用于核酸测序的方法和试剂盒的制作方法
【专利说明】用于核酸测序的方法和试剂盒
[0001] 相关申请
[0002] 本发明要求于2012年8月6日提交的美国临时申请系列号61/680, 212的优先权， 其通过引用完全结合在本文中。 发明领域
[0003] 本发明涉及用于测序单一核酸（基因组DNA，RNA，CDNA等）分子和其他分子的分 子生物学方法和传感器设计、制造和应用，例如，以允许高度平行的、高通量的单一分子和 长读取长度的DNA测序和片段长度分析。
[0004] 发明背景
[0005] DNA(脱氧核糖核酸）通常是由称为核苷酸的亚基组成的长的聚合物。这些单个 亚基的链形成称为核酸的分子，其中DNA和RNA(核糖核酸）是目前自然中最常见的实例。 天然的脱氧核糖核酸由沿着核糖/磷酸骨架的四个碱基（腺嘌呤（A)，胞嘧啶（C)，鸟嘌呤 (G)和胸腺嘧啶（T))中的一种构成。在天然存在的核糖核苷酸群体中，胸苷被替换为尿嘧 啶（U)。当通过在核糖骨架的5'和3'位置形成磷酸二酯键聚合时，核酸可以携带细胞中的 遗传信息。核酸中的碱基能够与另一个碱基形成氢键，促使稳定的双链分子的形成，在DNA 的情形中，其每一半是另一半的反向互补物。DNA包含两个含有四种不同核苷酸碱基的长的 核苷酸链（例如，AGTCATCGT...等），具有的糖和磷酸基团的骨架通过酯键连接，扭曲成双 螺旋并且通过互补核苷酸之间的氢键连接（A通过氢键结合相反的链中的T，C和相反链中 的G氢键结合）。沿着骨架的核苷酸碱基的序列可以携带丰富量的信息，并且可以包含巨大 部分的遗传信息，如个体遗传特征。
[0006] 分子生物学的中心法则通常是如下述描述生物学信息的正常流转：DNA可以复制 成DNA，DNA中的遗传信息可以'转录'成RNA，如信使RNA ( "mRNA"），并且可以由mRNA中的 信息翻译成蛋白。在翻译过程中，使得蛋白亚基（氨基酸）以mRNA的序列并且最终以其所 转录的DNA所示的顺序足够接近以键合。这一过程涉及称为tRNA( "转运RNA"）的氨基酸 适体RNA的碱基配对，在核糖体的存在，每个tRNA携带由其针对mRNA序列的序列决定的特 定的氨基酸，核糖体本身是在rRNA( "核糖体RNA"）周围构建的蛋白复合物。通过这一过 程，遗传DNA序列利用mRNA中间物和tRNA与rRNA组分指定了要组装成多肽的氨基酸的序 列。
[0007] 术语核酸测序通常包括用于确定DNA或RNA分子中的核苷酸碱基（即，腺嘌呤、鸟 嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶）的顺序的生物化学方法。DNA的序列组成细胞核、线粒体和叶绿 体中的遗传性遗传信息，其形成活生物体的发育程序的基础。遗传变异可能引起疾病，赋予 增加的疾病的危险或赋予有益的特性。这些变异可能是遗传的（传承自父母）或获得性的 (成年时发育，如通过DNA复制中的错误发展）。因此，知晓这些遗传分子的序列对于获得 对生命、分子系统和疾病的更好的理解是特别重要的。
[0008] DNA分析最初被广泛誉为DNA谱分析（DNA指纹），并且在1987年成为商业可用的， 那时化学公司Imperial Chemical Industries(ICI)在英格兰开设了血液检测中心。该技 术最先由英格兰莱斯特大学的Sir Alec Jeffreys报道，现在成为数个国立DNA数据库的 基础，包括美国的CODIS组。该技术利用称为变数串联重复序列（variable number tandem r印eats，VNTRs)的高度可变的重复（"重复"）序列，特别是短的串联重复（short tandem r印eats，STRs)。VNTR基因座在血缘密切的人之间是非常相似的，但是如此可变，以致没有 血缘关系的个体极不可能具有相同的VNTRs。扩增和随后的扩增子的片段长度分析提供了 关于个体的身份或血缘关系的有力的遗传信息。
[0009] DNA测序的出现已经显著加快了生物学研宄和发现，并且将DNA测试的应用从简 单的概图扩展到疾病诊断，甚至是疾病预测。利用现代DNA测序技术可获得的快速的测序 速度已经成为人类基因组计划中的大规模测序人类基因组的手段。相关计划已经产生了多 种动物、植物、病毒和微生物基因组的完整的DNA序列。
[0010] RNA测序从技术原因上来讲比DNA测序容易操作，其是最早的核苷酸测序形式之 一。溯及重组DNA之前的时代，RNA测序的主要里程碑是第一个完整的基因的序列，然后是 噬菌体MS2的完整的基因组，其由根特大学（比利时根特）的Walter Fiers与其同事在 1972-1976年鉴定并且公布。
[0011] 由Frederick Sanger与其同事在1975年开发的链终止方法是第一个大规模应用 的DNA测序方法。在二十世纪七十年代早期由英格兰的Sanger和哈佛的Walter Gilbert 与Allan Maxam开发快速DNA测序法之前，使用多种费力的方法，如由Gilbert和Maxam于 1973年提出的摇摆点分析（wandering-spot analysis)，其报道了 24个碱基对的测序。
[0012] 在1976-1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert基于DNA的化学修饰和后续在 特定碱基的切割开发了一种DNA测序法。该方法需要在DNA链的一个末端进行放射性或荧 光标记以及纯化要测序的DNA片段。在四个核苷酸碱基中的一个处、有时在两个处产生不 常见的断点，并且这在四个反应中重复（G，A+G，C，C+T)。这产生一系列标记的片段，在每个 分子中从放射性标记的末端到第一个'切割'位点，并且通过凝胶电泳按尺寸分离，其中四 种反应并排排列。Maxam-Gilbert测序由于其技术复杂性、有害化学品的广泛应用和规模放 大的困难而不容易采用。另外，该方法不能容易地定制在标准分子生物学试剂盒中进行应 用。
[0013] 链终止或Sanger法需要单链DNA模板、DNA引物、DNA聚合酶、放射性或荧光标记 的核苷酸，和修饰的核苷酸，即终止DNA链延长的双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTPs)。将DNA 样品分到四个独立的测序反应中，每个反应含有四种标准脱氧核苷酸（dATP，dGTP，dCTP 和dTTP)和DNA聚合酶。向这四种独立的测序反应的每一个中仅加入四种双脱氧核苷酸 (ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP)中的一种。这些双脱氧核苷酸是链终止核苷酸，其缺少在 DNA链延伸过程中在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键所需要的3' -OH核糖基集团。因此， 在新生的（延长的）DNA链中掺加双脱氧核苷酸终止DNA链延伸，产生多个不同长度的DNA 片段，这些片段中的每一个在双脱氧核苷酸的结合位点终止。由此，如果已知双脱氧核苷酸 的性质，则所产生的片段的长度将表示该双脱氧碱基在序列中的位置。双脱氧核苷酸以比 标准脱氧核苷酸低的浓度加入，以允许足够序列分析的链延长。
[0014] 新合成和标记的DNA片段进行热变性并在变性聚丙烯酰胺尿素凝胶上通过凝胶 电泳进行大小（具有仅一个核苷酸的分辨率）分离。四种DNA合成反应中的每一个在四个 单独的泳道（泳道A，T，G，C)中的一个泳道中运行；然后，通过放射自显影或紫外光显现 DNA条带，且DNA序列可在X射线胶片或凝胶图像直接读出。将X射线胶片暴露于凝胶，并 且当显色时，深色条带对应于不同长度的DNA片段。泳道中的深色条带表示双脱氧核苷酸 (ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)掺入之后链终止产生的DNA片段。末端核苷酸碱基可根据 在产生该条带的反应中添加了何种双脱氧核苷酸进行鉴定。然后四个泳道中不同条带的相 对位置用于读取（从底部至顶部）所示的DNA序列。
[0015] DNA片段可通过使用引物上的放射性标记物或荧光标记物，在新的DNA链中，用标 记的dNTP或用标记的ddNTP进行标记。链终止测序存在一些技术变通。在一个方法中，DNA 片段用含有用于放射性标记的放射性磷的核苷酸进行标记。备选地，在5'端用荧光染料 标记的引物用于标记。仍然需要四个单独的反应，但是具有染料标记物的DNA片段可使用 光学系统读出，有助于更快和更经济的分析和自动化。这种方法被称为'染料-引物测序'。 由L Hood和同事后来开发的荧光标记的ddNTP和引物开创了自动化、高通量DNA测序的阶 段。
[0016] 不同的链终止方法大大简化了 DNA测序所需的工作量和计划。例如，来自USB Biochemicals (USB生化药剂）的基于链终止的"测序酶（Sequenase) "试剂盒包含测序所 需的大多数试剂，这些试剂是事先等分的且随时可用的。用Sanger方法可出现一些测序问 题，诸如引物与DNA的非特异性结合，影响DNA序列的准确读出。此外，DNA模板内的二级结 构，或污染在DNA模板的随机引发（priming)的RNA也可能影响所获得序列的保真性。其 它影响反应的污染物可由外来DNA或DNA聚合酶抑制剂组成。
[0017] 引物标记的替代是标记链终止子，其是通常被称作'染料-终止子测序'的方法。 这种方法的一个主要优势是可在单个反应中进行测序，而不是如在标记引物方法中的四个 反应中进行测序。在染料终止子测序中，四种双脱氧核苷酸链终止子的每种用不同的荧光 染料进行标记，每种荧光染料在不同的波长发荧光。这种方法有吸引力，因为它具有更大的 方便和速度，并且其是目前用计算机控制的序列分析仪（见下文）的自动化测序中的主要 方法。其潜在的限制包括由于染料标记的链终止子引入至DNA片段的不同而引起的染料效 应，其导致毛细管电泳后电子DNA序列示踪色谱中的不等的峰高和形状。
[0018] 在常规临床中，核苷酸聚合物（DNA和RNA)的分析已经变得重要起来。然而，成本 和复杂性仍然是广泛全面采用的主要障碍。对此的一个原因是分析的复杂性，所述分析需 要能够随着实验进行灵敏地测量至多四种不同的荧光通道的昂贵的装置。其他原因包括 高的试剂成本，长久和复杂的样品制备步骤和熟练的生物信息学家所具有的广博的计算能 力，以将得到的短的读取序列组装成临床相关的构建体。较便宜的备选方案可能需要熟练 的技术人员来运行和解释低等技术设备，如电泳，但是这也可能是昂贵的，并且不能产生足 够的DNA数据用于高通量全基因组测序应用。
[0019] 发明概述
[0020] 按照本发明的实施方案，公开了测序多种多核苷酸分子的新方法。在一些实施方 案中，所述方法可以用于解决复杂性、成本、时间和需要长读取长度和高通量DNA测序的问 题。联系本公开内容应用的多个实施方案旨在使用新型的测序技术在成本有效的装置中进 行长读取长度、高度平行的、单分子DNA测序。在一些技术实施方案中，本发明可以用于分 析DNA片段的长度。
[0021] 一些实施方案包括用于测序或分析多核苷酸分子的长度的装置。在一些方面中， 所述装置包括具有nm范围内尺寸的纳米通道。在一些方面中，实施方案记述具有小于 3 ym的宽度和小于IOOnm的高度的通道。在一些实施方案中，所述通道直径小于50nm。在 其他实施方案中，所述通道的直径小于5nm ;并且纳米结构传感器阵列与所述纳米通道垂 直或平行排列，其在所述纳米通道内具有灵敏的测定区域，以致由多核酸分子的通过片段 (passing fragment)或单个碱基产生扰动。在一些实施方案中，每个碱基通过所述纳米结 构传感器时直接导致所述传感器产生的特异性的信号，或通过置换经由所述灵敏的测定区 域的多核酸的离子而导致所述传感器产生的特异性的信号，此时每个碱基将提供独特的电 子特征。在一些方面中，所述纳米结构传感器检测电荷。在一些方面中，所述纳米结构检测 高电荷结构部分。在一些方面中，所述高电荷结构部分是图7A-G或图8的结构部分。在一 些方面中，所述纳米结构传感器检测缓冲液电位。在一些方面中，所述纳米结构传感器检测 荧光。在一些方面中，所述纳