一种纳米免疫磁珠及其制备方法与试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纳米免疫磁珠及其制备方法与试剂盒，该方法包括以下步骤：（1）在惰性气氛中，将碱性溶液注入含有铁源和稳定剂的混合液中，得到磁性纳米粒子；所述碱性溶液和所述混合液的体积比为1:(8-10)，所述铁源、稳定剂与碱性溶液中碱性物质的摩尔比为1:(5-10):(10-14)；（2）在磁性纳米粒子表面修饰具有特异性免疫活性的抗体。本发明的纳米免疫磁珠的制备方法的制备工艺简单，重复性好，基于所得纳米免疫磁珠构建的试剂盒，具有在目标检测液中分散稳定性好，磁响应快，特异性强，灵敏度高及对目标物捕获率高的特点，对于提高食品安全检测的效率具有一定的促进作用。
【专利说明】一种纳米免疫磁珠及其制备方法与试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种纳米免疫磁珠的制备方法、由该方法制得的纳米免疫磁珠以及包 括该纳米免疫磁珠的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 食源性致病微生物在日常生活中对人类健康造成了不容忽视的危害，每年世界各 个国家和地区都会爆发由食源性致病微生物引发的疾病，发病率高，传染性高，不易于控 制。如何在食源性细菌滋生初期进行检测并消除隐患是食品卫生安全领域一直关注的问 题。常规的细菌检测方法周期长，检测限低，大大限制了食品的流通及安全检测的效率及有 效性。免疫磁珠通过分离富集食品检测样品中的低浓度细菌，检测前实现细菌的浓缩，大大 缩短了安全检测的所需的时间，提高检测效率。初期的免疫磁珠的制备方法主要在于将超 顺磁的粒子（<20nm)进行聚合物或硅材料进行镶嵌而成，其尺寸大都在微米尺度，饱和磁化 强度大，磁响应性好。但由于其大的尺寸，磁珠在目标溶液中的分散稳定性差，很容易团聚 沉淀，由此分离富集的效率较低。有研究通过调节制备方法，可以得到尺度接近纳米级的磁 珠（200-500nm)，提高了磁珠的分散稳定性，得到了相对较好的分离富集效果，但是该制备 方法操作步骤多，人力成本高，不便于试剂盒的推广。另外也有小尺寸的磁珠（<20nm)的制 备方法的报道，虽然其解决了大尺寸磁珠分散性的问题，但是其饱和磁化强度低，磁响应性 差，不利于快速的分离富集操作。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种分散稳定性好且磁响应快的纳米免疫磁珠的制备方 法、由该方法制得的纳米免疫磁珠及含有该纳米免疫磁珠的试剂盒。该方法制备过程简单， 重复性好，基于所得纳米免疫磁珠构建的试剂盒具有在目标检测液中特异性强，灵敏度高 及对目标物捕获率高的特点。
[0004] 本发明的发明人通过调节制备条件，得到了具有纳米尺度（60-130nm)的超顺磁性 纳米粒子，然后通过共价偶联法将特异性抗体偶联到纳米粒子表面，得到了具有特异性吸 附性能的纳米免疫磁珠，并利用纳米免疫磁珠构建了相应的免疫磁珠试剂盒，从而完成了 该发明。
[0005] 因此，本发明提供了一种纳米免疫磁珠及其制备方法与试剂盒，该方法包括以下 步骤：
[0006] ( 1)在惰性气氛中，将碱性溶液注入含有铁源和稳定剂的混合液中，得到磁性纳米 粒子；所述碱性溶液和所述混合液的体积比为1: (8-10)，所述铁源、稳定剂与碱性溶液中 碱性物质的摩尔比为1: (5-10) : (10-14);
[0007] (2)在磁性纳米粒子表面修饰具有特异性免疫活性的抗体。
[0008] 本发明还提供了由上述方法制备的纳米免疫磁珠及包括该纳米免疫磁珠的试剂 盒。
[0009] 根据本发明的纳米免疫磁珠的制备方法，其制备工艺简单，重复性好，基于所得纳 米免疫磁珠构建的试剂盒，具有在目标检测液中分散稳定性好，磁响应快，特异性强，灵敏 度1?及对目标物捕获率1?的特点，对于提1?食品安全检测的效率具有一定的促进作用。
[0010] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0012] 图1为实施例1中所制备的磁性纳米粒子的扫描电子显微镜图片；
[0013] 图2为实施例1中所制备的磁性纳米粒子的透射电子显微镜图片；
[0014] 图3为实施例1中所制备磁性纳米粒子在25°C条件下磁性能（VSM)的表征结果；
[0015] 图4为本发明中在磁性纳米粒子表面修饰抗体的方法示意图；
[0016] 图5为利用本发明的纳米免疫磁珠进行微生物分离富集的过程示意图；
[0017] 图6显示的是实施例1中所得纳米免疫磁珠对副溶血球菌的分离富集结果； [0018] 图7显示的是实施例1中所得纳米磁珠的特异性评价结果；
[0019] 图8显示的是实施例2所得纳米免疫磁珠对霍乱弧菌的分离结果；
[0020] 图9显示的是实施例3中所得纳米免疫磁珠的透射电子显微镜图片。
【具体实施方式】
[0021] 以下是对本发明的【具体实施方式】进行的详细说明。应当理解的是，此处所描述的
【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0022] 本发明提供的制备纳米免疫磁珠的方法包括以下步骤：
[0023] ( 1)在惰性气氛中，将碱性溶液注入含有铁源和稳定剂的混合液中，得到磁性纳米 粒子；所述碱性溶液和所述混合液的体积比为1: (8-10)，所述铁源、稳定剂与碱性溶液中 碱性物质的摩尔比为1: (5-10) : (10-14);
[0024] (2)在磁性纳米粒子表面修饰具有特异性免疫活性的抗体。
[0025] 根据本发明，所述碱性物质可以为任何本领域常用的碱金属氢氧化物，优选为氢 氧化钠和/或氢氧化钾。所述碱性溶液中，对碱性物质的浓度没有特别的限制，优选为 2-3mmol/mL〇
[0026] 根据本发明，所述碱性溶液和所述混合液中的溶剂可以为本领域常规选择的溶 齐U，但优选为二乙二醇和/或乙二醇。
[0027] 根据本发明，所述铁源可以为各种能够在溶剂中提供三价铁离子的含铁物质，但 优选为无水氯化铁、硝酸铁和高氯酸铁中的至少一种。
[0028] 根据本发明，对所述稳定剂没有特别的要求，优选情况下，所述稳定剂为聚丙烯 酸。所述聚丙烯酸的重均分子量优选为1700-7000。
[0029] 根据本发明，所述碱性溶液可以通过常规方法获得，优选情况下，所述碱性溶液 的制备方法优选包括：将碱性物质与溶剂混合，混合的条件包括温度为100-120°C，时间为 0. 5~2h〇
[0030] 根据本发明，所述混合液可以通过常规方法获得，优选情况下，所述混合液的制 备方法优选包括将铁源、稳定剂与溶剂混合，混合的条件包括温度为210-230°C，时间为 20-60min〇
[0031] 根据本发明，将碱性溶液注入混合液中的方式优选为：于210-230°c下，在1-5S时 间内，将碱性溶液加入混合液中，加入后使混合体系在200-220°C的温度下维持0. 5-2h。
[0032] 根据本发明，在磁性纳米粒子表面修饰具有特异性免疫活性的抗体的方法可 以为本领域常规使用的方法，例如，一般包括以下步骤：1)磁性纳米粒子表面羧基基 团的活化；2)抗体的共价偶联；和3)非特异性位点的牛血清蛋白（BSA)封闭（可以参 见 Yang, H. ; Qu, L. ;ffimbrow, A. N. ; Jiang, X. ; Sun, Y. , Rapid detection of Listeria monocytogenes by nanoparticle-based immunomagnetic separation and real-time PCR. International Journal of Food Microbiology2007, 118(2)，132-138)。
[0033] 其中，对磁性纳米粒子的表面羧基基团的活化方法没有特别限制，例如，可以包 括：在0-5°C下，将磁性纳米粒子与1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟 基硫代琥珀酰亚胺钠盐（EDC/sulfo-NHS)加入pH=5. 5-6. 0的磷酸缓冲溶液中，磁性纳米粒 子的加入量使得磁性纳米粒子在反应体系中的浓度为l_3mg/mL，加入EDC/Sulfo-NHS的量 为2-4mg/l_l. 5mg，控制反应时间为15_40min。
[0034] 对抗体的共价偶联方法没有特别的要求，例如，可以包括：将活化的磁性纳米粒子 进行磁分离洗脱(具体操作为在pH=7. 5-8. 5的磷酸缓冲溶液中分离洗脱2-3次)，以除去过 量的EDC/Sulfo-NHS，然后向洗脱好的磁性纳米粒子溶液中加入待偶联的抗体，抗体的加入 量为（35-75 μ g抗体）/ (lmg磁性纳米粒子）；活化的磁性纳米粒子浓度控制在l-3mg/mL ; 所用溶剂为pH=7. 5-8. 5的磷酸缓冲溶液，控制偶联温度为25-30°C，偶联时间为2-6h。
[0035] 对非特异性位点的BSA封闭方法也没有特别的限制，例如，可以包括：将步骤2)所 得粒子进行磁分离洗脱(具体操作为在pH=7. 2-7. 5的磷酸缓冲液中分离洗脱2-3次)，以去 除过量的稳定剂，然后将粒子分散到BSA的溶液中在摇床中震荡（180-250r/min)，BSA溶液 为含有1-2重量％BSA的pH=7. 2-7. 5的磷酸缓冲液，控制封闭温度为20-35°C，封闭时间为 8-12h。
[0036] 根据本发明，对所述抗体没有特殊的要求，可以为各种微生物(例如副溶血弧菌、 霍乱弧菌和沙门氏菌等）的单克隆抗体，所述抗体可以通过商购获得。
[0037] 根据本发明，所述纳米免疫磁珠可以以常规的方式进行储存，例如，储存的方法可 以包括：对封闭好的纳米免疫磁珠进行2-3次的磁分离洗脱，将粒子分散到BSA溶液中，BSA 溶液为含有〇. 1-0. 2重量％BSA的pH=7. 0-7. 5的磷酸缓冲液。
[0038] 本发明还提供了上述方法制得的纳米免疫磁珠。本发明方法获得的纳米免疫磁珠 分散稳定性好、磁响应快、特异性强、灵敏度高及对目标物捕获率高。
[0039] 本发明还提供了包括上述方法制得的纳米免疫磁珠和磁铁的试剂盒。其中，所述 磁铁可以为本领域的各种常规选择，即，可以为永久磁铁(天然磁石)，也可以为非永久磁铁 (电磁铁)，且可商购获得，在此不再赘述。
[0040] 根据本发明，利用本发明的纳米免疫磁珠(或试剂盒）进行微生物分离富集的方 法可以包括：将纳米免疫磁珠与目标微生物菌液混合，一定时间后，在磁场下进行磁分离 富集，再对分离富集后的上清液进行菌落计数，纳米免疫磁珠与目标微生物菌液的混合液 中，纳米免疫磁珠的量为2. 0-2. 5mg/mL，其中纳米免疫磁珠与目标微生物的混合时间为 20-60min ;混合温度为 20-35°C。
[0041] 本领域技术人员能够理解的是，基于不同的抗体，本发明的纳米免疫磁珠能够实 现各种不同的微生物的分离富集。例如，抗体为副溶血弧菌单抗时，制得的纳米免疫磁珠对 副溶血弧菌具有高效的特异性的分离富集效果；抗体为霍乱弧菌单抗时，制得的纳米免疫 磁珠对霍乱弧菌具有高效的特异性的分离富集效果。
[0042] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。以 下实施例中，离心采用台式高速离心机（XiangYi H-1650);透射电子显微镜图片采用六硼 化镧透射电子显微镜（Tecnai G220S-TWIN)得到；扫描电子显微镜图片采用冷场发射扫描 电子显微镜（Hitachi S-4800)得到；磁性纳米粒子磁性能由物理性能测试系统（PPMS-9) 表征得到；分离率=(分离富集前菌液的含菌量-分离富集后上清液的含菌量）/分离富集 前菌液的含菌量X 100%，含菌量的测定方法为菌落计数法，具体参照《微生物学实验指导》 第2版(黄秀梨等，2008年出版，高等教育出版社）第一部分实验16。
[0043] 实施例1
[0044] ( 1)制备磁性纳米粒子
[0045] 将氢氧化钠加入到二乙二醇溶剂中，在氩气保护下加热到110°C，保持lh，然后降 温到70°C，得到质量浓度为0. lg/mL的氢氧化钠溶液；
[0046] 取无水氯化铁和聚丙烯酸加入到二乙二醇溶剂中（相对于每毫摩尔的无水氯化 铁，溶剂的用量为42mL)，在机械搅拌和氩气保护下的条件下将混合液加热到220°C，保持 30min，其中无水氯化铁和聚丙烯酸的摩尔比为1:10 ;
[0047] 在220°C条件下将3. 5mL氢氧化钠溶液在Is时间内注射到34mL无水氯化铁和聚 丙烯酸的混合液中，注射后调节温度到210°C，并在该温度下使反应持续lh，将反应液自然 降温到25°C，得到含有磁性纳米粒子的溶液；
[0048] 用乙醇对所得磁性纳米粒子进行离心清洗3次（10000r/min，20min)，最后分散到 去离子水中，图1为所得磁性纳米粒子的扫描电子显微镜图片，图2为所得磁性纳米粒子透 射电子显微镜图片，图3为所得磁性纳米粒子的磁性能表征结果。
[0049] (2)在磁性纳米粒子表面修饰具有特异性免疫活性的抗体
[0050] 如图4的流程图所示，在磁性纳米粒子表面修饰副溶血球菌抗体(购自abeam, 商品号为ab78950)，得到纳米免疫磁珠，具体操作参见文献Yang，H. ;Qu，L.;WimbrOW，A. N. ;Jiang,X. ;Sun,Y. , Rapid detection of Listeria monocytogenes by nanoparticle-based immunomagnetic separation and real-time PCR. International Journal of Food Microbiology2007, 118(2)， 132-138。
[0051] (3)细菌的分离富集实验
[0052] 利用步骤（2)得到的纳米免疫磁珠进行副溶血球菌(购自ATCC，商品号为15313) 的分离富集，具体步骤参见图5。
[0053] 在25 °C条件下将2. 5mg纳米免疫磁珠与lmL副溶血球菌菌液(含菌量分别为 103cfu/mL，102cfu/mL、10cfu/mL)混合，30min后在磁场下进行磁分离富集，然后对分离富集 后的上清液进行菌落计数，图6为所得纳米免疫磁珠对副溶血球菌的分离结果。
[0054] 利用霍乱弧菌(购自ATCC，商品号为39315)和沙门氏菌(购自ATCC，商品号为 14028)重复以上操作进行纳米免疫磁珠的特异性分析，图7为特异性评价结果。
[0055] 从图6和7可以看出，本发明方法所得的免疫磁珠对副溶血球菌具有特异性的分 离富集效果，对细菌的平均捕获率达到的80%以上，可有效提高细菌的检测灵敏度和检测 效率，这对食品安全检测中细菌检测具有重大的实用意义。
[0056] 实施例2
[0057] (1)制备磁性纳米粒子
[0058] 将氢氧化钠加入到二乙二醇溶剂中，在氩气保护下加热到110°C，保持lh，然后降 温到70°C，得到质量浓度为0. lg/mL的氢氧化钠溶液；
[0059] 取无水氯化铁和聚丙烯酸加入到二乙二醇溶剂中（相对于每毫摩尔的无水氯化 铁，溶剂的用量为42mL)，在机械搅拌和氩气保护下的条件下将混合液加热到220°C，保持 30min，其中无水氯化铁和聚丙烯酸的摩尔比为1:5 ;
[0060] 在220°C条件下将3. 5mL氢氧化钠溶液在5s时间内注射到34mL无水氯化铁和聚 丙烯酸的混合液中，注射后调节温度到210°C，并在该温度下使反应持续lh，将反应液自然 降温到25°C，得到含有磁性纳米粒子的溶液；
[0061] 用乙醇对所得磁性纳米粒子进行离心清洗3次（10000r/min，20min)，最后分散到 去离子水中。
[0062] (2)在磁性纳米粒子表面修饰具有特异性免疫活性的抗体
[0063] 如图4所示地在磁性纳米粒子表面修饰霍乱弧菌抗体(购自abeam，商品号为 ab79793)，得到纳米免疫磁珠，具体操作参照实施例1的步骤（2)。
[0064] (3)细菌的分离富集实验
[0065] 利用步骤（2)得到的纳米免疫磁珠进行霍乱弧菌(购自ATCC，商品号为39315)的 分离富集，具体步骤参见图5。
[0066] 在25°C条件下将2. 5mg纳米免疫磁珠与lmL霍乱弧菌菌液(菌液含菌量分别为 103cfu/mL，102cfu/mL、10cfu/mL)混合，30min后在磁场下进行磁分离富集，然后对分离富集 后的上清液进行菌落计数，图8为所得纳米免疫磁珠对霍乱弧菌的分离结果，从图8可以看 出，利用该方法制备的霍乱弧菌的免疫磁珠对霍乱弧菌具有很好的分离富集效果。
[0067] 实施例3
[0068] 按照实施例1的方法制备纳米免疫磁珠，不同的是，将氢氧化钠溶液的注射温度 控制为190°C。
[0069] 图9为所得粒子的透射电子显微镜图片，从图9可知，控制碱性溶液的注入温度在 本发明优选范围内能够获得单分散性更好的磁性纳米粒子，从而能够使获得的纳米免疫磁 珠的分散稳定性更好。
[0070] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0071] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0072] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【权利要求】
1. 一种制备纳米免疫磁珠的方法，该方法包括以下步骤： (1) 在惰性气氛中，将碱性溶液注入含有铁源和稳定剂的混合液中，得到磁性纳米粒 子；所述碱性溶液和所述混合液的体积比为1: (8-10)，所述铁源、稳定剂与碱性溶液中碱 性物质的摩尔比为1: (5-10) : (10-14); (2) 在磁性纳米粒子表面修饰具有特异性免疫活性的抗体。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述碱性物质为氢氧化钠和/或氢氧化钾，所述 碱性溶液中，碱性物质的浓度为2-3mmol/mL。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述碱性溶液和所述混合液中的溶剂为二乙 二醇和/或乙二醇。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述铁源为无水氯化铁、硝酸铁和高氯酸铁中的 至少一种。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述稳定剂为聚丙烯酸，所述聚丙烯酸的重均分 子量为 1700-7000。
6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述碱性溶液的制备方法包括：将碱性物质 与溶剂混合，混合的条件包括温度为100-120°C，时间为0. 5-2h。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合液的制备方法包括将铁源、稳定剂与溶 剂混合，混合的条件包括温度为210-230°C，时间为20-60min。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中，将碱性溶液注入混合液中的方式为：于 210-230°C下，在l_5s时间内，将碱性溶液加入混合液中，加入后使混合体系在200-220°C 的温度下维持〇. 5_2h。
9. 根据权利要求1-8中任意一项所述的方法制得的纳米免疫磁珠。
10. -种用于细菌分离富集的试剂盒，该试剂盒包括权利要求9所述的纳米免疫磁珠 和磁铁。
【文档编号】B01J20/30GK104096548SQ201310125424
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月11日 优先权日:2013年4月11日
【发明者】刘雪峰, 唐智勇 申请人:国家纳米科学中心