多孔树脂珠和通过使用它制备核酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多孔树脂珠。本发明的多孔树脂珠可用于制备核酸（尤其是不少于40 个链节的多核苷酸）。
【背景技术】
[0002] 使用亚磷酰胺法的固相合成方法广泛用于核酸（如DNA寡核苷酸或多核苷酸和 RNA寡核苷酸或多核苷酸）的化学合成。在这种方法中，例如，作为待合成核酸的3'-末端 的核苷预先由固相合成载体经由可切割（cleavable)连接基（如琥珀酰基团等）进行负 载，且将该载体置于合成柱中，所述合成柱放置在核酸自动合成仪上。此后，通过核酸自动 合成仪使合成试剂流入反应柱中，并且例如，实施以下合成工序：
[0003] (1)用三氯乙酸/二氯甲烷溶液或二氯乙酸/甲苯溶液等使核苷5'-OH基团脱保 护；
[0004] (2)通过核苷亚磷酰胺（nucleoside phosphoramidite)(核酸单体）/乙腈溶液和 活化剂（四唑等）/乙腈溶液使亚酰胺（amidite)与所述5'-OH基团进行偶联反应；
[0005] (3)用乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等对未反应的5' -OH基团封端；
[0006] (4)通过碘/水/吡啶等氧化亚磷酸酯。
[0007] 重复前述合成工序的循环，由此合成具有目标序列的核酸。通过用氨、甲胺等水解 可切割连接基（见非专利文献1)，来从固相合成载体中切割出最终合成的核酸。
[0008] 无机颗粒（如CPG(可控孔度玻璃））和硅胶已经被用作用于合成核酸的固相合成 载体。然而，近年来，树脂珠以低成本日益频繁地用于大规模合成中，这是因为它们能够基 于每重量的固相合成载体增加核酸的合成量。已知低交联的高溶胀多孔聚苯乙烯珠是这种 树脂珠（见专利文献1)。低交联的高溶胀树脂珠的特征在于可以结合作为核酸合成起点的 许多连接基。另一方面，由于对各合成试剂的溶胀度高，因此可以填充在用于核酸合成的柱 中的树脂珠的量变小。
[0009] 而且，通过使用丙烯腈抑制多孔树脂珠在各种有机溶剂中的溶胀率的变化（见专 利文献2)，来尝试改进核酸的合成能力。在该文献中的多孔树脂珠显示出小的在各种有机 溶剂中的溶胀率变化；然而，需要对核酸合成能力作进一步地改进。
[0010] 通常，成问题的是，待合成的寡核苷酸或多核苷酸的较长链长与合成能力（合成 纯度和合成量）的降低相关联。为了解决该问题，需要降低作为合成固相合成载体的起点 的核苷连接基的载量。例如，当需合成具有高纯度的20个链节的DNA寡核苷酸时，可商购 的用于固相合成的多孔树脂珠载体的核苷连接基载量为约200 ymol/g。当它是不少于40 个链节的DNA多核苷酸时，其载量不超过80 y mol/g。因此，不能利用低交联且高度溶胀的 树脂珠的特性，所述特性是作为核酸合成起点的许多连接基可以与其结合，并且可以填充 在用于核酸合成的柱中的树脂珠的数量下降，这继而降低了每单次合成所得到的合成核酸 的量并且降低了生产效率。在本说明书中，寡核苷酸意为具有20个或更少链节的核苷酸聚 合物，多核苷酸意为具有超过20个链节的核苷酸聚合物。
[0011] [文献列表]
[0012] [专利文献]
[0013] 专利文献 1 JP-A-2005-325272
[0014]专利文献 2 JP-A-2008-074979
[0015][非专利文献]
[0016]非专利文献 1 ：Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2000) 3. 6. 1-3. 6. 13
【发明内容】
[0017]本发明旨在提供多孔树脂珠，所述多孔树脂珠可以大量地填充在合成柱中，这是 因为它对合成试剂溶胀较少，且可以改进每个合成柱的目标产物产量。
[0018] 本发明人已经进行了深入的研究，并且发现可以通过使用具有大的孔尺寸的中度 交联的多孔树脂珠来实现上述目的。基于该发现的本发明如下所述。
[0019] [1]一种共聚物的多孔树脂珠，所述共聚物包含单乙烯基单体单元和交联乙烯基 单体单元，所述多孔树脂珠具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，
[0020]其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的18. 5-55mol%，和
[0021] 所述多孔树脂珠的孔尺寸中值为60-300nm。
[0022] [2]前述[1]的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的 18. 5-45mol%。
[0023] [3]前述[1]的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的 18. 5-40mol%。
[0024] [4]前述[1]的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体的量为总单体的 18. 5-30mol%。
[0025] [5]前述[1]_[4]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的孔尺寸中值为 65_250nm。
[0026] [6]前述[1]_[4]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的孔尺寸中值为 70_200nm 〇
[0027] [7]前述[1]_[6]中任一项的多孔树脂珠，其中所述单乙烯基单体包括芳族乙烯 基单体。
[0028][8]前述[1]_[6]中任一项的多孔树脂珠，其中所述单乙烯基单体包括基于苯乙 烯的单体。
[0029] [9]前述[1]_[6]中任一项的多孔树脂珠，其中所述单乙烯基单体是基于苯乙烯 的单体。
[0030] [10]前述[1]-[6]中任一项的多孔树脂珠，其中所述单乙烯基单体包括苯乙烯和 对羟基苯乙烯。
[0031] [11]前述[1]-[10]中任一项的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体包括多乙 烯基芳族化合物。
[0032] [12]前述[1]_[10]中任一项的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体包括二乙 烯基苯。
[0033] [13]前述[1]_[10]中任一项的多孔树脂珠，其中所述交联乙烯基单体包括对二 乙烯基本和间-乙烯基本。
[0034] [14]前述[1]_[13]中任一项的多孔树脂珠，其中所述能够通过脱水缩合反应与 羧基结合的基团是氨基和/或羟基。
[0035] [15]前述[1]_[13]中任一项的多孔树脂珠，其中所述能够通过脱水缩合反应与 羧基结合的基团是羟基。
[0036] [16]前述[1]_[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述能够与羧基结合的基团的 量为1-1000μmol/g每lg的多孔树脂珠。
[0037] [17]前述[1]_[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述能够与羧基结合的基团的 量为5-500 y mol/g每lg的多孔树脂珠。
[0038] [18]前述[1]_[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的粒度中值为 1-1000 U m。
[0039] [19]前述[1]_[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的粒度中值为 10-500 u m。
[0040] [20]前述[1]-[15]中任一项的多孔树脂珠，其中所述多孔树脂珠的粒度中值为 20 _300 u m〇
[0041] [21] -种生产核酸的方法，其包括按顺序将核苷或核苷酸与前述[1]-[20]中任 一项的多孔树脂珠经可切割的连接基结合，从而得到寡核苷酸或多核苷酸。
[0042] [22] [21]的生产方法，其中所述可切割连接基的载量为1-80 iimol/g每lg的多孔 树脂珠。
[0043] [23] [21]的生产方法，其中所述可切割连接基的载量为5-80 iimol/g每lg的多孔 树脂珠。
[0044] [24] [21]的生产方法，其中所述可切割连接基的载量为10-80 iimol/g每lg的多 孔树脂珠。
[0045] [25] [21]_[24]中任一项的生产方法，其产生具有不小于40个链节的多核苷酸。
[0046] 发明效果
[0047] 由于本发明的多孔树脂珠在合成试剂中溶胀较少且大量地填充在合成柱中，所以 它能够增加每个合成柱的目标产物的产量。因此，使用本发明的多孔树脂珠能够有效地合 成核酸（尤其是具有长碱基序列的DNA多核苷酸）。
【具体实施方式】
[0048] 本发明的多孔树脂珠是包含单乙烯基单体单元和交联乙烯基单体单元的共聚物。 对单乙烯基单体没有特别的限制，只要它是具有一个乙烯基的单体即可。单乙烯基单体的 实例包括芳族乙烯基单体、（甲基）丙稀酸烷基醋、乙酸乙稀醋、（甲基）丙稀臆、乙烯基批 啶、乙烯基吡咯烷酮等。可以使用仅一种单乙烯基单体，或者可以组合使用它们中的两种或 更多种。优选作为单乙烯基单体的是芳族乙烯基单体或（甲基）丙烯酸烷基酯，更优选的 是芳族乙烯基单体。
[0049] 芳族乙烯基单体的实例包括具有一个乙烯基且任选地具有杂原子（如氮原子等） 作为环原子的5元或6元芳环化合物。芳环任选地具有一个或多个取代基，如甲基、乙酰氧 基等。优选作为芳族乙烯基单体的是基于苯乙烯的单体。
[0050] 基于苯乙稀的单体的实例包括苯乙稀；烷基苯乙稀如乙基苯乙稀、甲基苯乙稀、_. 甲基苯乙烯、三甲基苯乙烯、丁基苯乙烯等；卤代苯乙烯如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙 烯、五氟苯乙烯、溴苯乙烯等；卤代烷基苯乙烯如氯甲基苯乙烯、氟甲基苯乙烯等；氨基苯 乙烯；氰基苯乙烯；烷氧基苯乙烯如甲氧基苯乙烯、乙氧基苯乙烯、丁氧基苯乙烯等；酰氧 基苯乙烯如乙酰氧基苯乙烯等；硝基苯乙烯；等等。在具有取代基（例如，烷基）的苯乙烯 (例如，烷基苯乙烯）中，取代基的位置可以是邻位、间位和对位中的任一种，且优选对位。
[0051](甲基）丙烯酸烷基酯的实例包括得自其中烷基的碳数为1-10的直链或支链一元 醇和（甲基）丙烯酸的酯等。其具体实例包括丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己 基酯、丙烯酸甲氧基乙酯、丙烯酸甲氧基乙二醇酯、丙烯酸甲氧基聚乙二醇酯、甲基丙烯酸 甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸2-乙基己基酯、甲 基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸十八烷基酯、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸甲氧 基乙二醇酯、甲基丙烯酸甲氧基聚乙二醇酯、甲基丙烯酸聚乙二醇酯、甲基丙烯酸苄基酯、 甲基丙烯酸三氟乙酯、甲基丙烯酸八氟戊酯等。
[0052] 交联乙烯基单体用作交联剂且对其没有特别的限制，只要它具有两个或更多个乙 烯基即可。在交联乙烯基单体中的乙烯基的数目优选为2-3。交联乙烯基单体的实例包括 多乙烯基芳族化合物如二乙烯基苯（邻二乙烯基苯、间二乙烯基苯、对二乙烯基苯）、三乙 烯基苯（例如，1，3, 5-三乙烯基苯）等；三乙烯基环己烷；二（甲基）丙烯酸酯化合物如 二（甲基）丙烯酸乙二醇酯、二（甲基）丙烯酸一缩二乙二醇酯、二（甲基）丙烯酸二缩三 乙二醇酯、二（甲基）丙烯酸聚乙二醇酯、二（甲基）丙烯酸丙二醇酯、二（甲基）丙烯酸 二亚丙基乙二醇酯、二（甲基）丙烯酸二缩三丙二醇酯、二（甲基）