基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，属于生物技 术领域。 技术背景
[0002] 微生物是指大量的、极其多样的、不借助显微镜看不见的微小生物类群的总称。因 此，微生物通常包括病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、航病毒）、具原核细胞结构的真细菌、古 生菌W及具真核细胞结构的真菌（酵母、霉菌、葦菌等）、原生动物和单细胞藻类。
[0003] 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学 的研究热点。长期W来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因忍片等新技术的不 断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化，使我们能够对环境微生 物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱 的变化。
[0004] 动物肠道定植着一群十分复杂而又相对稳定的微生物，运些微生物形成一个极其 复杂的微生态系统，对动物健康有着非常重要的影响。肠道微生态的变化对机体具有重要 的意义与影响，肠道微生态尤其是优势菌群的研究正越来越受到人们的重视，成为当前研 究的热点，目前，通过宏基因学进行粪便中微生物基因组的研究是研究肠道微生物多样性 的一种重要方法。然而利用基因组学研究粪便中微生物多样性首先要能提取到粪便中的 微生物基因组DNA，因此，研究一种快速提取动物粪便微生物基因组DNA的方法显得特别重 要。
【发明内容】
： 本发明提供一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，该方法通过溶菌 酶破碎微生物细胞，利用酪氯仿异戊醇溶液抽除杂质，采用娃基磁珠特异性吸附动物粪便 微生物基因组DNA，利用该方法可W方便、快捷地提取到动物粪便微生物基因组。
[0006] 一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，包括粪便的前处理、粪 便中微生物细胞的裂解、DNA的游离与杂蛋白的抽除，磁珠法回收微生物基因组，具体步骤 如下：粪便的前处理：称取0. 3-0. 5g新鲜粪便于2ml离屯、管中，加入l-2ml Buffer A振 荡 l-2min，3000-5000;rpm/min 离屯、l〇-20min，转移上清至新的离屯、管中，10000-12000;rpm/ min离屯、10-20min。弃上清，保留沉淀。
[0007] 粪便中微生物细胞的裂解：往沉淀中加入450-600 y 1 Buffer B和50-60 y 1 Buffer C，混匀后 37-40°C水浴 1-化，加入 65-70 Buffer D 和 65-70 Buffer E，混 匀后37-60°C水浴1-化。
[0008] DNA的游离与杂蛋白的抽除：往溶液中加入600-800 y 1 Buffer F，振荡器震荡 30-60S后，12000-13000巧m/min离屯、10-20min，将上清移至新的离屯、管中，加入等体积的 Buffer G，12000-13000;rpm/min离屯、l〇-20min，将上清移至新的离屯、管中。
[0009] 磁珠法回收微生物基因组：加入等体积的Buffer H。震荡10-20S。室溫放置 5-lOmin，将离屯、管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离屯、管一侧时，吸 去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离屯、管中加入l-2ml Buffer I，打匀后室溫静止5-lOmin， 将离屯、管放在磁力架上，进行磁珠分离。待磁珠吸附到离屯、管一侧时，吸去液体，保留磁珠。 往含有磁珠的离屯、管中加入50-100y1 Buffer J，经观察，待磁珠吸附到离屯、管一侧时吸 取液体。此溶液即为粪便微生物基因组DNA。于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0010] 下表为本实施例基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组DNA的结果。
[0011] 试剂的配方如下： 磁珠为娃基生物磁珠，粒径为lum。购买自溫州安科纳米科技有限公司，产品编号： AKl-GlOOOBuffer A :0. 25-0. 37mol/L 憐酸二氨钟，0. 175-0. 2mol/L 氨氧化钢，PH = 7-8。 阳01引 Buffer B :10-20mMS径甲基氨基甲烧灯ris)，l-10mM乙二胺四乙酸巧DTA)，PH =5. 0-8. 0〇
[0013] BufferC :溶菌酶（l〇-50mg/ml)。
[0014] BufferD:蛋白酶 K(20-50mg/ml)。
[0015] BufferE:10-20%质量体积比的十二烷基硫酸钢（SDS)。
[0016] BufferF:酪：氯仿：异戊醇的体积比为25:24:1。
[0017] Buffer G:氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
[0018] Buffer H:异丙醇：磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按 照1:2体积比配置。
[0019] BufferI:4. 3-21. 4mmol/LS径甲基氨基甲烧灯ris), 2. 1-4. 2mmol/L乙二胺四 乙酸巧DTA)，42. 9-85. 7mmol/L化cl，60-80%无水乙醇。
[0020]BufferJ:8-10mmol/LS径甲基氨基甲烧灯ris)，PH =8. 0-9. 0。
[0021] 本发明的显著优点： 本发明提供一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组的方法，该方法通过溶菌 酶破碎微生物细胞，利用酪氯仿异戊醇溶液抽除杂质，采用娃基磁珠特异性吸附动物粪便 微生物基因组DNA，与常规的动物粪便微生物基因组提取方法相比，该方法不仅节省了大量 提取时间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到动物粪便微生物基因组。
【附图说明】： 图1为利用本方法提取的动物粪便微生物基因组的电泳检测图。 具体实施例
[0023] 图1中，泳道1，2是利用本发明方法提取到的动物粪便微生物基因组，泳道3为 TAKARA 公司的 DL4500Marker。
[0024] 一种基于磁珠法快速提取动物粪便微生物基因组，具体步骤如下： (1)粪便的前处理：分别称取两管0. 3g新鲜粪便于2ml离屯、管中，加入1ml Buffer A 振荡lmin，3000巧m/min离屯、lOmin，转移上清至新的离屯、管中，10000;rpm/min离屯、lOmin。 弃上清，保留沉淀。 阳02引 似粪便中微生物细胞的裂解准沉淀中加入450 y 1 Buffer B和50 y 1 Buffer C，混匀后37°C水浴比，加入65 y 1 Buffer D和65 y 1 BufferE，混匀后37°C水浴化。
[0026] (3)DNA的游离与杂