基于磁珠法提取土壤微生物dna的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体涉及一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒及方法，本发明的基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒及方法，是利用氢氧化铝来去除土壤中的各种杂质，再使用玻璃珠破碎土壤微生物细胞后，通过磁珠吸附土壤微生物DNA，从而快速获得土壤微生物DNA。本发明方法所用时间短，步骤少，能获得纯度高的土壤微生物DNA，无需再进一步纯化即可直接进行下游实验。
【专利说明】基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体涉及一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA 的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 土壤除了为陆生植物提供营养源和水分之外，还是植物生长，进行光合作用、能量 交换的主要场所；同时也具有微生物生长繁殖所需要的一切营养物质及各种条件，是微生 物良好的生活场所，有"微生物的天然培养基"之称。
[0003] 土壤是微生物的主要栖息地，是自然环境中最复杂的异质体系，这决定了土壤微 环境的多样化和土壤微生物的高度多样性。每克土壤含有大约107个原核生物细胞，但仅 有0. 1%?10%的土壤微生物是可以培养的。在微生物学研究领域中，因为99%以上的微 生物都是目前未（难）被纯培养的，过去人们对微生物世界的认识基本上都集中在不到1% 的微生物上。对这些未培养微生物多样性及群落功能的研究将大大扩展我们对生命的了 解，包括了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相 互作用。
[0004] 微生物环境基因组学为最大限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇，已经 成为国际生命科学技术研究和开发最重要的热点和前沿。为了充分认识不可培养微生物的 丰富资源，结合现代分子生物学技术的发展，已建立起了许多不需要对微生物进行独立培 养的新方法和新技术。如变性梯度凝胶电泳（DGGE)法是将目标基因进行PCR扩增，通过对 PCR产物进行分离和鉴定分析土壤微生物群落结构的组成信息；随机扩增多态性DNA技术 (RAPD)是应用不同的随机引物在非严格的条件下进行PCR扩增，通过分析PCR产物在凝胶 电泳上的条带多态性来反映样品中微生物的多样性。
[0005] 关于土壤宏基因组学技术的构建已有许多研究报道，主要的突破在于需要足够高 质量的DNA，因此直接从土壤环境中提取和纯化DNA是其中最关键的步骤。土壤宏基因组学 技术在我国土壤及环境微生物生态学方面的研究才刚起步，对这一新技术的跟踪和应用， 将会有力地促进我国土壤微生物生态学研究的发展。因此，研究一种高效提取土壤宏基因 组DNA的试剂盒，对于大规模开展土壤宏基因组学研究显得十分必要。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种能高效、快速的基于磁珠法提取土壤微 生物DNA的试剂盒及方法。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种基于磁珠法提取土 壤微生物DNA的方法，包括如下步骤：
[0008] 土壤样品的前处理：取0. 25-lg的土壤于2ml的离心管中，加入50_150iilBuffer A, 300-900ill无菌水，300-900illBufferB，涡旋震荡 30-60s，加入 50-150illBufferC， 200-400ii1BufferD，涡旋震荡 30-60s，8000-10000g离心 2-5min，去上清得沉淀A;
[0009] 所述BufferA为pH为 4-6 的 0? 5-2M的Tris-Cl缓冲液；
[0010] 所述BufferB为0. 1-2M为包含0. 1-2M的Al3+离子的溶液；
[0011] 所述BufferC为为包含2-6M的OF离子的溶液；
[0012]所述BufferD为pH= 7-9 的 0? 1-1M的Tris-Cl缓冲液；
[0013] 土壤微生物DNA的提取：所述沉淀A加入300-400illBufferD，0? 2-lg的0? 5mm 玻璃珠，300-400iilBufferE，300-400iilBufferF，涡旋震荡l-3min，4°C温度条件下 11000-12000g离心l-3min，取 500-1000ul上清液至 1. 5ml离心管，加入 500-1000ii1 的 酚、氯仿和异戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积份数比为25:24:1，涡 旋震荡30-60s，4°C温度条件下13000-16000g离心l-3min，将上清液转移至1. 5ml离心管， 加入上清液等体积的BufferG，震荡10-30s，放置5-10min，将1. 5ml离心管放在磁力架上， 进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml离心管中加入0. 5-2mlBufferH， 打匀后室温静止5-10min，将1. 5ml离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁 珠。往含有磁珠的1. 5ml离心管中加入30-60ylBufferI，即得土壤微生物DNA溶液；
[0014] 所述BufferE为 5_15% 的SDS溶液；
[0015] 所述BufferF由以下方法配制而成：取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入 双蒸水溶解并调节pH为7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0016] 所述BufferG为4-50ml异丙醇与l-3ml磁珠混悬液的混合液，所述磁珠混悬液 由磁珠和水按照1:2体积比配置而成，所述磁珠为粒径为0. 5-2um的硅基生物磁珠；
[0017] 所述BufferH为 10-40ml的包含 10-30mMTris，5-10mMEDTA，100-200mMNacl 的溶液与50-100ml的无水乙醇混合而成；
[0018] 所述BufferI为pH为 7-8 的 6-10mMTris溶液。
[0019] 本发明的另一技术方案为提供一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒，所 述试剂盒包括如下试剂：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、BufferG、BufferH和BufferI;
[0020] 所述BufferA为pH为 4-6 的 0? 5-2M的Tris-Cl缓冲液；
[0021] 所述BufferB为0. 1-2M为包含0. 1-2M的Al3+离子的溶液；
[0022] 所述BufferC为为包含2-6M的OF离子的溶液；
[0023] 所述BufferD为pH= 7-9 的 0? 1-1M的Tris-Cl缓冲液；
[0024] 所述BufferE为 5_15% 的SDS溶液；
[0025] 所述BufferF由以下方法配制而成：取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入 双蒸水溶解并调节pH为7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0026] 所述BufferG为4_50ml异丙醇与l_3ml磁珠混悬液的混合液，所述磁珠混悬液 由磁珠和水按照1:2体积比配置而成，所述磁珠为粒径为0. 5-2um的硅基生物磁珠；
[0027] 所述BufferH为 10-40ml的包含 10-30mMTris，5-10mMEDTA，100-200mMNacl 的溶液与50-100ml的无水乙醇混合而成；
[0028] 所述BufferI为pH为 7-8 的 6-1OmMTris溶液。
[0029] 本发明的有益效果在于：本发明的基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒及方 法，是利用氢氧化铝来去除土壤中的各种杂质，再使用玻璃珠破碎土壤微生物细胞后，通过 磁珠吸附土壤微生物DNA，从而快速获得土壤微生物DNA。本发明方法所用时间短，步骤少， 能获得纯度高的土壤微生物DNA，无需再进一步纯化即可直接进行下游实验。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为利用本发明【具体实施方式】的方法对4种不同土壤样品的微生物基因组DNA 提取结果图；
[0031] 图2为本发明【具体实施方式】中4种不同土壤样品的微生物基因组16srDNA扩增 结果图。
【具体实施方式】
[0032] 为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附 图予以说明。
[0033] 本发明最关键的构思在于：利用氢氧化铝来去除土壤中的各种杂质，再使用玻璃 珠破碎土壤微生物细胞后，通过磁珠吸附土壤微生物DNA，从而快速获得土壤微生物DNA。
[0034] 实施例1
[0035] -种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，具体步骤如下：
[0036] (1)原料：新鲜水稻根际土壤，新鲜玉米根际土壤，新鲜甘蔗根际土壤，新鲜花生 根际土壤。
[0037] (2) 土壤样品的前处理：用天平称取0? 25-lg的土壤于2ml的离心管中，加入 50-150illBufferA，300-900ill无菌水，300-900illBufferB，涡旋震荡 30-60s;加入 50-150illBufferC，200-400illBufferD，涡旋震荡 30-60s;8000-10000g离心 2-5min， 去上清。前处理主要是去除腐殖质等土壤杂质，防治杂质对下游实验的影响。
[0038] (3)磁珠吸附土壤微生物DNA及洗脱：加入 300-400illBufferD，0? 2-lgO. 5mm 玻璃珠，300-400illBufferE，300-400illBufferF，涡旋震荡l-3min，4°C11000_12000g 离心l_3min。吸取500-1000ii1上清至1. 5ml离心管，加入500-1000ii1酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1)，涡旋震荡30-60s，4°C13000-16000g离心l-3min。将上清转移至1. 5ml离心管， 加入与上清液等体积的BufferG。震荡10-30s。室温放置5-10min，将离心管放在磁力架 上,进行磁珠分离。吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入0. 5-2mlBufferH，打 匀后室温静止5-10min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。吸去液体，保留磁珠。往含 有磁珠的离心管中加入30-60ylBufferI，此溶液即为土壤微生物DNA。于1-2%琼脂糖 凝胶中电泳检测。
[0039] 磁珠为硅基生物磁珠，粒径为0. 5-2um硅基生物磁珠就是指磁珠微珠表面包裹一 层硅材料来吸附核酸，选用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下 可以发生聚集或分散，从而可摆脱离心等所需的手工操作流程。不同粒径大小的磁珠，其表 面积大小不一，吸附效果不一。
[0040] BufferA溶液的配置：0? 5-2MTris-Cl(pH= 4-6);
[0041] 所述BufferB为0? 1-2M为包含0? 1-2M的A13+离子的溶液；
[0042] 所述BufferC为包含2-6M的OF离子的溶液；所述BufferB可为Al2 (S04) 3与所 述BufferC可为NaOH,他们反应生成氢氧化错吸附杂质；直接加入氢氧化错的话，因为氢氧 化铝是固状胶体，其与土壤反映不充分。先加入Al2 (S04) 3溶液，并将其与土壤溶液混匀，再 加入氢氧化钠溶液后与其反映，能更加充分地吸附土壤中的杂质；
[0043] BufferD溶液的配置：0? 1-1MTris-Cl(pH= 7-9)偏碱性缓冲液使核酸更容易从 细胞中游离出来；
[0044] BufferE溶液的配置：5_15%SDS，其作用为破碎细胞壁；
[0045] BufferF溶液的配置：称取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入适当体积的双 蒸水溶解并调节pH= 7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0046]BufferG溶液的配置：4-50ml异丙醇，l-3ml磁珠混悬液。（其中磁珠混悬液由磁 珠和水按照1:2体积比配置），结合液：其作用为使核酸与磁珠结合；
[0047]BufferH溶液的配置：10-30mmol/LTris，5-10mmol/LEDTA，100-200mmol/L Nacl的溶液10-40ml与50-100ml的无水乙醇混合配置而成。其作用为洗漆杂质；
[0048] BufferI溶液的配置：6-10mmol/LTris，PH= 7. 0-8. 0,其作用为把核酸从磁珠 中洗脱下来；
[0049] 本实施例还公开了一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒，所述试剂盒 包括上述方法中的试剂：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、 BufferG、BufferH和BufferI。
[0050] 实施例2
[0051] 一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，具体步骤如下：
[0052] 原料：新鲜水稻根际土壤，新鲜玉米根际土壤，新鲜甘蔗根际土壤，新鲜花生根际 土壤。
[0053] 土壤样品的前处理：取0. 25-lg的土壤于2ml的离心管中，加入50_150iilBuffer A, 300-900ill无菌水，300-900illBufferB，涡旋震荡 30-60s，加入 50-150illBufferC， 200-400ii1BufferD，涡旋震荡 30-60s，8000-10000g离心 2-5min，去上清得沉淀A;
[0054] 所述BufferA 为 pH为 4-6 的 0? 5-2M的Tris-Cl缓冲液；
[0055] 所述BufferB为 0? 1-1M的Al2 (S04) 3 溶液；
[0056] 所述BufferC 为 2_5M的NaOH溶液；
[0057] 所述BufferD 为 pH= 7-9 的 0? 1-1M的Tris-Cl缓冲液；
[0058] 土壤微生物DNA的提取：所述沉淀A加入300-400illBufferD，0. 2-lg的0. 5mm 玻璃珠，300-400iilBufferE，300-400iilBufferF，涡旋震荡l-3min，4°C温度条件下 11000-12000g离心l-3min，取 500-1000ul上清液至 1. 5ml离心管，加入 500-1000ii1 的 酚、氯仿和异戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积份数比为25:24:1，涡 旋震荡30-60s，4°C温度条件下13000-16000g离心l-3min，将上清液转移至1. 5ml离心管， 加入上清液等体积的BufferG，震荡10-30s，放置5-10min，将1. 5ml离心管放在磁力架上， 进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml离心管中加入0. 5-2mlBufferH， 打匀后室温静止5-10min，将1. 5ml离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁 珠。往含有磁珠的1. 5ml离心管中加入30-60ylBufferI，即得土壤微生物DNA溶液；
[0059] 所述BufferE为 5_15% 的SDS溶液；
[0060] 所述BufferF由以下方法配制而成：取2-3gLiCl，l-2gTris，3-5gEDTA，加入 双蒸水溶解并调节pH为7. 0-8. 0,定容至100ml;
[0061] 所述BufferG为4-50ml异丙醇与l-3ml磁珠混悬液的混合液，所述磁珠混悬液 由磁珠和水按照1:2体积比配置而成，所述磁珠为粒径为0. 5-2um的硅基生物磁珠；
[0062] 所述BufferH为 10-40ml的包含 10-30mMTris，5-10mMEDTA，100-200mMNacl 的溶液与50-100ml的无水乙醇混合而成；
[0063] 所述BufferI为pH为 7-8 的 6-1OmMTris溶液。
[0064] 本实施例还公开了一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒，所述试剂盒 包括上述方法中的试剂：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、 BufferG、BufferH和BufferI。
[0065] 实施例3
[0066] 本发明提供一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，该方法能通过磁珠吸附 土壤微生物DNA，从而快速获得土壤微生物DNA，利用该方法能够有效地从土壤中提取出微 生物DNA。具体步骤如下：
[0067] (1)原料：新鲜水稻根际土壤，新鲜玉米根际土壤，新鲜甘蔗根际土壤，新鲜花生 根际土壤。
[0068] (2) 土壤样品的前处理：用天平称取0. 5g的土壤于2ml的离心管中，加入100ill BufferA，600ii1 无菌水，300ii1BufferB，涡旋震荡 30s;加入 100ii1BufferC，300ii1 BufferD，润旋震荡30s;8000g离心2min，去上清。
[0069] (3)磁珠吸附土壤微生物DNA及洗脱：加入325illBufferD，0. 5g0? 5謹玻璃珠， 325illBufferE，325illBufferF，涡旋震荡lmin，，4°CllOOOg离心 2min。吸取 750ill 上清至1.51111离心管，加入750111酚：氯仿：异戊醇（25 :24:1)，涡旋震荡308,41：1600(^ 离心lmin。将上清转移至1. 5ml离心管，加入等体积的BufferG。震荡10s。室温放置 5min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中 加入lmlBufferH，打匀后室温静止8min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。吸去液 体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入50illBufferI，此溶液即为土壤微生物DNA。 于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0070] ⑷扩增土壤微生物16srDNA基因：通过PCR的方式进行土壤微生物16srDNA基 因的扩增，PCR扩增体系如下：rTaq酶0?3ia，PCRbuffer2?5ia，DNTPlia，引物Rlia， 弓丨物Fliil，土壤微生物基因组DNAliil，灭菌水18. 21110PCR扩增程序如下：95°C5min; 95°C30s，58°C30s，72°C30s，35个循环；72°C5min。将扩增得到的产物用1%琼脂糖凝 胶中电泳检测。
[0071] 磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum
[0072]BufferA溶液的配置：1MTris-Cl(pH= 5. 5)
[0073]BufferB溶液的配置：0? 2MA12 (S04) 3
[0074]BufferC溶液的配置：4MNaOH
[0075] BufferD溶液的配置：0? 1MTris-Cl(pH=8)
[0076] BufferE溶液的配置：325ii1 10%SDS
[0077] BufferF溶液的配置：称取2.416gLiCl，1.211gTris，3.506gEDTA，加入适当体 积的双蒸水溶解并调节pH= 8. 0,定容至100ml
[0078] BufferG溶液的配置：48ml异丙醇，2ml磁珠混悬液。（其中磁珠混悬液由磁珠和 水按照1:2体积比配置）
[0079]BufferH溶液的配置：20mmol/LTris, 8mmol/LEDTA，140mmol/LNacl的溶液 30ml与70ml的无水乙醇混合配置而成
[0080]BufferI溶液的配置：8mmol/LTris,PH=8. 0
[0081] 本实施例还公开了一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒包括如下试剂：BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、BufferE、BufferF、 BufferG、BufferH和BufferI;
[0082] 所述 BufferA为pH为5. 5的 1M的Tris-Cl缓冲液；
[0083] 所述 BufferB为 0? 2M的Al2 (S04) 3 溶液；
[0084] 所述BufferC为 4M的NaOH溶液；
[0085] 所述 BufferD为pH=8的0?1M的Tris-Cl缓冲液；
[0086] 所述 BufferE为 10 % 的SDS溶液；
[0087]所述BufferF由以下方法配制而成：取 2.416gLiCl，1.211gTris，3.506gEDTA， 加入双蒸水溶解并调节pH为8. 0,定容至100ml;
[0088] 所述BufferG为48ml异丙醇与2ml磁珠混悬液的混合液，所述磁珠混悬液由磁 珠和水按照1:2体积比配置而成，所述磁珠为粒径为0. 5-2um的硅基生物磁珠；
[0089]所述BufferH为 30ml的包含 20mMTris，8mMEDTA，140mMNacl的溶液与 70ml 的无水乙醇混合而成；
[0090] 所述BufferI为pH为8的8mMTris溶液。
[0091] 利用实施例3所述方法对新鲜水稻根际土壤，新鲜玉米根际土壤，新鲜甘蔗根际 土壤，新鲜花生根际土壤进行提取土壤微生物的DNA，4种不同土壤样品的微生物基因组 DNA提取结果见图1，泳道1，2, 3,4分别表示新鲜水稻根际土壤微生物基因组DNA，新鲜玉米 根际土壤微生物基因组DNA，新鲜甘蔗根际土壤微生物基因组DNA，新鲜花生根际土壤微生 物基因组DNA。从图中可看出本方法能提取到土壤微生物基因组DNA。4种不同的土壤样品 的微生物基因组的0D(260 :280)值结果见表1，4种土壤微生物基因组的0D(260 :280)值在 1. 78-1. 80范围内，从表1中可看出本方法可以提取到纯度高的土壤微生物基因组DNA。
[0092] 表 1
[0093]
【权利要求】
1. 一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤： 土壤样品的前处理：取〇.25-lg的土壤于2ml的离心管中，加入50-150 ill Buffer A， 300-900 ii 1 无菌水，300-900 ii 1 Buffer B，涡旋震荡 30-60s，加入 50-150 ii 1 Buffer C， 200-400 ii 1 Buffer D，涡旋震荡 30-60s，8000-10000g 离心 2-5min，去上清得沉淀 A ; 所述Buffer A为pH为4-6的0? 5-2M的Tris-Cl缓冲液； 所述Buffer B为0. 1-2M为包含0. 1-2M的Al3+离子的溶液； 所述Buffer C为包含2-6M的OIT离子的溶液； 所述 Buffer D 为 pH = 7-9 的 0? 1-1M 的 Tris-Cl 缓冲液； 土壤微生物DNA的提取：所述沉淀A加入300-400 ill Buffer D，0. 2-lg的0. 5mm玻 璃珠，300-400iil Buffer E，300-400iil Buffer F，涡旋震荡 l-3min，4°C 温度条件下 11000-12000g 离心 l-3min，取 500-1000ul 上清液至 1. 5ml 离心管，加入 500-1000 ii 1 的 酚、氯仿和异戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积份数比为25:24:1，涡 旋震荡30-60s，4°C温度条件下13000-16000g离心l-3min，将上清液转移至1. 5ml离心管， 加入上清液等体积的Buffer G，震荡10-30s，放置5-10min，将1. 5ml离心管放在磁力架上， 进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml离心管中加入0. 5-2mlBuffer H， 打匀后室温静止5-10min，将1. 5ml离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁 珠。往含有磁珠的1.5ml离心管中加入30-60 yl Buffer I，即得土壤微生物DNA溶液； 所述Buf f er E为5-15 %的SDS溶液； 所述Buffer F由以下方法配制而成：取2-3g LiCl，l-2g Tris，3-5g EDTA，加入双蒸 水溶解并调节pH为7. 0-8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G为4-50ml异丙醇与l-3ml磁珠混悬液的混合液，所述磁珠混悬液由磁 珠和水按照1:2体积比配置而成，所述磁珠为粒径为0. 5-2um的硅基生物磁珠； 所述 Buffer H 为 10-40ml 的包含 10-30mM Tris，5-10mM EDTA，100-200mM Nacl 的溶 液与50-100ml的无水乙醇混合而成； 所述 Buffer I 为 pH 为 7-8 的 6-1 OmM Tris 溶液。
2. 根据权利要求1所述的基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，其特征在于，包括如 下步骤： 土壤样品的前处理：取〇. 5g的土壤于2ml的离心管中，加入lOOiil Buffer A，600iil 无菌水，300 ill Buffer B，涡旋震荡 30s，加入 100 ill Buffer C，300 ill Buffer D，涡旋震 荡30s，8000g离心2min，去上清得沉淀A ; 所述Buffer A为pH为5. 5的1M的Tris-Cl缓冲液； 所述 Buffer B 为 0? 1-1M 的 Al2 (S04) 3 溶液； 所述Buf f er C为2-5M的NaOH溶液； 所述Buffer D为pH = 8的0? 1M的Tris-Cl缓冲液； 土壤微生物DNA的提取：所述沉淀A加入325 ill Buffer D，0. 5g的0. 5mm玻璃珠， 325iil Buffer E，325iil Buffer F，润旋震荡 lmin，4°C温度条件下 11000g 离心 2min，取 750ul上清液至1. 5ml离心管，加入750 yl的酚、氯仿和异戊醇酚的混合液，所述混合液 中酚、氯仿和异戊醇的体积份数比为25:24:1，涡旋震荡30s，4°C温度条件下16000g离心 lmin，将上清液转移至1. 5ml离心管，加入上清液等体积的Buffer G，震荡10s，放置5min， 将1. 5ml离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的1. 5ml离 心管中加入lmlBuffer H，打匀后室温静止8min，将1. 5ml离心管放在磁力架上，进行磁珠 分离，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的1. 5ml离心管中加入50 ill Buffer I，即得土壤 微生物DNA溶液； 所述Buf f er E为10 %的SDS溶液； 所述Buffer F由以下方法配制而成：取2.416g LiCl，1.211g Tris，3.506gEDTA，加入 双蒸水溶解并调节pH为8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G为48ml异丙醇与2ml磁珠混悬液的混合液，所述磁珠混悬液由磁珠和 水按照1:2体积比配置而成，所述磁珠为粒径为0. 5-2um的硅基生物磁珠； 所述 Buffer H 为 30ml 的包含 20mM Tris，8mM EDTA，140mM Nacl 的溶液与 70ml 的无 水乙醇混合而成； 所述Buffer I为pH为8的8mM Tris溶液。
3. -种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下 试剂：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、Buffer G、Buffer H 和 Buffer I ; 所述Buffer A为pH为4-6的0? 5-2M的Tris-Cl缓冲液； 所述Buffer B为0. 1-2M为包含0. 1-2M的Al3+离子的溶液； 所述Buffer C为包含2-6M的OIT离子的溶液； 所述 Buffer D 为 pH = 7-9 的 0? 1-1M 的 Tris-Cl 缓冲液； 所述Buf f er E为5-15 %的SDS溶液； 所述Buffer F由以下方法配制而成：取2-3g LiCl，l-2g Tris，3-5g EDTA，加入双蒸 水溶解并调节pH为7. 0-8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G为4-50ml异丙醇与l-3ml磁珠混悬液的混合液，所述磁珠混悬液由磁 珠和水按照1:2体积比配置而成，所述磁珠为粒径为0. 5-2um的硅基生物磁珠； 所述 Buffer H 为 10-40ml 的包含 10-30mM Tris，5-10mM EDTA，100-200mM Nacl 的溶 液与50-100ml的无水乙醇混合而成； 所述 Buffer I 为 pH 为 7-8 的 6-1 OmM Tris 溶液。
4. 根据权利要求3所述的基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒包括如下试剂：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、 Buffer G、Buffer H 和 Buffer I ; 所述Buffer A为pH为5. 5的1M的Tris-Cl缓冲液； 所述 Buffer B 为 0? 2M 的 Al2 (S04) 3 溶液； 所述Buf f er C为4M的NaOH溶液； 所述Buffer D为pH = 8的0? 1M的Tris-Cl缓冲液； 所述Buf f er E为10 %的SDS溶液； 所述 Buffer F 由以下方法配制而成：取 2.416g LiCl，1.211g Tris，3.506g EDTA，力口 入双蒸水溶解并调节pH为8. 0,定容至100ml ; 所述Buffer G为48ml异丙醇与2ml磁珠混悬液的混合液，所述磁珠混悬液由磁珠和 水按照1:2体积比配置而成，所述磁珠为粒径为0. 5-2um的硅基生物磁珠； 所述 Buffer H 为 30ml 的包含 20mM Tris，8mM EDTA，140mM Nacl 的溶液与 70ml 的无 水乙醇混合而成； 所述Buffer I为pH为8的8mM Tris溶液。
【文档编号】C12N15/10GK104328110SQ201410581883
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】王清水, 余彦 申请人:福建师范大学