这种用途的一个例子是，用它处理果汁，如苹果汁，这样，所述漆酶可加快果汁中的酚类化合物的沉淀，从而产生一种更为稳定的果汁。这类应用披露了下列文献中Stutz，Fruit Processing 7/93，248～252，1993；Maier等，Dt.Lebensmittel-rindschau 86(5)137-142，1990；Dietrich等，Fluss.Obst 57(2)67-73，1990。
漆酶，如多孔菌属漆酶还可用于土壤解毒(Nannipieri等，J.Environ.Qual.20510-517，1991；Dec和Bollag，Arch.EnViron.Contam.Toxicol.19543-550，1990)。
通过下面的非限定实施例对本发明作进一步说明。
实施例I.分离Polyporus pinsitus漆酶材料和方法1.酶促试验除非另有说明，在本申请的所有实施例中，漆酶活性是按下述方法用丁香醛连氮和2，2′-双连氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)测定的。使用19μM底物，在530nm波长处监测丁香醛连氮的氧化。在30℃温度下，在25mM乙酸钠、40μM硫酸铜、pH5.5的溶液中，其活性用LACU(μmole/分钟)表示。采用Britton和Robison(B&R)缓冲液进行pH特征研究，这种缓冲液是按照披露于Quelle，Biochemisches Taschenbuch，H.M.Raven，II.Teil，s.93u.102，1964中的方法制备的。ABTS氧化作用，是使用0.1mM ABTS，在0.1MNaAc(pH5.0)中，在室温下进行的，通过在96孔滴定板(Costar)上监测ΔAbs405或在石英比色杯中监测ΔAbs418。重叠ABTS氧化酶活性试验是这样进行的将冷却的ABTS-琼脂糖(0.03～0.1gABTS，1g琼脂糖、50ml H2O、加热溶化琼脂糖)倾注在天然IEF凝胶或PAGE上，并在室温下保温。
2.漆酶的初步分离为了提取所述漆酶，在一个超滤器(缓慢过滤)上用HFSC过滤800ml培养液。在一个带有GR81PP膜的Amicon cell上，将所得到的澄清滤液浓缩并洗涤至72ml的体积。
将1ml漆酶试样同用0.1M磷酸盐(pH7)平衡过的Q-SepharoseHP(Pbarmacia，Sweden)柱结合，并用NaCl梯度液洗脱结合上去的漆酶。总共对10×1ml的样品进行提纯，收集，浓缩并通过超滤洗涤，超滤时使用分子量截断值为6kD的膜。
3.二次提纯在二次提纯时，通过超滤对发酵液进行过滤和浓缩。原料中含187LACU/ml。所得浓缩液在一个Propex23滤器(P&S Filtration)上，用3％Hyflo Cuper-Cel(HSC；Celite Corporation)进行快速过滤，随后在一个Filtron滤器上进行两次超滤，使用两个膜，每个膜的分子量截断值为3kD。把所得到的样品(2.5mS/cm，pH7.0，4℃)加到一个130ml Q-Sepharose柱上，该柱用磷酸钠(1.1mS/cm，pH7.0)平衡过。在这种条件下，漆酶不与上述柱结合，但在加入并用平衡缓冲液洗涤时缓慢地从柱上洗脱，以致只能与其它棕色材料部分分离。
将这种部分提纯的1.0mS的制剂(在20℃下pH7.0)加到Q-Sepharose柱上。该柱用20mM磷酸钠(2.2mS，pH7.0)平衡。在这种条件下，漆酶与柱结合，并可由0-1M NaCl梯度以20倍的柱体积洗脱。
3、序列分析为了进行内肽序列分析，用胰蛋白酶消化纯化的蛋白质，然后用HPLC提纯肽。在一台Applied Biosystem473A序列测定仪上分析纯化的肽的序列。
B、结果和讨论1、初步特征分析初步提纯的总产率大约为50mg(在A280nm处测得)。纯化的酶为浓蓝色，而且在SDS-PAGE上大约65kd的位置仅有两条极为接近的带。用含有底物的天然PAGE进行的叠层试验表明，两条带对ABTS都有漆酶活性。吸收光谱表明，除了在A280nm处有吸收外，纯化的漆酶在约600nm处也有吸收。
2、序列分析对初步纯化的蛋白质进行N-末端测定表明，有一个单一序列
Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thy-Ile-Thr-Asn-Ala-Ala-Ala-Val-Ser-Pro-Asp-Gly-Phe-Pro…由于该N-末端序列并非可用于构建探针的理想序列，又进行了胰蛋白酶消化的其它试验，随后再对所得片段进行进一步提纯(按上述方法)和测序。
2、二次提纯和特征分析在二次提纯时，由另一个Q-Sepharose层析步骤产生以下洗脱库(pools)。
Q-Sepharose-2-库-140ml 112LACU 47LACU/A280Q-Sepharose-2-库-380ml 385LACU 65LACU/A280洗脱产率大于加样量的80％。高度纯化的制剂Q-Sepharose-2-库-3的A280＝5.9，而A280/A260＝1.4。以蛋白质计算，原料中漆酶的纯度极高，但原料为非常深的棕色。在SDS-PAGE上可见到两条带，一条65kD的主带，和一条较小的62kD的带。采用阴离子层析，在第一个峰(Q-Sepharose-2-库-1)中，仅能看到主带，而在第二个峰(Q-Sepharose-2-库-3)中，两条带都可以看到。
3、序列测定了若干内肽序列，并与Coriolus hirsutus(Ch)漆酶序列进行比较。鉴定的片段如下Tryp 13Ser-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Ala-Ala-Asp-LeuTryp 14Ser-Ala-Gly-Ser-Thr-Val-Tyr-Asn-Tyr-Asp-Asn-Pro-Ile-Phe ArgTryp 16序列1Ser-Thr-Ser-Ile-His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-Gln-Lys序列2Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-Asn-Ala-Ala-ValTryp 18
Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-Asp-Leu-Thr-Ile-Thr-AsnTryp 19序列1Lau-Gly-Pro-Ala-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Asp-Ala-Thr-Leu-Ile-序列2Phe-Gln-Leu-Asn-Val-Ile-Asp-Asn-Asn-Thr-Thr-His-Thr-MetTryp 25Tyr-Ser-Phe-Val-Leu-Glu-Ala-Asn-Gln-Ala-Val-Asp-Asn-Tyr-Trp-Ile-ArgTryp 27Gly-Thr-Asn-Trp-Ala-Asp-Gly-Pro-Ala-PheII.Polyporus pinsitus漆酶cDNA克隆的分离A、材料和方法1、RNA制备用鈲盐/CsCl缓冲法，从10g在有二甲代苯胺诱导的条件下生长6.5小时的P.pinsitus菌丝体中提取RNA。在一个寡脱氧胸苷酸柱上对所得RNA进行聚腺苷酸(Poly-A)选择，采用标准条件。得到120μg mRNA，并以5μg的试样在-80℃下呈冷冻颗粒形式保存。
2、单链cDNA按照生产商的说明，用反转录酶“Super Script”(BRL)合成单链cDNA。
3、cDNA文库的构建用库存的IV cDNA试剂盒(Invitrogen)构建一个cDNA文库。得到50个cDNA库，每库含有大约5000个转化体。
4、PCR在下列标准条件下进行PCR100pmol各种引物，10μl10×PCR缓冲液(Perkin-Elmer)，40μl dNTP 0.5mM，2μl单链cDNA(或约100ng染色体DNA或100ngPCR片段)，用H2O把体积调至100μl，2.5UTaq聚合酶。进行3次。(40℃/2分钟，72℃/2分钟，94℃/1分钟)循环，接着再进行30次(60℃/2分钟，72℃/2分钟，94℃/1分钟)循环。
B、结果和讨论1、克隆P.pinsitus漆酶用引物#3331ACCAGNCTAGACACGGGNTC/AGATACTG/ACGNGAGAGCGGAC/TTGCTGGTCACTATCTTCGAAGATCTCG和引物#3332CGCGGCCGCTAGGATCCTCACAATGGCCAA/CTCTCTG/CCTCG/ACCTTC.进行PCR。获得一条清晰的约1500bp的带。用NotI/Hind III消化这种DNA，并在琼脂糖凝胶上进行分离。对上带(片段#42)进行提纯，并将其克隆到曲霉属载体pHD423上。未得到转化体。为了克隆该片段，进行了几种试验，包括用限制酶进行再消化，末端磷酸化，补充克列诺(Klenow)片段，和在SmaI裂解的puC18上进行平端克隆，但均未成功。用根据Coll等披露的漆酶制备的漆酶探针杂交，结果表明，上述PCR产物可能是P.pinsitus漆酶。在试图克隆该PCR片酸的新的努力中，进行一种新的PCR反应，采用与片段#42相同的条件。结果又得到约为1500bp的片段(片段#43)。这一次是用Hind III/BamHI裂解该片断，并将其同Hind III/BamHI裂解的pUC18连接。发现3个克隆#43-/A，-B、-G中带有1500bp的片段。部分序列分析结果表明，这些片段与漆酶有关。
2、P.pinsitus漆酶的表达为了表达所述漆酶，将片段#43与来自一种43KD纤维素酶的信号序列连接，将引物pHD433(TAGCGGATCCCACAATGCGTTCCTCCCCCCTCCTCCCGTCCGCCGTTGTGGCCGCCCTGCCGGTGTTGGCCCTTGCCGGCATTGGGCCCGTCGCGGACC)用于进行标准的PCR反应，采用一种pUC正向引物(NewEngland Biolabs)。为了减少用到有错误的DNA的危险，将3个克隆都用作模板。
在PCR反应中产生的DNA带有引物pHD433和模板43-A和43-G，用Hind III/BamHI对所得DNA进行裂解，并将其克隆到曲霉属表达载体pHD414(在下文详细讲述)上。得到了几个转化子。
将克隆pHD433/43A-1，2，pHD433/43G-2，-3转入米曲霉中。对每种转化的转化体(3-10个)的漆酶产生进行分析。仅在pHD433/43G-3的转化体上测得活力。在amdS平皿上对阳性转化体(编号1，4，6)进行再次分离，并再次试验。在另一轮转化中，又得到10个pHD433/43G-3的转化体。克隆#20、23、26、28和29为阳性.对这些克隆进行再次分离，并通过在ABTS分析(pH4.5)中的显色反应，对两个分离克隆的漆酶表达进行半定量分析。有几个克隆以+-+++的规模表现出中到强的漆酶表达力。
进行进一步克隆，以鉴定完整长度的克隆。以片段#42-4为探针，对由大约350,000个转化体组成的二甲苯胺诱导的cDNA文库进行筛选。检测到100个以上阳性克隆。对这些克隆进行纯化、再筛选，并用Southern印迹进行分析。通过DNA序列测定对最长的两个克隆作进一步分析。发现最长的两个克隆相同，而且，在其3′末端有一个聚腺苷酸片段，并且是在氨基酸末端的第4个氨基酸开始。由不同的克隆测定部分DNA序列。
然后，将pHD433/43G-3用于进一步的克隆研究，如在下面的第IV部分将要讲到的。
III.其它P.pinsitus漆酶野生型酶的纯化和特征分析A、材料和方法1、培养条件用几个取自一周龄P.pinsitus的PDA培养皿的琼脂块接种摇瓶(25oml培养基/2.8升体积的挡板式摇瓶)。每升培养基中含有10g葡萄糖、2.5gL-天冬酰胺、0.2gL-苯丙氨酸、2.0g酵母提取物、2.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、2.0mlAMG微量金属元素、0.002g CuSO4·7H2O、1.0g柠檬酸，用自来水配制，高压灭菌之前pH5.0.培养物在18～22℃温度下在一台旋转摇床上以较低的速度(～100rpm)振荡。7天以后，通过加入0.25ml5N NaOH把每只摇瓶里的pH调至6.0左右，并通过向每只摇瓶中添加0.5ml 2，5-二甲代苯胺储液(以1∶10的比例把二甲代苯胺稀释在乙醇中)诱导所述培养物。将摇瓶再培养24小时，这时，回收每只摇瓶里的培养上清液。
2、材料用作缓冲液的化学试剂起码是试剂级的商业化产品。Endo/N-葡糖苷酶F购自Boehringer-Mannbeim公司。在PharmaciaFPLC上进行层析。光谱分析是在一台分光光度计(ShimadzuPC160)上进行，或是在一台微量板阅读仪(Molecular Device)上进行。
3、纯化先用纱布过滤培养液，并以1000×g的速度离心，以除去胶凝状粉红色二甲代苯胺聚合物。随后用Whatman#2滤纸过渡上清液，并在4℃温度下，在S1Y100(Amicon，Spiral concentrater)上由1500ml浓缩至250ml体积。用水稀释浓缩液，直到0.8mS(从2.5mS开始)，然后在S1Y100上浓缩至250ml。将在-20℃下冷冻过夜的洗涤液解冻，并用Whatman#滤纸过滤，以除去残余的粉红色材料，然后用NaOH把pH值从6.1调整到7.7。得到275ml、0.8mS的黄色液体，将其加到Q-Sepharose XK-26柱(约有64ml凝胶)，该柱用10mM Tris-HCL，pH7.7，0.7mS平衡过。通过用平衡缓冲液加注和洗涤，得到第一份流经该柱的活性漆酶部分。用由平衡缓冲液配成的0-0.5M的线性梯度NaCl溶液，以8.8倍的床体积进行洗脱。第二和第二份活性部分分别被0.15M和0.35M的NaCl洗脱。随后在用2M NaCl和1mM NaOH依次洗脱时，未再检测到活性部分。收集活性部分，调至约10mS，在Centricon-10(Amicon)上浓缩，然后上Superdex75(HR10/30，24ml，Pharmacia)柱，该柱用10mM Tris-HCl、0.15M NaCl、pH8，14mS平衡过。在用加样缓冲液洗脱时，所有3个Q-Sepharose洗脱的漆酶部分都被以相同的洗脱体积洗脱，表明它们具有极为相似的天然分子量。在SDS-PAGE上测定所得漆酶的纯度。
4、蛋白质分析在一个Mini Protean II和一个M0del 111 Mini IEFCell(Bio-Rad)上进行PAGE和天然IEF。在一个Mini trans-blotCell(Bio-Rad)上，用碱性磷酸酶分析试剂盒(Bio-Rad)进行Western吸印。在吸印期间，把一级抗体稀释1000倍。在一台Applied Biosystems(ABT)476A蛋白质测序仪上进行N-末端测序，采用液相TFA输送进行裂解，并用联机HPLC鉴定PTH-氨基酸。按照生产商的说明使用Standard Fast Cycle和Pre-MixBuffer System.按下述方法用糖苷酶进行脱糖基化将3μg蛋白质和3.6单位的糖苷酶在含0.25M NaAc，pH5，20mM EDTA，0.05％2-巯基乙醇的溶液中在37℃下保温18小时，分别将卵清蛋白和牛血清白蛋白用作正、负对照，并通过SDS-PAGE测迁移率。
用购自Hewlett Packand的Amino Quant 1090 HPLC系统进行氨基酸分析，以测定消光系数。用MDS-2000 hydrolysis-station(CEM，Matthews，NC)对冻干的样品进行由微波促进的蒸汽相水解。以含有1％苯酚的6N HCl作为清除剂，将其用于产生酸蒸汽。在70psi(约148℃)压力下，水解时间为20分钟。将水解过的样品冻干，并再溶解于20μl 500pmol/μl肌氨酸和正缬氨酸溶液中，并把这两种氨基酸作为内标。按照生产商的说明注射1μl样品，并进行分析。
B、结果和讨论1、纯化前面进行过特征分析的P.pinsitus漆酶的PI值大约为3.5。不过，在以pH7.7预平衡过的Q-Sepharose的流通部分中，检测到显著的漆酶活性。在进行梯度洗脱时，在原先预计的活性部分之前，一个更有活性的部分被从柱上洗脱。UV-可见光谱和SDS-PAGE分析表明，3个部分都是主要含有漆酶.经凝胶过滤进一步提纯之后，在天然未变性条件下检测两个新部分的不同pI值，发现与洗脱顺序一致。
2、特征分析从Q-Sepharose洗脱液中产生的纯漆酶制剂，在SDS-PAGE上，在大约63kDa处有一条相当完美的带。根据在SDS-PAGE上迁移率的变化，脱糖基化检测到约14％(w/w)的碳水化合物。在进行天然-IEF分析时，上述漆酶制剂具有pI6～6.5、5～6.5和3.5的几条带。ABTS-琼脂糖重叠试验表明，所有的带都有活性。在IEF条件下，每一种形式又表现出多种同工型。
中性和酸性形式在605和275nm处有典型的UV-可见光谱。A275/A605之比为30～40。酸-中性型在276nm处有一个峰，而在600nm左右有一个峰肩。
N-末端序列分析表明，中性型中-酸性型的前29个残基相同(表1)。酸型的N-末端与先前分析过的特征型100％的相符。三种型都能与用先前的特征型制备出的抗体进行相当好的交叉反应性。
表1P.pinsitus漆酶的结构和酶解特性

*与酸性型比较为相同残基 ()弱信号3、漆酶活性通过ABTS和丁香醛连氮氧化作用试验3种型的比活性(每A275)。3种型的pH活性曲线的形状和最佳值非常相近在进行ABTS和丁香醛连氮氧化时，均分别在pH≤4和pH5～5.5处最佳。
IV.多拷贝P.pinsitus漆酶和基因的分离A、材料和方法1、菌株将下列菌株用在以下所述方法中E.coli K802(el4-(mrca)，mcrB，hsdR2，galK2，galT22，supE44，metB1；Clonetech)；E.coli XL-1 Blue(recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，Lac〔F′proAB，lacIqZDM15，Tn10(tetr)〕；Stratagene)和P.pinsitus CBS 678.70。
2.基因组DNA分离让P.pinsitus培养物在500mlYG(0.5％酵母提取物，2％葡萄糖)中，在室温下生长3-4天。通过米拉布(miracloth)收集菌丝体，用TE洗两遍，并在液氮中快速冷冻。将冷冻的菌丝体放在-80℃下保存。为了分离DNA，用电动咖啡磨把菌丝体磨成细末。将粉末状菌丝体再悬浮于TE中，使终体积为22ml。加入4ml 20％SDS，并通过倒位混合，然后在室温下保温10分钟.用苯酚/氯仿温和提取所得样品，并离心分离水相和有机相。收集水相，加入400μl蛋白酶A(10mg/ml储液)。将样品在37℃下保温30分钟，然后用苯酚/氯仿抽提。往水相里加入0.1体积3MNaAc，pH5.2和2.5体积的95％乙醇，并在-20℃下冷冻1小时。离心沉淀DNA后，将沉淀物再悬浮于6mlTE中，加入200μ1煮沸的RNase A(10mg/ml储液)。在37℃下保温之后，加入100μl蛋白酶A(10mg/ml储液)，随后在37℃下保温30分钟。用苯酚/氯仿将该样品抽提2次。向水相中加入0.1体积的3M NaAc和2.5体积95％的乙醇，并将样品在-20℃下冷冻1小时。离心以后，将沉淀轻轻地悬浮在400μl TE中，并加入40μl NaAc和1ml 95％乙醇。离心使DNA沉淀，并用70％乙醇洗涤沉淀。将最终的沉淀再悬浮于250μl TE中。
3、RNA制备从菌丝体中提取RNA，菌丝体是从P.pinsitus培养物中获得，培养物通过加入2，5-二甲代苯胺的方式诱导过漆酶的表达，或未诱导过。洗涤菌丝体，并在液氮中快速冷冻。用一台电动咖啡磨把冷冻的菌丝体磨成细末。马上把菌丝体末悬浮于20ml抽提缓冲液(0.2M Tris-HCl，0.25M NaCl，50mM EGTA，0.8％萘磺酸三-异丙酯，4.8％对-氨基水杨酸pH8.5)中。所有用于提取RNA的溶液都是用由焦碳酸二乙酯(DEP)处理过的水配制的。将样品放置在冰上，并加入0.5体积TE饱和的苯酚/氯仿。倒位2分钟充分混合样品，并通过离心进行相分离。保留水相，用2ml抽提缓冲液抽提有机相两次，并在68℃下保温5分钟。离心进行相分离，尔后收集水相，并用苯酚/氯仿抽提几次，直至界面上不再有任何蛋白质。向水相中加入0.1体积的3M NaAc，pH5.2和2.5体积的95％乙醇，使RNA沉淀，并把样品放在-20℃下冷冻2小时。沉淀RNA，并再悬浮于含有RNase抑制剂的DEP水中。
4、DNA序列分析核苷酸序列是这样测定的利用TAQ聚合酶循环测序法，用荧光标记的核苷酸进行测序，而且，反应是在一台AppliedBiosystems自动DNA测序仪(Model363A，Version1.2.0)上电泳进行。
5、制备基因组文库构建2个大小选择的P.pinsitus基因组文库。一个5～6kbBam HI片段的文库建在p Bluescript+上。用BamHI消化基因组DNA，并在制备琼脂糖(IBI)凝胶上对消化产物进行电泳。将带有5-6Bam HI片段的部分从电泳凝胶上切下来。用Geneclean试剂盒(BIO 101)从凝胶中分离DNA。将得到的DNA连接到预先用Bam HI消化过的p Bluescript质粒上，并用BAP(GIBCOBRI)脱磷酸化，用连接的产物转化E.coli XL-1Blue感受态细胞(Stratagene)，得到12,000个白色菌落。
一个7-8kb的Bam HI/Ec0 RI片段的文库建在pUC118上。用Bam HI和EcoRI消化10μg基因组DNA，并用BAP(GIBCOBRL)进行处理.用连接产物转化感受态E.coli XL-1Blue细胞(Stratagene)，所得文库中含有大约8000个转化体.
为了在λEMBL4上构建总基因组文库，用Sau 3A对P.pinsitus基因组DNA进行部分消化。消化以后，在制备低熔点琼脂糖凝胶上对DNA进行电泳，并把含有9～23kb大小的DNA的带从凝胶上切下来。用琼脂糖(New England Biolabs)从凝胶中提取DNA。按照供应商的说明分离EMBL4臂(Clonetech).用Gigapack II试剂盒(Stratagene)在体外包装连接产物。用E.coliK802细胞滴定所建的文库.估计未扩增的文库中具有35,000个独立的重组体。用E.coli K802细胞扩增该文库。
6、Southern和Northern吸印在琼脂糖凝胶上，在TAE缓冲液中使用标准方法对DNA样品进行电泳。RNA样在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行电泳。通过在碱性条件下的毛细作用或一个真空印迹装置把DNA和RNA凝胶转移到Zeta-Probe膜(BIO-RAD)上。转移之后，对DNA凝胶进行UV交联。在65℃下对转移的印迹进行预杂交，预杂交在1.5XSSPE，1％SDS，0.5％脱脂奶粉和200μg/ml鲑精DNA的溶液中进行1小时。将放射性探针直接加入预杂交溶液里，在65℃下继续进行杂交过夜。在65℃下用2XSSC洗涤印迹5分钟，再在65℃下用0.2XSSC，1％SDS，0.1％焦磷酸钠洗涤30分钟，两次。
放射性标记的探针是用α-32P-dCTD和一种切口平移试剂盒(GIBCO-BRL)制备的。
7、文库筛选为了筛选大小选择的5-6kb BamHl和7-8kb BamHI/EcoRI文库，将LB carb平皿上的大约500个菌落转移到Hybond N+滤膜(Amersham)上，采用的是标准方法。在中和以后，对上述滤膜进行UV交联。在65℃下对该滤膜进行预杂交，预杂交在1.5XSSPE，1％SDS，0.5％脱脂奶粉，200μg/ml鲑精DNA中进行1小时.将切口平移探针直接加进预杂交溶液时，在65℃下进行杂交过夜.
为了筛选EMBL里的基因组文库，将扩增文库的适当稀释液与E.coli K802细胞一起在100mM NZY顶层琼脂糖上进行平皿培养。用标准方法把菌斑转移到Hybond N+膜(Amersham)上。用标准的UV交联法把DNA交联在上述膜上。用与上文相同的条件对该膜进行预杂交和杂交。
结果和讨论1、多拷贝漆酶基因的分离为了进行Southern分析，用几种不同的限制酶消化P.pinsitus基因组DNA。用由α-32P-dCTP标记过的cDNA插入片段(从PYES载体上分离的Bam HI/SphI片段)检测印迹。按上文所述方法对印迹进行杂交和洗涤。cDNA能与大多数酶的几种限制片段杂交，这意味着在该基因组中有多个漆酶基因。因为cDNA可与一个约5.5kb的BamHI片段杂交，所以构建了一个来自P.pinsitus的5-6kb BamHI片段的文库。
2、基因组文库的筛选筛选基因组文库的结果归纳在表2中。用由32P标记过的原始cDNA克隆筛选5-6kb的BamHI大小选择文库。通过在65℃下杂交筛选到大约30,000个克隆。从两个阳性克隆中分离质粒DNA，并用BamHI消化，以检测插入片段的大小。这两个克隆都带有大约5.5kb的BarnHI插入片段。从两端对克隆的插入片段(LCC3)进行测序；该序列与所述cDNA有同源性，但很显然不是该cDNA所编码的漆酶。LCC3的部分序列还表明，LCC3pUC118克隆不具有完整的基因。
通过对BamHI/EcoRI双消化的DNA进行的Southern印迹分析表明，该cDNA能同一个大约7.7kb的片段杂交。在pUC118上构建的一个大小选择的文库带有7-8的BamHI/EcoRI片段。总共获得大约8000个独立的克隆，并用由32P标记的插入片段进行杂交。从阳性菌落中分离质粒DNA，并用BamHI和EcoRI进行消化.对质粒进行的限制分析表明，可将其分成两类.一类(LCC4)带有四个相同的克隆，并有一个能与所述cDNA杂交的约7.7kb的Bam HI/EcoRI插入片段.另一类(LCC1)带有两个相同的克隆，并有一个能与所述cDNA杂交的约7.2kb的插入片段。对克隆LCC1和LCC4进行的部分DNA序列分析表明，克隆21是原始cDNA的基因组克隆，而LCC4编码另一种漆酶。LCC1的部分DNA序列显示，pUC118克隆不具有完整的基因，而且，需要在EcoRI位点上游的一个片段。
同时，构建了大小选择的7-8kb BamHI/EcoRI文库，在EMBL4上构建的P.pinisitus基因组文库带有大约35,000个独立的重组噬菌体。挑选阳性噬菌斑，并进行纯化。从纯化的噬菌体裂解物中提取DNA。对EMBL DNAs的限制消化证实，有三类克隆。第一类(11GEN)由两个同胞构成，其插入片段带有大小与LCC1相同的BamHI/EcoRI片段，它能与LCCI插入片段杂交。另一类(12GEN)带有一个克隆，它具有不同于11GEN类型的限制图谱，而且，其插入片段带有一个约5.7kb的BamHI/EcoRI片段。第三类由一个单一克隆形成，其插入片段带有一个大约3.2kb的Bam HI/EcoRI片段，它能与LCC1插入片段杂交。DNA序列分析证实，克隆11GEN带有LCC1 BamHI/EcoRI片段和5′与3′侧翼区。还证实克隆12GEN带有一部分LCC1插入片段。
为了克隆完整基因，还用LCC3 BamHI插入片段筛选P.pinisitus EMBL基因组文库。平皿培养大约30,000个噬菌斑并转移用于进行杂交。鉴定并提纯5个能与LCC3(BamHI/EcoRI)插入片段杂交的噬菌斑。从纯化的噬菌体储液中提取DNA。对P.pinisitus基因组DNA所做的Southern分析表明，LCC3 BamHI插入片段能与一个大约7kb的EcoRI片段杂交。限制消化和Southern分析表明，上述克隆中有4个带有能与EcoRI/BamHI(1.6kb)片段杂交的片段，而且，这些克隆分成3种类型。第一类由一个单一的克隆(LCC5)构成，其插入片段带有一个能与LCC3 BamHI/EcoRI片段杂交的3kb的EcoRI片段。另一类是由克隆(LCC2)构成，其插入片段带有一个能与LCC3BamHI/EcoRI插入片段杂交的大约11kb的EcoRI片段.第三类由两个克隆构成，这两个克隆不同，但带有很多相同的限制片段，这两个克隆都带有能与LCC3插入片段杂交的大约7.5kb的EcoRI片段。对第三种类型进行进一步分析还表明，它们与克隆LCC4相同。对LCC5和LCC2所进行的部分DNA序列分析证实，这两个克隆都编码漆酶；但它们都不与上面提到的任何漆酶基因(LCC1、LCC3或LCC4)相同。就此而言，克隆了5个不同的漆酶基因；不过，由LCC5和LCC2克隆的片段上不具有完整基因。
通过对来自克隆LCC5的3kb EcoRI片段进行的DNA序列分析证实，N-末端的大约200bp的片段在E.coRI位点的上游。将一个来自LCC5的380bp的EcoRI/MluI片段用于鉴定一个Mlu1片段的亚克隆，该片段来自LCC5EMBL克隆.对来自LCC5EMBL克隆的一个约4.5kb的MluI片段进行亚克隆，以便进行序列分析，证实其带有N-末端序列。
为了克隆半个LCC3漆酶基因的N-末端，用一个来自LCC3pUC118克隆的约750bp的BamHI/StuI限制片段检测P.pinsitusEMBL基因组文库。对大约25,000个噬菌斑进行筛选，有5个能与上述探针杂交。在进行进一步的提纯时，这些克隆中仅有3个仍为阳性。其中，有两个克隆产生极强的信号，而对从这些噬菌体中分离出的DNA所做的限制消化表明，在这两个克隆的插入片段上都有一个约750bp的BamHI/StuI片段，而且，这两个克隆不相同，但重叠。根据Southern分析的结果，对来自这些克隆的一个约8.5kb的片段进行亚克隆，以便作序列分析。证实EcoRI片段带有完整的基因。
为了克隆半个LCC2漆酶基因的N-末端，用一个来自EMBLLCC2克隆的约680bp的EcoRI/PvuI片段检测建在EMBL4上的P.pinsitus基因组文库。通过在65℃下杂交对30,000个噬菌斑进行筛选，有15个噬菌斑能与上述探针杂交。对所有15个噬菌斑进行纯化，行提取DNA。根据限制图谱，可将这些克隆分成4种类型，这些克隆中的7个均为同胞，并且与LCC2的原始EMBL克隆相同。第二种类型由3个同胞克隆构成。对来自这一类型的一个约4kb的Hind III片段进行亚克隆，以便进行序列分析，证实其带有半个LCC2的N-末端。第三种类型由一个单一的克隆构成，不再对其作进一步特征分析。
3、DNA序列分析按照在材料和方法部分所述的方法，测定5个基因组克隆的全DNA序列。对克隆LCC2的序列分析表明，它可能编码从培养液中提取的第二种形式的漆酶(中性pI)，所述培养液来自按上述方法诱导过的P.pinsitus培养物。对所述中性pI漆酶的N-末端蛋白质序列和预测的由LCC2编码的蛋白质的N-末端进行比较，发现它们相同.由克隆LCC2所编码的蛋白质的预测pI为5.95，它与测定的所述第二种形式的漆酶的实验pI(5.0～6.5)恰好吻合。图1-5(SEQ ID NOS.1-5)表示DNA序列和基因组克隆的预测翻译产物。对于LCC1来说，其成熟蛋白质的N-末端通过蛋白质测序和根据Von Hei jne规则预测在位置22上是Gly。所述N-末端为Gly-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-。对于LCC2来说，通过蛋白质测序测定在其成熟蛋白质的N-末端氨基酸的位置21上是Ala.所述N-末端为Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Ala-。对于LCC3来说，预计其成熟蛋白质的N-末端氨基酸在位置22上是Ser，其N-末端为Ser-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Glu-Leu-。对于LCC4来说，预计其N-末端氨基酸在位置23上是Ala，N-末端为Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-。对于LCC5来说，预计其N-末端氨基酸在位置24上是Ala，N-末端为Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Asp。将所述基因的结构组织和预测的由这些基因编码的蛋白质在表1中列出进行比较。可以看出，所列出的5个基因具有不同的结构，并编码大小稍有差别的蛋白质。还对预测的基因组克隆的蛋白质和其它真菌漆酶进行了比较。在表2中列表对预测的漆酶相互进行了比较，并与其它真菌漆酶进行了比较。克隆LCC1(最先作过特征分析的诱导漆酶)与Coriolus hirsutus漆酶和PM1担子菌漆酶(Coll等，Supra)之间的同一性最大(90％).其它四种漆酶与C.hirsutus漆酶之间的同一性在64～80％之间。由LCC3编码的漆酶与LCC1漆酶和表2中其它真菌漆酶的同一性最低。LCC2是按上述方法分离的另一种野生型漆酶；根据所分离克隆的N-末端序列还可以看出，“中性”和“酸中性”野生型漆酶是由LCC2序列编码的同一种酶。
表1P.pinsitus基因组克隆的结构组织与预测的蛋白质的比较

表2P.pinsitus漆酶与其它真菌漆酶的氨基酸同一性比较

21GEN，23GEN，24GEN，31GEN和41GEN＝P.pinsitus漆酶克隆CRIPHA＝Coriolus hirsutis漆酶ACRIPHE＝C.hirsutis漆酶BPBILAC＝Phlebia radiata漆酶PM1＝担子菌 PM1 漆酶(CECT2971)
5、Northern印迹分析从菌丝体中提取RNA，菌丝体来自二甲代苯胺诱导过的培养物和未诱导过的培养物。电泳以后把RNA吸印到膜上，并用所述cDNA插入片段或一个带有约100bp的23GEN启动子和其编码区的前100个bp的小片段检测所得印迹。一个大约1.8kb的转录物能同时与诱导的和非诱导的RNA样品杂交；不过，该信息的转录，明显会被向培养物中添加二甲代苯胺所诱导。
III.P.pinsitus漆酶在曲霉属中的表达材料和方法1、菌株米曲霉A1560、米曲霉How B104(fungamyl缺陷型，Pyrg)、米曲霉How B101pyrg、黑曲霉Bo-1、黑曲霉B0-80、黑曲霉ATCC1040、黑曲霉NRRL337、黑曲霉NRRL326、黑曲霉NRRL2295、黑曲霉ATCC11358、黑曲霉NRRL322、黑曲霉AT10864、日本曲霉(A.japonicus)A1438、红曲霉(A.Dhoenicis)、臭曲霉(A.foetidus)N953。
2、培养基用MY50培养基(每1升中含50g麦芽糖糊精，2gMgSO4·H2O、10gKH2PO4、2g K2SO4、2g柠檬酸、10g酵母提取物、0.5ml微量金属元素、2g尿素、pH6.0)对黑曲霉、臭曲霉和红曲霉进行摇瓶培养。用MY51(每1升中含30g麦芽糖糊精、2mg MgSO4、10g KH2PO4、2gK2SO4、2g柠檬酸、10g酵母提取物、0.5ml微量金属元素、1g尿素、2g(NH4)2SO4、pH6.0)对米曲霉A1560和HowB101菌株进行摇瓶培养。为了对米曲霉How B104菌株进行摇瓶分析，使用MY51麦芽糖培养基(与MY51相同，但含有50g麦芽糖而不是麦芽糖糊精)。为了对日本曲霉菌株进行摇瓶分析，使用M400培养基(每1升中含50g麦芽糖糊精、2g MgSO4、2g KH2PO4、4g柠檬酸、8g酵母提取物、0.5ml微量金属元素、2g尿素、pH6.0)。
将用于形成原生质体和接下来的转化的生长过夜的培养物生长在YEG(0.5％酵母提取物、2％葡萄糖)上。对于pyrg菌株来说，补充尿苷，使其终浓度为10mM。
3、筛选漆酶产生首先，在基本培养基平皿上筛选一级转化体，培养基中含有1％葡萄糖，作为碳源，并含有1mM ABTS，用于检验漆酶的产生。挑出能在平皿上产生绿色部分的转化体，并在进行摇瓶分析之前进行孢子纯化。
对摇瓶培养样品进行离心，以澄清培养液。用ABTS对稀释或未稀释过的培养液样品进行分析。
结果和讨论1、在摇瓶中表达构建的第一个表达载体是pDSY1，它带有TAKA启动子、TAKA信号序列、P.pinsitus漆酶cDNA，在成熟N-末端的起始部分和AMG终止子。TAKA信号序列漆酶插入片段是分两步构建的。首先通过定点诱变，改变一个碱基，在漆酶成熟编码区的bp107处开始产生一个AgeI位点，并在该漆酶终止子下游约120bp处产生一个NsiI位点(改变分别为ACG GGT→ACC GGT和TTC GCT→ATG CAT)。对漆酶上从SfiI位点开始并在107bp处的AgeI位点结束的一个小PCR片段进行PCR扩增。该片段带有一段TAKA信号序列，以及成熟漆酶cDNA的前面的约107bp。对该片段进行的进一步DNA序列分析表明，它发生了单一的碱基改变，这种碱基变化导致在成熟漆酶的位置9上Asn取代Thr。这种取代产生出一个潜在的N-连接糖基化位点。将该PCR片段和AgeI/NsiI片段克隆到用SfiI/NsiI消化过的pMWR1(图6)上。载体pMR1带有TAKA启动子，一部分TAKA信号序列(它在一个SfiI位点结束)，以及TAKA终止子，一个NsiI位点直接插在该终止子的5′末端。将所得到的表达载体(图7)用于共转化几个宿主。用于曲霉属菌株共转化的方法如Christensen等(Supra)所述。
在第二个漆酶表达载体上，在DSY1上所发生的导致氨基酸位置9上Asn取代Thr的碱基变化，在PCR反应中又恢复到野生型。除了上述单一碱基变化之外，第二个表达载体pDSY2与pDSY1相同。用pDSY2和带有构巢曲霉amdS基因的pTO90(WO91/17243)或带有米曲霉pyrG基因的pSO2一起对3种不同的米曲霉菌株和几个黑曲霉菌株进行共转化。
在用DSY1和DSY2试验过的所有宿主中都观察到漆酶的表达。产率范围为0.1～12.0Δabs/分钟/ml，在黑曲霉菌株中观察到最高产率。
构建一个pDSY10结构，该结构带有TAKA启动子，漆酶全长cDNA，包括其信号序列及AMG终止子。以lac1为模板对一个200bp的BamHI/AgeI片段进行扩增，该片段在紧邻起始密码子ATG的5′末端处有一个BamHI位点，而在与pDSY1上相同的位置上有一个AgeI位点.以pDSY2为模板对一个Mlu I/Hind III片段进行PCR扩增，从在cDNA上的MluI位点开始，至漆酶终止密码子3′末端处的一个Hind II位点处结束。将上述两个片段与来自pDSY2的AgeI/MluI片段连接在pHD414上，得到pDSY10(图8)。
用于漆酶表达的载体pHD414是质粒p775(EP238023)的衍生物。与所述质粒相反，pHD414在TAKA启动子和AMG终止子之间有一串相同的限制位点。该质粒是这样构建的在终止子的3′末端去掉一段大约200bp长的片段(带有不需要的RE位点)，随后再除去启动子5′末端的一个大约250bp长的片段(也带有不需要的位点)。所述200bp的片段是通过用NarI(作用位点在pUC载体部分)和XbaI(就在终止子的3′末端)裂解而被除去的，随后用克列诺(Klenow)DNA聚合酶+dNTP补充所产生的末端，在凝胶上纯化该载体片段，并重新连接该载体片段。所得质粒被称为pHD413.用StuI(作用位点在启动子的5′末端)和PvuII(作用位点在pUC载体上)裂解pHD413，在凝胶上分级分离，并进行重新连接，得到pHD414。以pToC90为选择质粒，对米曲霉How B104和黑曲霉B0-1进行共转化。在摇瓶培养中的产率与用pDSY2转化时的产率相当。
2、在发酵罐中表达将1ml黑曲霉转化体Bo-1-pDSY10-4孢子悬浮液试样(大约109个孢子/ml)在无菌条件下加入盛有100ml无菌摇瓶培养基(葡萄糖，75g/l；大豆粉，20g/l；MgSO4·7H2O，2g/l；KH2PO4，10g/l；K2SO4，2g/l；CaCl2·2H2O，0.5g/l；柠檬酸，2g/l；酵母提取物，10g/l；微量金属元素〔ZnSO4·7H2O，14.3g/l；CuSO4·5H2O，2.5g/l；NiCl2·6H2O，0.5g/l；FeSO4·7H2O，13.8g/l；MnSO4·H2O，8.5g/l；柠檬酸3.0g/l〕，0.5ml/l；尿素，2g/l；用自来水配制，并在高压灭菌之前把pH调至6.0)的500ml摇瓶中，并在37℃温度下，在一台以200rpm的速度转动的旋转摇床上培养18小时。在无菌条件下把50ml上述培养液转移到一个盛有1.8升发酵培养基(麦芽糖糊精MD01 300g/l；MgSO4·7H2O，2g/l；KH2PO4，2g/l；柠檬酸，2g/l；K2SO4，2.7g/l；CaCl2·2H2O，2g/l；微量金属元素，0.5ml/l；pluronic消泡剂，1ml/l；用自来水配制，并在高压灭菌之前把pH调至6.0)的体积为3升的发酵罐中。通过使冷却水在发酵罐夹套中循环，把发酵罐温度维持在34℃。以1.8升/分钟(1v/v/m)的速度将无菌空气通入发酵罐中。在接种后的前24小时把搅拌速度维持在800rpm，而在其后的发酵时间里以1300rpm的速度搅拌。通过自动添加5N NaOH或H3PO4把发酵的pH维持在4.0。用一台蠕动泵把消毒的进料(尿素50g/l；pluronic消泡剂1.5ml/l；用蒸馏水配制并高压灭菌)加入发酵罐中。发酵期间的供料速度设计如下在接种之前先加入40g进料；接种之后，以2.5g/升小时的恒速供料。
用水或合适的缓冲液把铜配制成400X储液，过滤消毒并在无菌条件下加入罐中，使最终浓度为0.5mM。取出用于进行酶活性测定的样品，并通过米拉布(Miracloth)过滤，以除去菌丝体。通过LACU试验分析这些样品的漆酶活性。结果发现，随着发酵过程的进行，漆酶活性连续升高，190小时之后获得大约55LACU/ml的活性值。这相当于有大约350mg/l的重组漆酶表达。
IV.重组漆酶的提纯材料和方法1、材料用作缓冲液和底物的化合物，是起码为试剂级别的商品化产品。Endo/N-糖苷酶G购自BoehringeR-Mannheim公司。层析是在一个Pharmacia′s FPLC或一个常规的开放柱低压系统上进行。在一台Shimadzu PC160分光光度计上进行分光分析。
2、提纯(a)DSY2按照上述方法用纱布过滤米曲霉pDSY2转化体，得到2.8升滤液(pH7，19mS)。所得滤液在0.45μ的Corning滤器上过滤，并在使用S1Y30膜的Spiral Concentrator(Amicon)上浓缩至200ml体积。将浓缩液调至pH7.5，用4.8升水稀释至1.2mS，并在S1Y30上浓缩至200ml体积。将50ml的上述溶液加注到一个Q-Sepharose柱(XK16，34ml凝胶)上，该柱用10mM Tris(pH7.5，0.7mS)(缓冲液A)预平衡过。在用一种线性梯度的缓冲液B(缓冲液A+0.5M NaCl)洗脱加样期间缓慢地移动的蓝色的漆酶带。将24ml所收集的漆酶部分在Centricon-100(Amicon)上浓缩至4.5ml，并上一个Superdex 200柱(Hiload 16/10，120ml凝胶)。在用缓冲液C(缓冲液A+0.15M NaCl，14.4mS)洗脱时，在蓝色漆酶洗脱物部分之后为棕色混杂部分。只有洗脱带的前半部(通过Abs600检测)表现出较高的漆酶与混杂物之比，收集这部分洗脱液。将所收集的部分在10mM Bis-Tris(pH6.8，0.6mS)(缓冲液D)中透析，上一个用缓冲液D平衡过的Mono-Q柱(Mono-Q5/5，1ml)，并用一种线性梯度的缓冲液E(缓冲液D+0.5M NaCl)进行洗脱。通过SDS-PAGE判断得知，由27％左右的缓冲液E洗脱的漆酶部分是纯的。在每一步都对漆酶部分进行常规ABTS氧化作用、SDS-PAGE和Western印迹检测。
(b)DSY10
用纱布过滤HowB104-pDSY10，得到2.8升滤液(pH7.3，24mS)。用Whatman#2滤纸过滤上述滤液，并在带有S1Y100膜的Spiral Concentrator(Amicon)上浓缩至210ml。用水稀释上述浓缩液，使其达到1.2mS，在S1Y100上浓缩至328ml。将所得液体上Q-Sepharose柱(XK26，120ml凝胶)，该柱用10mMTris(pH7.5，0.7mS)(缓冲液A)预平衡过。用一种线性梯度的缓冲液B(缓冲液A+2M NaCl)洗脱加样期间缓慢移动的蓝色漆酶带。用水稀释所收集的120ml漆酶部分，使其达到1.1mS，并在SIY100上浓缩至294ml，再上一个用缓冲液A预平衡过的Mono-Q柱(Hiload 16/10，40ml凝胶)。在上样和用缓冲液A液脱期间，漆酶缓慢地从柱中通过。将所收集的pH读数为5.6的部分上一个用缓冲液C(10mM MES，pH5.5，0.1mS)预平衡过的Mono-Q柱。漆酶部分被一种梯度很小的缓冲液D(缓冲液C+1M NaCl)所洗脱。按上述方法进行酶促试验。
3、蛋白质分析按上述方法进行全氨基酸分析、N-末端序列分析、脱糖基化分析、SDS-PAGE、IEF和Western印迹分析。
B、结果和讨论1、提纯和特征分析对于DSY10来说，获得了256倍的纯化液和37％的产率，而对于DSY2来说，获得了246倍的纯化液和14％的产率。就电泳特征、光谱特征和活性而言，纯化的DSY2和DSY10没有区别。在凝胶过滤时，纯化的重组漆酶表现为一种双体，而且，其亚单位分子量稍大于野生型漆酶的分子量，这表明在米曲霉中发生的翻译后加工导致在重组体上发生额外的糖基化作用。脱糖基化作用已证实了由额外糖所产生的质量差异(表3)。
表3重组和野生型漆酶的分子量和光谱特征

提纯的酶的光谱在615nm和275nm处有最大光吸收值，275nm的光吸收值与615nm的光吸收值之比为16，这表明，每个亚单位上有一个I型Cu。330nm的光吸收值与615nm的吸光值之比为1.0，接近Rhus vernicefera漆酶的0.75的比值，暗示每个亚单位上存在一个II型和两个III型铜离子。通过氨基酸分析测得的消光系数为1.71/(g*cm)。
3、活性通过丁香醛连氮和ABTS氧化作用测定漆酶活性。每一A275单位表示漆酶的LACU值为83.每一mg单位表示其LACU值为141。图9中示出了所述漆酶的pH曲线。
V、将多孔菌属漆酶用于染发在多种染料前体(在下面列出)上试验Polyporus pinsitus漆酶的染色效果，并与3％H2O2的染色效果进行比较。并进一步试验其在0.1％对苯二胺上的染色效果，与多种改性剂进行比较。
材料染料前体用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％对-苯二胺，pH7.0(pPD).
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％对-甲代苯二胺，pH7.0。
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％氯-对-苯二胺，pH7.0.
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％对-氨基苯酚，pH7.0.
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％邻-氨基苯酚，pH7.0。
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％3，4-二氨基甲苯，pH7.0。
改性剂用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％间苯二胺，pH7.0。
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％2，4-二氨基茴香醚，pH7.0。
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％α-萘酚，pH7.0。
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％氢醌，pH7.0。
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％邻苯二酚，pH7.0。
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％间苯二酚，pH7.0。
用0.1M磷酸钾缓冲液制备的0.1％4-氯代间苯二酚，pH7.0。
当使用改性剂时，将染料前体对苯二胺与上述改性剂中的一种混合使用，使染液中前体的浓度为0.1％，改性剂的浓度也为0.1％。所用的酶是浓度为10LACU/ml的来自P.pinisitus的重组漆酶。
用于该方法中的其它溶液有3％H2O(在最终染液中的浓度)，以及一种市售香波。
在一台Datacoler Textflash 2000(CIE-Lab)上，采用CIE-Lab参数L*(“0”＝黑，“100”＝白)和a*(“-”＝绿，“+”＝红)测定发束的定量化颜色。DL*和Da*分别表示一种样品与未处理过毛发的L*和a*进行比较时的L*和a*的Δ值。在日光灯(D65)下以1000LUX的强度测定耐晒性。
使用一束金黄色欧洲人的头发(1g)。在一台Whirley搅拌器上将4ml染料前体溶液(包括改性剂)与1ml漆酶或1ml H2O2混合，将其涂在上述发束上，并在30℃下保持60分钟。然后用流动水漂洗染过的发束，梳理并风干。
染色作用试验的结果在下面的表4-6以及图10-12中列出。
表4

L*0＝黑100＝白a*-＝绿+＝红表5

L*0＝黑100＝白a*-＝绿+＝红表6

L*0＝黑100＝白a*-＝绿+＝红按上述方法进行氧化染发，所不同的是，使用50LACU/ml的P.pinsitus漆酶.
为了试验耐洗性，将所染过的发束弄湿，并用50μl市售香波洗15秒钟，再用水漂洗1分钟。将该发束洗20遍。
洗发试验的结果如图13所示。由图13可以看出，当使用P.pinsitus漆酶进行氧化染色时，洗涤多达20遍后的头发的耐洗性仍然良好。
为了试验耐晒性，使用欧洲人的金黄色头发作试验材料，对用P.pinsitus漆酶染过的头发与用H2O2染过的头发进行比较.将对苯二胺用作染料前体。按上述方法进行染发。将一个发束放置在黑暗中，而另一个发束放置在日光下(即在日光灯(D65)下，光照强度大约为1000LUX)长达275小时。在染发后马上测定CIE-Lab值，并在暴露于日光期间进一步测定。
试验结果在图14中给出。图14显示，以对苯二胺为染料前体用P.pinsitus漆酶染过的头发与用H2O2染过的头发的耐晒性相同。
生物材料的保藏已按照布达佩斯条约规定，于1994年5月25日将下列生物材料交由Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center(1815 University Street，Peoria，Illinois，61604)保藏，并被赋予下列入藏号。


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序列表<110>诺沃奇梅兹生物技术有限公司诺沃奇梅兹有限公司<120>纯化的多孔菌属漆酶及编码该酶的核酸<130>4185.204-WO<140>PCT/US95/07536<141>1995-06-15<150>US 08/265,534<151>1994-06-24<160>10<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2418<212>DNA<213>Polyporus pinsitus<400>1agatttctga caccggtgca atcttgacac tgtaccaacc gggcaagtct cgtccttggt60tctcggggac tggcgccggt cgctacccct tggtcattca ctctaccaga gcgctggctt120cgccgaggta taaaggatgt tgcgcgacac cctcaacacc ccaactcaag ccccacttga180gcttttgcga gatcctccac ataccactca ctactttcaa gttcttcaac atgtcgaggt240ttcactctct tctcgctttc gtcgttgctt cccttacggc tgtggcccac gctggtatcg300gtcccgtcgc cgacctaacc atcaccaacg cagcggtcag ccccgacggg ttttctcgcc360aggccgtcgt cgtgaacggc ggcacccctg gccctctcat cacgggtaac atggttcgtc420tcggctcgca ctagggggtt gtatcgttcc tgacgttgtt ggagggggat cgcttccagc480tcaatgtcat cgacaacctt accaaccaca cgatggtgaa gagcacgagt attgtgagct540gctatttctc cggacggggc ttcattgtgc taataatcgt cgtgtgcagc actggcacgg600tttcttccag aagggtacca actgggccga cggtcccgcc ttcatcaacc agtgcccgat660ctcatctggt cactcgttcc tgtacgactt ccaggttcct gaccaggctg taagtacggt720cgttatggag tatactgcgc attgctaaac cacatggtga acagggtacc ttctggtatc780acagtcactt gtctacgcag tactgtgatg gtttgagggg tccgttcgtt gtttacgacc840cgaatgaccc ggccgccgac ctgtacgacg tcgacaacgt aaggacgaat tcgaaccgta900aatacttgct tactgatact tctcgatgaa ttaggacgac actgtcatta cccttgtgga960ttggtaccac gtcgccgcga agctgggccc cgcattccct gtaagtccat gagtattctg1020ctgttgaatc tgtcttaact gtgcatatca ctcggcgccg acgccaccct catcaacggt1080
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1.一种DNA结构，它包含选自下组的编码多孔菌属漆酶的核酸序列(a)编码序列6的氨基酸序列的核酸序列；和(b)能够在高严格性条件下与下列序列杂交的核酸序列(i)序列5的核酸序列，或(ii)它们的任一互补链。
2.权利要求1的DNA结构，其中所述核酸序列编码序列6的氨基酸序列。
3.权利要求2的DNA结构，其中所述核酸序列是序列5。
4.权利要求3的DNA结构，其中所述核酸序列包含在含于大肠杆菌NRRL B-21267的质粒pDSY20中。
5.权利要求1的DNA结构，其中所述核酸序列包含在含于大肠杆菌NRRL B-21263的质粒pDSY22中以及含于大肠杆菌NRRL B-21268的质粒pDSY23中。
6.权利要求1的DNA结构，其中所述核酸序列能够在高严格性条件下与序列5的核酸序列或其互补链杂交。
7.权利要求1的DNA结构，其中所述核酸序列编码得自Polyporuspinsitus的漆酶。
8.一种重组载体，它包含权利要求1的DNA结构。
9.一种重组宿主细胞，它包含权利要求1的核酸结构。
10.权利要求9的细胞，其中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。
11.权利要求10的细胞，其中所述丝状真菌细胞是曲霉属细胞。
12.权利要求10的细胞，其中所述丝状真菌细胞是镰孢属细胞。
13.一种生产漆酶的方法，它包括(a)在适合漆酶表达的条件下，培养一种包含权利要求1的结构的宿主细胞；和(b)回收所述漆酶。
全文摘要
本发明涉及带有一段编码多孔菌属(Plyporus)漆酶序列的分离的核酸，以及所编码的漆酶蛋白。
文档编号D21C5/00GK1782082SQ20051011419
公开日2006年6月7日 申请日期1995年6月15日 优先权日1994年6月24日
发明者D·S·亚夫尔, F·许, H·达尔伯吉, P·施耐德, D·A·阿斯林格 申请人:诺沃奇梅兹生物技术有限公司, 诺沃奇梅兹有限公司