一种多分散dna提取磁珠的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及磁性纳米微球制备技术领域，尤其是多分散DNA提取磁珠的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]磁珠是纳米磁性微球的简称，具有磁性材料和纳米材料的双重特点，是20世纪70年代末兴起的一种新型材料。其表面可连接多种化学官能基团，从而达到与各类生物大分子的吸附或偶联的目的，由于磁珠本身具有较高的磁响应性，可通过控制外界磁场实现磁珠的集中与分离，这就使得整个操作过程变得简单快捷，尤其针对DNA提取技术，磁珠配合带有磁分离装置的设备，可在最大程度上实现DNA提取的自动化。目前，磁珠法DNA提取已广泛应用于农业、畜牧业、医学诊断、司法鉴定等各个领域中。
[0003]磁珠的制备方法有很多，如球磨法、沉淀法、微乳液法、水热法等等，用这类方法的制备的磁珠可分为两种:单分散磁珠和多分散磁珠。单分散磁珠的制备工艺复杂，操作繁琐，耗时长，较难实现大批量的工业生产，且单分散磁珠的应用领域集中在细胞分离纯化、免疫诊断及肿瘤靶向治疗等方面，就DNA提取而言，单分散磁珠并无较大的优势，而且其成本较高，无法良好的推广于实际应用中。多分散磁珠的制备工艺相对简单，易于批量化生产，但磁珠本身较易团聚，使其悬浮性降低，而且在制备过程中，磁珠较易被其他化学试剂氧化，导致表面官能基团缺失，严重影响了 DNA提取效率，使其较难普及到整个DNA提取领域。
【发明内容】
[0004]针对【背景技术】中指出的磁珠本身较易团聚，使其悬浮性降低，而且在制备过程中，磁珠较易被其他化学试剂氧化，导致表面官能基团缺失，严重影响了 DNA提取效率的问题，本发明的目的是提供一种多分散DNA提取磁珠的制备方法，该方法操作简单，稳定，成本低，适于大批量的工业生产，制备得到的磁珠具有悬浮性好，官能基团稳定，生物吸附性能较高等特点，本发明还对该类磁珠进行了自动化DNA提取的验证，从而更好的证明其实用效果。
[0005]为了实现所述发明目的，本发明采用如下技术方案:一种多分散DNA提取磁珠的制备方法，其制备步骤为:
s 1:多分散裸珠的制备:将FeCl3.6H20与FeS04.7H20按比例混合于去离子水中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，通入氮气，将机械搅拌转速提至500rpm，持续搅拌20min ；加入反应制剂，继续搅拌30min ;将上述溶液转入2L反应釜中，在100°C _200°C条件下反应10-24小时；冷却至室温后，将反应物移出反应釜，用乙醇清洗后，用去离子水清洗，直至上清液PH值为7，真空干燥，得到固体粉末，即多分散裸珠；
S2:多分散磁珠的制备:称取S1所述多分散裸珠10g，并将其加入含有表面活性剂的溶液中，300rpm机械搅拌30min后，用去离子水清洗；磁分离，将上清倒掉，加入lmol/L的盐酸溶液50ml，300rpm机械搅拌30min，同时超声处理30min，结束后用去离子水清洗；磁分离，将上清倒掉，加入100ml的无水乙醇，超声处理30min ;加入质量分数10%的柠檬酸钠水溶液50ml，400rpm机械搅拌30min，同时辅助超声处理30min ;加入20ml氨水，超声处理20min ;加入体积比为1:1.5的娃酸乙酯和无水乙醇混合液20ml，超声处理15min ;然后再次加入体积比为1:1.5的娃酸乙酯和无水乙醇混合液20ml，超声处理15min ;300rpm机械搅拌12小时后，制得多分散磁珠。
[0006]本发明所述S1 中的 FeCl3.6H20 与 FeS04.7H20 的比例为 1-2.5mol:lmol。
[0007]本发明所述S1中的反应制剂为PEG2000、乙酸钠、柠檬酸钠中的一种或几种。
[0008]本发明所述S2中的含有表面活性剂的溶液为质量分数5%的柠檬酸钠溶液或十六烷基三甲基溴化铵溶液。
[0009]—种多分散DNA提取磁珠的应用，所述多分散DNA提取磁珠在DNA自动化提取领域的应用。
[0010]本发明所述多分散DNA提取磁珠在DNA自动化提取领域的应用过程为:S1:人工操作:选取多分散DNA提取磁珠样本，将样本转移到DNA提取设备AUT0MAG? 32的32孔板中；
52:机器操作:将2%CTAB自动转移至AUT0MAG? 32的32孔板中，同时加热，实现自动化裂解；
53:人工操作:裂解后将AUT0MAG? 32的32孔板取出进行离心；
54:机器操作:将520ul磁珠结合液转移至32孔板中，吹吸10次，磁分离1分钟，吸弃上清；将400ul洗涤液转移至32孔板中，吹吸10次，磁分离1分钟，吸弃上清；将150ul洗脱液转移至32孔板中，吹吸10次，磁分离1分钟，将上清转移至PCR八连管中；
55:然后将磁珠结合液、洗涤液及洗脱液自动转移至AUT0MAG? 32的32孔板，同时伴随升温与降温，实现DNA的自动化提取，最终DNA提取设备将提取好的DNA溶液转移至PCR八连管中，进行下游的检测与实验。
[0011]本发明所述磁珠结合液为250ul无水乙醇、250ul异丙醇及20ul磁珠；所述洗涤液为400ul 80%无水乙醇；所述洗脱液为150ul去离子水。
[0012]由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果:本发明首先生产的是不含官能基团多分散裸珠，这使得接下来包覆官能基团的过程更为简便、灵活，可根据实际需求，进行不同种类，不同浓度的官能基团包覆，且反应制剂采用了 PEG2000、乙酸钠、柠檬酸钠中的一种或几种，使其制得裸珠在第一环节便具有较高的悬浮性，粒径也更加均一。
[0013]对不含官能基团的多分散裸珠进行了表面改性，尤其以盐酸溶液辅助改性过程，使裸珠表面与盐酸发生初步反应，再配以柠檬酸钠溶液，使得表面改性更加彻底。
[0014]对制备好的多分散磁珠进行了熟化处理，在氨水的作用下，连续搅拌12小时，使多分散磁珠的悬浮性及官能基团更加稳固，从而使其理化性质更加稳定。
【具体实施方式】
[0015]通过下面的实施例可以详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切技术改进。
[0016]实施例1 (1)取 0.15mol 的 FeCl3.6H20 与 0.lmol 的 FeS04.7H20 混合于 500ml 去离子水中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，通入氮气，将机械搅拌转速提至500rpm，持续搅拌20min。
[0017](2)加入40g PEG2000和25g柠檬酸钠，继续搅拌30min。
[0018](3)将上述溶液转入2L反应釜中，在120°C条件下反应10小时。
[0019](4)冷却至室温后，将反应物移出反应釜，用500ml乙醇清洗3遍后，用去离子水清洗5遍以上，直至上清液PH值为7，真空干燥，得到不含官能基团的多分散裸珠。
[0020](5)称取步骤(4)中的固体粉末10g，并将其加入100ml质量分数为5%的柠檬酸钠溶液中，300rpm机械搅拌30min后，用去离子水清洗3遍。
[0021](6)磁分离，将上清倒掉，加入lmol/L的盐酸溶液50ml，300rpm机械搅拌30min，同时超声处理30min，结束后用去离子水清洗3遍。
[0022](7)磁分离，将上清倒掉，加入100ml的无水乙醇，超声处理30min。
[0023](8)加入质量分数10%的柠檬酸钠水溶液50ml，400rpm机械搅拌30min，同时辅助超声处理30min。
[0024](9)加入20ml氨水，超声处理20min。
[0025](10)加入娃酸乙酯和无水乙醇的混合液(体积比1:1.5) 20ml，超声处理15min。
[0026](11)重复步骤(10)，300rpm机械搅拌12小时后，制得多分散磁珠。
[0027](12)将制好的多分散磁珠用500ml无水乙醇清洗3遍后，去离子水清洗10遍以上，直至上清液PH值为7，调整固含量为15%。
[0028]实施例2
(1)取 0.2mol 的 FeCl3.6H20 与 0.lmol 的 FeS04.7H20 混合于 700ml 去离子水中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，通入氮气，将机械搅拌转速提至500rpm，持续搅拌20min。
[0029](2 )加入60g PEG2000，40g柠檬酸钠，继续搅拌30min。
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