一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸提取技术，特别涉及一种磁珠法提取游离核酸的方法及其试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 1948年Mandel和Metais首次报道游离核酸至今，游离核酸研究已有近70年历 史，但因当时核酸是否是遗传物质而没有引起人们的广泛关注。1970年，欧洲学者首次报道 肿瘤病人的血浆或血浆中存在游离DNA，其含量为健康人群的10倍左右，其为双链DNA分 子，长度基本在500bp以下，大部分以核小体形式存在。大量研究证明，游离DNA与肿瘤基因 组DNA具有相同的遗传变异，例如，基因突变、基因启动子甲基化等，因此，游离核酸可被用 于一种预测肿瘤发生的新型标记物。1997年，Lo等首次证明孕妇外周血存在胎儿游离DNA， 为非创伤产前诊断开辟了一条新途径。存在于血浆或血清中来源于肿瘤细胞的游离DNA主 要来源于：肿瘤细胞的凋亡、坏死释放到血液中和肿瘤细胞的转移、增殖释放到血液中。
[0003] 近年来，游离DNA研究成为基因组分子诊断研究的一个热门领域，首先其可作为 一种无创诊断方法，可以随时采集患者样本进行相关检测分析。其次，其可作为一类新型生 物标志物，因其具有与肿瘤细胞基因组相同的遗传变异，具有显著的特异性，可以对肿瘤进 行分型及早期筛查。因此，循环游离DNA的检测在临床诊断上具有非常重要的应用价值，如 癌症早期筛查、肿瘤复发、疗效监控等。游离DNA研究的主要障碍为：游离DNA的分离纯化 和高灵敏度检测。因游离DNA在血液中的含量低，且片段长度短，为游离DNA研究带来比较 大的困难。
[0004] 目前核酸提取方法主要有酚氯仿抽提、离心柱法和磁珠法。酚氯仿抽提因大量使 用有毒溶剂，对操作者毒性较大，且难于实现自动化操作。离心柱法因其游离核酸提取效率 低、成本高，且需要高速离心机，也难于实现自动化，均不能广泛适用于大规模的临床检测。 近年发展起来的磁珠法提取核酸技术，其采用超顺磁性纳米颗粒，利用在高盐低pH下吸附 核酸，然后在低盐高pH下分离核酸的原理进行样本核酸的分离纯化，因其只需要在磁场作 用下就能将核酸分离纯化出来，故其能实现高通量自动化标准化操作。而目前市场上的基 于磁珠法的商品化试剂操作过于复杂，并且需要一定温度下使用蛋白酶K及carrierRNA 进行孵育，同时需要多步洗涤等步骤，导致其自动化程度偏低，核酸提取的重复性差及提取 效率低；而且提取的样本量基本在0. 1-1. 2ml，难于满足一些循环肿瘤DNA研究应用。
[0005] 专利申请号为201410292018. 3的发明专利公开了一种外周血胎儿游离DNA提取 方法，包括以下步骤：1)取2~10ml孕妇外周血，3~6°C1600g离心8-12min，将上清液 于3~6°C16000g离心8-12min后再取上清液；2)取步骤1)中经16000g离心得到的上清 液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，55~62°C孵育30min;3)把步骤2)得到 的样品在冰上冷却，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心4-6min;4)转移步 骤3)上清液与0. 8倍体积磁珠混悬液混合，室温孵育lOmin;5)将步骤4)得到样品置于磁 力架上静置吸附后，吸取上清；6)将步骤5)得到的上清与1. 5倍体积磁珠混悬液室温孵育 lOmin，置于磁力架上静置吸附后，弃掉上清液，用75%酒精洗涤2次，即得磁珠-目的DNA复合体；7)采用DNA洗脱液，将步骤6)获得的磁珠-目的DNA复合体在DNA洗脱液中旋涡 振荡，置于磁力架上静置，吸取上清液，得到目的DNA。
[0006] 上述专利公开的游离DNA提取方法仍存在操作复杂、重复性差、提取效率低以及 提取的样本量少的问题。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种提取效率高、操作简便且适用于大样本 量的磁珠法提取游离核酸的方法，进一步针对上述方法提供一种磁珠法提取游离核酸的试 剂盒。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0009] -种磁珠法提取游离核酸的方法，于0. 2-5ml样本中加入0. 3-7. 5ml裂解结合液 和20-40ul磁性纳米颗粒，混合10-20min后进行第一次磁分离处理，2-5min后弃去第一次 磁分离处理后的上清液，然后加入0. 5-lml洗涤液，混合后进行第二次磁分离处理，2-5min 后弃去第二次磁分离处理后的上清液，然后加入40-100ul洗脱液，混合后静置5-10min，所 述静置的温度为20-65Γ，然后进行第三次磁分离处理，l_2min后取第三次磁分离处理后 的上清液，即获得所述游离核酸；
[0010] 所述裂解结合液包括0. 5-6M的A试剂、0. 5-10 %体积浓度的B试剂、10-50 %体积 浓度的C试剂混合制得，所述A试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一 种，所述B试剂为tween20、triton-ΧΙΟΟ、SDS和NP40中的至少一种，所述C试剂为异丙醇 和无水乙醇中的至少一种，所述裂解结合液的pH值为5-7 ;
[0011] 所述洗涤液包括〇. 5-3M的D试剂和10-70 %体积浓度的E试剂混合制得，所述D 试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍和高氯酸钠中的至少一种，所述E试剂为异丙醇和无水乙醇中 的至少一种，所述洗涤液的pH值为5-7。
[0012] 本发明还公开一种磁珠法提取游离核酸的试剂盒，包括裂解结合液、磁性纳米颗 粒、洗涤液和洗脱液；
[0013] 所述裂解结合液包括0. 5-6M的A试剂、0. 5-10 %体积浓度的B试剂、10-50 %体积 浓度的C试剂混合制得，所述A试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠和高氯酸钠中的至少一 种，所述B试剂为tween20、triton-ΧΙΟΟ、SDS和NP40中的至少一种，所述C试剂为异丙醇 和无水乙醇中的至少一种，所述裂解结合液的pH值为5-7 ;
[0014] 所述洗涤液包括0. 5-3M的D试剂和10-70 %体积浓度的E试剂混合制得，所述D 试剂为异硫氰酸胍、盐酸胍和高氯酸钠中的至少一种，所述E试剂为异丙醇和无水乙醇中 的至少一种，所述洗涤液的pH值为5-7。本发明的有益效果在于：
[0015] (1)采用磁珠法，通过裂解结合液、洗涤液和洗脱液，并结合三次磁分离处理的提 取方法的设计，具体的，A试剂、B试剂、C试剂分别具有裂解、变性和促进核酸结合的作用， 包含A试剂、B试剂、C试剂的裂解结合液通过三者的协同配合作用，从而获得优良的裂解、 变性和促进核酸结合的作用；裂解结合液和洗涤液的pH值为5-7,即通过高盐低pH分离核 酸，再通过低盐高pH的洗脱液洗脱核酸，通过优化改进裂解结合液，得到最佳的配方，能在 不使用蛋白酶K及carrierRNA的情况下进行常温提取低浓度游离核酸，且能在常温下进 行提取，无需任何高温孵育，具有操作简便、提高提取效率和提取纯度的优点；同时结合一 种洗涤液，只进行一次洗涤过程得到高纯度的核酸，最后的洗脱也可以在常温下进行洗脱； 具有提取操作简单方便且省时的优点。
[0016] (2)由于游离核酸浓度低，其中的游离肿瘤核酸浓度更低，裂解结合液、洗涤液和 洗脱液的配方设计使得大样本量提取试剂能富集更多的核酸以用于相关检测，本发明的磁 珠法提取游离核酸的方法，可以增大样本量至〇.2-5ml，相应的裂解结合液按比例增大至 0. 3-7. 5ml，磁性纳米颗粒的用量增大至20-40ul，具有大幅度提高样本量的优点，可满足大 样本量提取的需求；同时，对于低浓度样本具有非常明显的富集作用；
[0017] (3)可减少提取的时间，整个提取过程时间在半小时以内，快速方便，易于全自动 化、标准化操作；
[0018] (4)适用于短片段的核酸的提取，能高效用于低至100bp游离核酸片段的分离纯 化；同时，分离纯化的游离核酸可直接应用于下游的各类分子生物学检测，尤其能应用临床 分子诊断；
[0019] (5)本发明的磁珠法提取游离核酸的方法可以同时适用于无细胞样本和细胞样本 的游离核酸的提取。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明磁珠法提取游离核酸的方法与采用进口Q公司磁珠法提取方法提取 获得的核酸的对比检测示意图；
[0021] 图2为本发明磁珠法提取游离核酸的方法用于不同样本量的提取时获得的核酸 的检测不意图；
[0022] 图3为本发明磁珠法提取游离核酸的方法用于提取血浆和血清样本时获得的核 酸的检测示意图。
【具体实施方式】
[0023] 为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附 图予以说明。
[0024] tween20 为吐温-20 ;
[0025] triton-ΧΙΟΟ为聚乙二醇辛基苯基醚，分子式为C34H620 11;
[0026] SDS为十二烷基硫酸钠；
[0027] NP40为乙基苯基聚乙二醇。
[0028] 裂解结合液中，异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、twe