通过检测游离核酸诊断结核病的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及一种通过检测游离核酸诊断结核病的试剂盒及其 应用。
【背景技术】
[0002] 结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病，每年有200万人死于结核病，其死亡 率在传染性疾病中仅低于艾滋病排第二。早期快速诊断是控制结核病疫情的重要环节，但 目前结核病的临床诊断面临很多问题。
[0003] 细菌学检查是诊断结核病的金标准，但是痰培养敏感性只有50%左右，且只有在 患者排菌期才能检测到。同时，细菌学培养一般都在1个月后才能出结果，所以存在敏感性 低、诊断周期长等缺点。而影像学检查作为另一项临床常规检查是发现和诊断结核病的重 要方式。但影像学结果受主观性因素影响比较大，不同医生、不同医院诊断结果差异较大， 因此在诊断特异性上存在不足。而另一项临床常用的γ-干扰素释放实验只能说明受检者 是否感染过结核分枝杆菌，无法区分活动性结核病患者及潜伏感染者，因此也不能作为诊 断结核病的确诊依据。
[0004] 近年来分子生物学技术发展迅速，TB-PCR、GeneXpert等技术为结核病的快速诊断 提供了新途径。但这些方法仅限于痰标本、新鲜组织、脑脊液等标本，很难应用于血液标本。 其主要原因结核分枝杆菌主要分布在发病病灶中，除了血行播散等极特殊情况，一般很少 出现在血液中。另外，结核性胸腔积液标本中结核分枝杆菌荷菌量通常很低，不仅培养阳性 率很低（5-10% )，常用分子检测技术的阳性率也不理想（30-40% )。
[0005] 因此，结核病诊断急需一种能更加准确、快速、方便的新技术方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种通过检测游离核酸诊断结核病的产品及其应用。
[0007] 所述游离核酸为人体体液中游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段。
[0008] 本发明所提供的应用具体为：用于检测体液的游离核酸中是否含有结核分枝杆菌 特异基因的物质在制备诊断或辅助诊断结核病的试剂盒中的应用。
[0009] 在所述应用中，所述用于检测体液的游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因 的物质，包括：（1)从体液中提取游离核酸的物质；（2)检测游离核酸中是否含有结核分枝 杆菌特异基因的物质。
[0010] 本发明所提供的用于诊断或辅助诊断结核病的产品，含有用于检测体液的游离核 酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物质。
[0011] 进一步，所述用于检测体液的游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物 质，包括：（1)从体液中提取游离核酸的物质；（2)检测游离核酸中是否含有结核分枝杆菌 特异基因的物质。
[0012] 根据需要，所述产品还可包含数据处理装置；所述数据处理装置内设模块；所述 模块具有如下功能：根据所述游离核酸中是否含有所述结核分枝杆菌特异基因的检测结果 确定待测者是否为结核病患者，若所述待测者的体液中的游离核酸中含有所述结核分枝杆 菌特异基因，则所述待测者为或候选为结核病患者，若所述待测者的体液中的游离核酸中 不含有所述结核分枝杆菌特异基因，则所述待测者不为或候选不为结核病患者。
[0013] 在上述应用和产品中，所述从体液中提取游离核酸的物质可为游离核酸提取试剂 盒。在本发明的一个实施例中，所述从体液中提取游离核酸的物质具体为Qiagen公司货号 为55114的游离核酸提取试剂盒和QIAvac24Plus仪器。
[0014] 在上述应用和产品中，所述检测游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物 质可为用于检测结核分枝杆菌的PCR试剂盒。
[0015] 其中，所述结核分枝杆菌特异基因具体可为结核分枝杆菌的IS6110基因（核苷 酸序列如序列表中序列1。相应的，所述检测游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因 的物质可为用于扩增所述结核分枝杆菌的IS6110基因的引物对。在本发明的一个实施例 中，所述检测游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物质具体为中山大学达安基 因股份有限公司的货号为DA-B052的用于检测结核分枝杆菌的IS6110基因的PCR试剂 盒；产品名称是《结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）》，食药局注册号：国械注准 20153400357。
[0016] 在本发明的一个实施例中，所述体液具体为血液或胸腔积液。
[0017] 本发明开发了一种通过检测血液、胸腔积液等临床常见液体标本中结核分枝杆菌 游离核酸成分进行结核病快速诊断的新产品。由于游离核酸不需要收集结核分枝杆菌活菌 或完整菌体，因此相比其他的核酸检测方法具有更好的安全性和敏感性。同时该产品可以 在3小时内给出结果，具有快速、简便等特点。
【具体实施方式】
[0018] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0019] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0020] 实施例1、利用体液游离核酸检测结核分枝杆菌感染
[0021] -、利用血液游离核酸检测结核分枝杆菌感染
[0022] 本实验以25例结核病患者、20例其他疾病（16例肺癌、4例排除结核病的其他感 染性肺部疾病）患者及10例健康人的外周血为样本，分别提取全血DNA和血液游离核酸， 通过检测其中是否含有结核分枝杆菌特异基因来验证两种方法对结核病的诊断准确性。其 中，供试的结核病患者为临床上经过临床症状、影像学、细菌学检查及抗结核试验性治疗有 效等方法确诊为结核病的患者，20例其他疾病患者以及10例健康人也是经过临床证实的。 供试人群为自愿同意。
[0023] 1、血液游离核苷酸的提取
[0024] 用EDTA抗凝采血管采集4ml全血，3500rpm离心10分钟，分离上清用于游离核酸 提取。游离核酸提取试剂盒为Qiagen公司产品，货号为55114,按照说明书进行操作。具体 流程如下：
[0025] (1)将2ml待提取样品移入15ml离心管，加入200μ1蛋白酶K，加入1.6mlACL 缓冲液（含1μgcarrierRNA)。涡旋振荡30s后，在60°C水浴孵育30min。
[0026] (2)加入3. 6mlACB缓冲液，涡旋振荡30s后，在冰上放置5min。
[0027](3)将DNA纯化柱固定在QIAvac24Plus仪器上（Qiagen公司产品），将步骤（2) 中所有液体转移至纯化柱上。
[0028] (4)打开QIAvac24Plus仪将液体全部抽干后，加入600μ1ACW1缓冲液。抽干后 再加入750μ1ACW2缓冲液。再次抽干后加入750μ1无水乙醇抽干。
[0029] (5)将纯化柱转移至新的收集管上，14000rpm离心3min去流出液。在56°C金属浴 孵育10分钟。
[0030] (6)加入50μ1AVE缓冲液，在室温放置3min后，14000rpm离心lmin，收集流出液 为纯化好的游离核酸。置于_20°C保存。
[0031] 2、全血DNA的提取
[0032] 全血DNA提取试剂盒为Qiagen公司产品，其货号为51183,按照说明书进行操作。 具体流程如下：
[0033] (1)用EDTA抗凝管抽取2ml血液，并移至15ml离心管。
[0034] (2)加入200μ1蛋白酶K，加入2. 4mlAL缓冲液，颠倒混匀15次后涡旋振荡lmin。
[0035] (3) 70°C水浴中孵育lOmin，加入2ml无水乙醇，颠倒混匀10次后涡旋振荡lmin。
[0036] (4)将所有液体转移至DNA离心柱上，3000rpm离心3min去除流出液。
[0037] (5)加入2mlAW1缓冲液，5000rpm离心lmin，弃流出液。加入2mlAW2缓冲液， 5000rpm离心15min，弃流出液。
[0038] (6)将离心柱转移至新15ml离心管，加入150μ1AE缓冲液，室温孵育5min， 5000rpm离心2min，收集流出液为全血DNA。置于-20°C保存。
[0039] 3、荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌特异基因序列<