br>[0040] 以步骤1和2提取的血液游离核酸和全血DNA分别为待测样品，利用中山大学达 安基因股份有限公司的货号为DA-B052的针对结核分枝杆菌的IS6110基因（核苷酸序列 如序列表中序列1所示）的试剂盒（产品名称是《结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧 光法）》，食药局注册号：国械注准20153400357)进行检测。按照说明书进行操作。具体流 程如下：
[0041] (1)按比例（TB-PCR反应液40μ1/例+Taq酶3μ1/例）配置PCR反应液，混匀后 按43μ1/管分装至PCR管中。加入2μ1待测核酸样品。每次实验加阴性、阳性对照，阴性 对照是水，阳性对照是含有IS6110序列的质粒。阴性和阳性对照品均为试剂盒自带产品。
[0042]⑵荧光定量PCR反应条件为：93°C3min，（93°C45sec、55°C6〇sec)X10 循环， (93°C30sec、55°C45sec)X30 循环，荧光采集点在 55°C45sec〇
[0043] ⑶按照如下判定结果：如果扩增曲线不呈S型或Ct多30,判定结果为阴性，即从 待测核酸样本中未检出结核分枝杆菌的IS6110基因。如果扩增曲线为S型且Ct〈30则判 定阳性，即从待测核酸样本中检出结核分枝杆菌的IS6110基因。
[0044] 4、结果
[0045] 结果显示：所有全血DNA样本中（25例结核病、20例其他疾病、10例健康人）均未 能检测到结核分枝杆菌的IS6110基因。在血液游离核酸样本的检测中，25例结核病患者中 有13例检测出结核分枝杆菌的IS6110基因；20例其他疾病患者中2例检测出结核分枝杆 菌的IS6110基因；10例健康人中未检测出结核分枝杆菌的IS6110基因。从这个结果可以 看出，血液游离核酸中检测结核分枝杆菌特异基因阳性率显著高于在全血DNA中的检测阳 性率。
[0046] 二、利用胸腔积液游离核酸检测结核分枝杆菌感染
[0047] 由于结核性胸膜炎是最常见的肺外结核类型之一，但无论是细菌学还是分子生物 学检测阳性率都非常低。有报道称细菌学阳性率不足10% ;今年新发展出来的GeneXpert 分子检测阳性率仅在30%左右。为此，本发明的发明人收集了 56例结核性胸膜炎患者的胸 腔积液及32例其他疾病（30例肺癌、1例胸膜间皮瘤、1例肺血吸虫病）患者的胸腔积液比 较通过游离核酸进行检测的方法与GeneXpert方法的准确性。其中，供试的结核性胸膜炎 患者为临床上经过临床症状、细菌学、生化指标及抗结核试验性治疗有效等方法确诊为结 核性胸膜炎患者的患者，32例其他疾病患者也是经过临床证实的。供试人群为自愿同意。
[0048]1、胸腔积液游离核苷酸的提取
[0049] 胸腔积液直接引流到15ml无菌离心管，3500rpm离心10分钟，取上清用于游离核 酸提取。游离核酸提取试剂盒为Qiagen公司产品，其货号为55114,按照说明书进行操作。 具体流程参见步骤一 1。
[0050] 2、荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌特异基因序列
[0051] 以步骤1提取的胸腔积液游离核酸为待测样品，利用中山大学达安基因股份有限 公司的货号为DA-B052的针对结核分枝杆菌的IS6110基因（核苷酸序列如序列表中序列 1所示）的试剂盒（产品名称是《结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）》，食药局注 册号：国械注准20153400357)进行检测。按照说明书进行操作。具体流程参见步骤一 3。
[0052] 3、GeneXpert检测胸腔积液结核分枝杆菌特异基因序列
[0053] 该检测采用Cepheid公司的Xpert MTB/RIF检测试剂盒（货号为GXMTB/ RIF-CN-10)及GeneXpert仪器。按照说明书进行操作。具体流程如下：
[0054] (1)取2ml新鲜胸腔积液样品至15ml离心管，直接加入4ml裂解液，涡旋振荡 lmin，室温放置15min。取2ml上清至Xpert反应器中，并放入GeneXpert仪器槽中运行仪 器。
[0055] (2)反应结束后，直接记录仪器报出结果。
[0056] 4、结果
[0057] 结果显示，GeneXpert方法的灵敏度为44. 6% (25例阳性/56例），特异性为100% (32例阴性/32例）。相比之下，胸腔积液游离核酸的PCR检测方法灵敏度为82. 1 % (46例 阳性/56例），特异性为93. 8% (30例阴性/32例）。其中，供试样本的胸腔积液游离核酸 检测方法的检测结果如表1所示，GeneXpert方法的检测结果如表2所示。从这个结果可以 看出，胸腔积液游离核酸检测结核分枝杆菌特异基因灵敏度显著高于GeneXpert(P〈0. 05)， 且显示出良好的特异性。
[0058] 表1利用胸腔积液游离核酸样本辅助诊断结核性胸膜炎的情况
[0059]
[0060] 表2利用GeneXpert方法辅助诊断结核性胸膜炎的情况
[0063] 其中，灵敏度、特异性是按照如下方法计算得到的：
[0064]
[0065] 灵敏度=一种方法检测的真阳性（A)/实际阳性（G);
[0066] 特异性=一种方法检测的真阴性（D)/实际阴性（H)。
【主权项】
1. 用于检测体液的游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物质在制备诊断或 辅助诊断结核病的试剂盒中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测体液的游离核酸中是否含 有结核分枝杆菌特异基因的物质，包括： (1) 从体液中提取游离核酸的物质； (2) 检测游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物质。3.-种用于诊断或辅助诊断结核病的产品，含有用于检测体液的游离核酸中是否含有 结核分枝杆菌特异基因的物质。4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述用于检测体液的游离核酸中是否含 有结核分枝杆菌特异基因的物质，包括： (1) 从体液中提取游离核酸的物质； (2) 检测游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物质。5.根据权利要求3或4所述的产品，其特征在于：所述产品还包含数据处理装置；所述 数据处理装置内设模块；所述模块具有如下功能：根据所述游离核酸中是否含有所述结核 分枝杆菌特异基因的检测结果确定待测者是否为结核病患者，若所述待测者的体液中的游 离核酸中含有所述结核分枝杆菌特异基因，则所述待测者为或候选为结核病患者，若所述 待测者的体液中的游离核酸中不含有所述结核分枝杆菌特异基因，则所述待测者不为或候 选不为结核病患者。6. 根据权利要求1-5中任一所述的应用或产品，其特征在于：所述从体液中提取游离 核酸的物质为游离核酸提取试剂盒。7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或产品，其特征在于：所述检测游离核酸中是 否含有结核分枝杆菌特异基因的物质为用于检测结核分枝杆菌的PCR试剂盒。8. 根据权利要求1-7中任一所述的应用或产品，其特征在于：所述结核分枝杆菌特异 基因为结核分枝杆菌的IS6110基因。9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或产品，其特征在于：所述体液为血液或胸腔 积液。
【专利摘要】本发明公开了一种通过检测游离核酸诊断结核病的试剂盒及其应用。本发明所提供的应用具体为用于检测体液的游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物质在制备诊断或辅助诊断结核病的试剂盒中的应用；其中所述用于检测体液的游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物质，包括：(1)从体液中提取游离核酸的物质；(2)检测游离核酸中是否含有结核分枝杆菌特异基因的物质。本发明是通过检测游离核酸诊断结核病，由于游离核酸不需要收集结核分枝杆菌活菌或完整菌体，因此相比其他的核酸检测方法具有更好的安全性和敏感性。同时该产品可以在3小时内给出结果，具有快速、简便等特点。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105296661
【申请号】CN201510870799
【发明人】车南颖, 杨新婷, 张海青
【申请人】北京市结核病胸部肿瘤研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月2日