专利名称：：红细胞膜抗原磁珠试剂盒及在血型抗体检测方面的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
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背景技术：
：1900年Landsteiner发现了人类红细胞的ABO血型抗原，这一划时代的成果，开启了世人对临床输血的深入探讨，并为今天的临床安全输血奠定了基础。临床输血前进行的血型血清学检测概括为三类1、血型检定；2、抗体筛检和鉴定；3、交叉配血。血型检定检査确定受血者和献血者的红细胞血型，最主要是ABO血型和Rh血型。英国药典特别强调检测ABO血型不仅要检测红细胞表面抗原，而且必须还要检测血清(或血浆)中抗体，即正反定型。也就是说人类ABO血型表面抗原和血清(或血浆)中抗体要共同检测，只有两者结果相符时，即正反定型相符，才能正确判定人类ABO血型。人体内ABO血型抗原不仅存在于红细胞膜，而且更广泛的存在于很多组织细胞膜和体液、分泌液中。人体内ABO血型抗体最多是IgM类自然发生的抗体。在妊娠或输ABO不相容血液后也可以产生IgG类免疫抗体。长期以来，人们一直用人血清制备的抗A、抗B抗体来检测人类ABO血型表面抗原。自从1975年Kohler和Milstein发明淋巴细胞杂交瘤技术后，单克隆抗体血型试剂逐渐取代了人血清抗体。此种单克隆抗体血型试剂在鉴定人红细胞血型抗原，进而判定人的血型等方面具有很多的优点。然而在临床实际工作中仍存在着许多的影响因素，例如个体差异、环境因素、药物影响以及多种疾病等，主要是造成红细胞表面抗原的抗原性减弱以至于破坏。如此，在进行临床输血血型配合试验中就会出现假阴性或假阳性的结果，并由此会造成临床病人出现输血反应。随着临床输血工作的不断发展，如何更加准确的进行血型定型检测就成为临床的必需。临床进行血型检测主要采用玻片法，试管法及微孔法，其本质都为凝集技术。进行正定型检测是用血型单克隆抗体试剂检测红细胞上抗原，反定型检测是用红细胞试剂检测血清中抗体。目前应用的检测红细胞多为输血单位自行配制，他们多采用保存液保存红细胞。红细胞保护液的成份及理化性质的差异，会造成反定型用红细胞试剂的质量不稳定，导致血清抗体检测结果不准确，甚至造成血型错判，严重影响临床输血安全，更影响反定型检测方法的推广。临床进行不规则抗体筛检及鉴定主要采用试管抗人球蛋白技术及微珠凝胶抗人球蛋白技术。不规则抗体指不符合ABO血型系统Landsteiner法则的血型抗体，即抗A抗B以外的血型抗体，一般因为输血、妊娠等发生同种免疫而产生，多属于IgG类抗体。它是一种7S球蛋白，分子量小，分子长度只250A与红细胞相应抗原结合后，在盐水介质中只能与红细胞结合而不出现肉眼可见的凝集反应，必须通过特殊的方法才能使致敏细胞发生凝集反应，从而检出此类抗体。如果受血者体内存在有临床意义的抗体，就会破坏输入的含有相应抗原的红细胞，发生溶血性输血反应，影响红细胞输注的疗效，重者危及患者生命。孕妇体内如含有不规则抗体，则会引起新生儿溶血病，产生核黄疸等其他严重影响新生儿发育的综合症，给家庭和社会带来沉重的负担，甚至引起新生儿死亡。因此，开展不规则抗体筛查是十分必要的。欧美等许多发达国家已将不规则抗体筛查作为常规检测，在我国，卫生行政部门还没有相关的要求。临床上，医院及血站仅是对少数患者进行抗体筛检。对献血者的抗体筛检更是空白，存在极大的安全隐患。目前临床进行不规则抗体筛检所使用的检测细胞为红细胞保存液保存的筛检细胞，筛检细胞是从O型献血员中筛选抗原谱而得到，其获得不易，保存期短，临床并不常用，故往往l套试剂进行少量标本检测后就会发生溶血，不能继续使用，极大的浪费。
发明内容本发明的目的是用红细胞膜抗原磁珠制作试剂盒并在血型抗体检测方面的应用。本发明试剂盒包括a、具有红细胞血型抗原性的红细胞膜抗原磁珠；b、96孔U型反应板；c、红细胞膜抗原磁珠稀释液。本发明所述的红细胞抗原磁珠稀释液的制备配制低离子液取NaCl、甘氨酸于烧杯中，加入双蒸馏水溶解后，加入KH2P04和Na2HP04，充分混匀，最后用NaOH调节PH至6.7;用低离子液配制浓度为1%的牛血清白蛋白液，即为红细胞膜抗原磁珠稀释液。本发明的试剂盒在血型抗体检测方面的应用。本发明的优点是红细胞膜抗原磁珠保存期长，有利于对红细胞稀有抗原的保存。应用红细胞膜抗原磁珠检测不完全抗体时，洗涤过程不需离心；进行ABO系统血型凡定型检测时，检测方法简便、易行；可同时对大量样本进行检测，易于自动化。具体实施例方式本发明的试剂盒包括a、具有红细胞血型抗原性的红细胞膜抗原磁珠；b、96孔U型反应板；c、红细胞膜抗原磁珠稀释液。红细胞膜抗原磁珠的制备1、红细胞抗原的制备(1)取新鲜血细胞，离心去上清，取压积血细胞进入下一步处理；(2)在压积血细胞中加入SDS，然后置于室温；(3)离心去上清，留沉淀物并向沉淀物中加入蒸馏水；2、磁性粒子的制备(1)将FeCl2和FeCl:,加入到蒸馏水中进行溶解；(2)在剧烈搅拌的条件下，将氢氧化钠加入到上述金属盐溶液中，使其水解为金属复合氧化物，从而得到四氧化三铁颗粒溶液；3、细胞膜抗原包被磁性粒子将步骤2.1获得的红细胞膜抗原加入步骤2.2获得的四氧化三铁颗粒溶液中，再加入聚乙二醇，进行孵育，离心后弃上清，留沉淀，再在沉淀中加入低渗磷酸盐缓冲液洗涤，即得细胞膜抗原包被的磁性粒子。96孔U型反应板制备用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液将将纯化的血小板单克隆抗体配制成10ug/ml浓度，按100ul/孔加入反应孔中，置4。C冰箱中包被过夜，次日取出，用含有0.05%吐温的pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液洗涤5次，拍干，置-2(TC保存备用。本发明所述的红细胞抗原磁珠稀释液的制备配制低离子液取NaC10.875g，甘氨酸9g于500ml烧杯中，加入400ml双蒸熘水溶解后，加入5.65ml0.15MKH2PO4和4.35ml0.15MNa2HP04，充分混匀后定容至500ml，最后用NaOH调节PH至6.7。用低离子液配制浓度为1%的牛血清白蛋白液，即为红细胞膜抗原磁珠稀释液。本发明的试剂盒在血型抗体检测方面的应用。实施例lABO系统血型反定型检测用已知的A型红细胞、B型红细胞如具体实施方式制备A红细胞膜抗原磁珠、B红细胞膜抗原磁珠。由于红细胞膜抗原磁珠上包被有A抗原及B抗原，故可代替新鲜红细胞用于ABO系统血型反定型检测。A型人血清巾含有抗B抗体，B型人血清中含有抗A抗体，AB型人血清中不含有抗体，O型人血清中含有抗AB抗体。AB0血型系统抗体多为自然发生的抗体，为IgM类抗体，红细胞膜抗原磁珠能够与血清中的相应IgM抗体发生特异性免疫反应，形成肉眼可见的凝集。依据反应后的格局判定血型。ABO血型表现性反应格局表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>反应程序向标记好的反应板屮分别加入待检血清25ul，然后加入红细胞膜抗原磁珠50ul，混匀，置程控磁化振荡器上，按设定好的程序反应，反应结束后，取出反应板，对照反应格局判度结果。实施例2红细胞不规则抗体的筛检用已知特异性的抗体检测红细胞，确定筛检细胞的抗原谱如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将上述筛检细胞如具体实施方式制备筛检细胞膜磁珠，筛检细胞膜抗原磁珠表面具有新鲜筛检细胞上全部抗原，可用于临床进行IgG抗体的筛检。IgG抗体一般因为输血、妊娠等发生同种免疫而产生。它是一种7S球蛋白，分子量小，分子长度只250A与红细胞相应抗原结合后，在盐水介质中只能与红细胞结合而不出现肉眼可见的凝集反应，必须通过加入抗人球蛋白试剂后才能使致敏细胞发生凝集反应，从而检出此类抗体。反应程序向标记好的反应板中分别加入待检血清50ul，然后加入筛检红细胞膜抗原磁珠50ul，混匀，置37。C水浴箱中孵育30分钟，置程控磁化振荡器上，用洗液洗涤3次，200ul/次，最后一次彻底去上清，每孔加入50ul抗人球蛋白试剂，混匀，按设定好的程序反应，反应结束后，取出反应板，观察结果。若为阳性反应则表明待检者血清中含与筛检细胞抗原相对应的抗体。若为阴性反应则表明待检者血清中不含有与筛检细胞抗原相对应的抗体。实施例3红细胞不规则抗体的鉴定用已知特异性抗体检测10人份或10人份以上o型红细胞，确定其抗原谱，将其作为红细胞谱细胞。作为谱细胞的红细胞要求，应用其能够鉴定出临床最常见的有临床意义的同种异型抗体。将红细胞谱细胞如具体实施方式制备成谱细胞膜磁珠，谱细胞膜抗原磁珠表面具有新鲜红细胞谱细胞上全部抗原，可用于临床进行IgG抗体的鉴定。反应程序向标记好的反应板中分别加入待检血清50ul，然后加入谱红细胞膜抗原磁珠50ul，混匀，置37"C水浴箱中孵育30分钟，置程控磁化振荡器上，用洗液洗涤3次，200ul/次，最后一次彻底去上清，每孔加入50ul抗人球蛋白试剂，混匀，按设定好的程序反应，反应结束后，取出反应板，通过与红细胞谱细胞格局观察结果。权利要求1、一种红细胞膜抗原磁珠试剂盒，其特征是a、具有红细胞血型抗原性的红细胞膜抗原磁珠；b、96孔U型反应板；c、红细胞膜抗原磁珠稀释液。2、根据权利要求1所述的红细胞膜抗原磁珠试剂盒，其特征在于所述的红细胞抗原磁珠稀释液的制备配制低离子液取NaCl、甘氨酸于烧杯中，加入双蒸馏水溶解后，加入KH2P04和Na2HP04，充分混匀，最后用NaOH调节PH至6.7;用低离子液配制浓度为1%的牛血清白蛋白液，即为红细胞膜抗原磁珠稀释液。3、权利要求1所述的试剂盒在血型抗体检测方面的应用。全文摘要一种红细胞膜抗原磁珠试剂盒及在血型抗体检测方面的应用，属于生物
技术领域：
。本发明的目的是用红细胞膜抗原磁珠制作试剂盒并在血型抗体检测方面的应用。本发明试剂盒包括红细胞膜抗原磁珠、96孔U型反应板、红细胞膜抗原磁珠稀释液。本发明的优点是红细胞膜抗原磁珠保存期长，有利于对红细胞稀有抗原的保存。文档编号G01N33/80GK101387648SQ200810051319公开日2009年3月18日申请日期2008年10月24日优先权日2008年10月24日发明者墅周,孔维臣,孙玉昌,宇张,景维东,东李,勇李,杨文冲,段生宝,军童,马学严申请人:勇李