一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法，其包括以下步骤：1)培养原代肝细胞；2)将所述原代肝细胞分成三组，分别为加入待测药物的组、加入待测药物和胆酸类化合物混合物的组、以及阴性对照组；3)分别检测培养基中的ALT/AST/LDH含量和尿素含量，并通过尿素含量计算尿素生成量；4)将三组培养基中的ALT/AST/LDH含量、尿素含量或尿素生成量进行比较，评估待测药物肝毒性。所述方法利用双层胶原三维培养技术来模拟体内环境，诱导肝细胞形成肝板样结构和胆小管网络，在培养过程中维持肝细胞的生物学功能，同时加入胆酸类化合物以模拟体内肝细胞所处环境，从而对药物进行肝毒性筛选。
【专利说明】一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养和生化指标监测领域，涉及一种药物肝毒性评估方法，尤其 涉及一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法
【背景技术】
[0002] 肝脏是人体重要器官，负责代谢、解毒、凝血、免疫等多种生理功能。而在药物使用 过程中，药物及/或其代谢产物可能导致肝脏损伤，称为药物性肝损伤（DILI)。DILI是过 去50年药物因为安全性撤市最常见的原因，即使未撤市，药物的肝毒性也会限制很多药物 的临床应用。由于多数药物导致严重DILI的机率很低1/10000)，所以在临床实验阶段 常常无法被识别出，成为困扰制药公司的难题。
[0003] 通常研究人员主要利用LDH渗漏、白蛋白分泌、尿素生成等指标对药物是否会导 致细胞模型或动物模型的肝损伤进行筛选。然而，物种差异有可能对肝毒性判断产生影响， 在人体中引起严重DILI的药物并未在动物试验中显示明确的肝毒性，一般也未显示剂量 相关性毒性，很多导致严重肝毒性的药物在动物模型上却无毒性。同时有明显细胞毒性的 候选药物在研发早期即会被排除，在临床或上市阶段导致严重DILI的药物往往并不会直 接导致细胞毒性。临床实验时对能导致AST或ALT超出正常范围值三倍以上的药物会特 别加以注意，因为他们可能导致严重的肝损伤，但如果直接测试药物对原代培养肝细胞的 毒性，往往会忽略那些服药后导致肝脏中胆酸盐、胆红素浓度升高，从而造成肝脏损伤的药 物。而且临床导致DILI的药物常常耐受性良好，但由于个体易感性不同，可能在极少数人 群中才会产生肝损伤。由此可见，现存的药物肝毒性检测方法并不能完全反映药物实际的 肝损伤指数，本领域急需一种可准确评估药物的肝毒性的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提出一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法，其利用双层胶原 三维培养技术来模拟体内环境，诱导肝细胞形成肝板样结构和胆小管网络，在培养过程中 维持肝细胞的生物学功能，以此为平台，对药物进行肝毒性筛选。
[0005] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] -种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法，其包括以下步骤：
[0007] 1)培养原代肝细胞；
[0008] 2)将所述原代肝细胞分成三组，分别为加入待测药物的组、加入待测药物和胆酸 类化合物混合物的组、以及阴性对照组；
[0009] 3)分别检测培养基中的丙氨酸氨基转移酶（ALT)/天门冬氨酸氨基转移酶（AST)/ 乳酸脱氢酶（LDH)含量和尿素含量，并通过尿素含量计算尿素生成量；
[0010] 4)将三组培养基中的ALT/AST/LDH含量或尿素生成量进行比较，评估待测药物肝 毒性。
[0011] 本发明所述的方法首先进行肝细胞模型构建，所用的肝模型可包括以各种培养方 式构建的肝细胞模型，如悬浮培养、贴壁培养以及三维培养。然而三维培养方式可构建肝胆 小管模型，能更有利地评估药物肝毒性。
[0012] 因此，在步骤1)中，所述培养为双层胶原三维培养，其诱导肝细胞形成肝板样结 构和胆小管网络。所述双层胶原三维培养技术为在胶原上加入含有5% -10%胎牛血清的 培养基，再加入不含血清、含matrigel和/或胶原的培养基，形成夹心结构进行培养。优 选地，加入含有5% -10%胎牛血清的培养基后培育2-6h。
[0013] 所述原代肝细胞为从人肝组织分离的细胞或动物肝细胞，所述动物包括大鼠、小 鼠、狗、猪、猫、牛、羊、鸡、马、鹅、鸭和灵长类，所述灵长类包括猿、树駒和猴；优选地，细胞的 制备是经两步胶原灌流法消化制备得到。
[0014] 优选地，考虑到物种的差异性，选择人肝细胞作为原代干细胞进行肝细胞模型构 建，可特别地形成具有胆管网络的人肝细胞三维培养模型。另外，考虑到人的个体差异，应 采用> 3个的不同供体的人肝细胞来进行相同实验条件下的肝毒性评估，以此减少个体差 异产生的误差。
[0015] 所述药物作用前细胞培养时间为1-4天，培养第1天至第4天，三维结构逐渐完 善，以形成肝板样结构和胆小管网络。
[0016] 在步骤2)中，所培养的肝细胞贴壁后，即可加入待测药物、胆酸类化合物或对照 品。所述胆酸类化合物为甘氨鹅脱氧胆酸GCDCA、鹅去氧胆酸CDCA、甘氨脱氧胆酸GDCAJA 氧胆酸DCA、甘氨胆酸GCA的游离酸或其无机盐；所述无机盐优选为钠盐；优选地，加入各物 质后培养时间为1-3天。
[0017] 现有方法大多直接测试药物对原代培养肝细胞的毒性，往往会忽略那些服药后导 致肝脏中胆酸盐、胆红素浓度升高，从而造成肝脏损伤的药物。本发明检测培养体系中加入 了胆酸类化合物，能模拟体内肝细胞所处环境。为确定体系中合适的胆酸类化合物的浓度， 本发明采用一系列不同浓度的胆酸类化合物作用于人肝细胞，以尿素生成量为指标计算各 种胆酸类化合物的IC 5tl值：
[0018]
【权利要求】
1. 一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 培养原代肝细胞； 2) 将所述原代肝细胞分成三组，分别为加入待测药物的组、加入待测药物和胆酸类化 合物混合物的组、以及阴性对照组； 3) 分别检测培养基中的ALT/AST/LDH含量和尿素含量，并通过尿素含量计算尿素生成 量； 4) 将三组培养基中的ALT/AST/LDH含量或尿素生成量进行比较，评估待测药物肝毒 性。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述培养为双层胶原三维培 养，其诱导肝细胞形成肝板样结构和胆小管网络； 优选地，所述原代肝细胞为从人肝组织分离的细胞或动物肝细胞，所述动物包括大鼠、 小鼠、狗、猪、猫、牛、羊、鸡、马、鹅、鸭和灵长类，所述灵长类包括猿、树駒和猴； 优选地，所述培养原代肝细胞的时间为1-4天。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述双层胶原三维培养技术为在胶原上 加入含有5% -10%胎牛血清的培养基使肝细胞贴壁，再换成不含血清、含matrigel和/或 胶原的培养基，以形成夹心结构进行培养。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，加入含有5% -10%胎牛血清培养基后培 育 2-6h。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述胆酸类化合物为甘氨鹅 脱氧胆酸GCDCA、鹅去氧胆酸CDCA、脱氧胆酸DCA、甘氨胆酸GCA和甘氨脱氧胆酸GDCA的游 离酸或其无机盐； 优选地，所述无机盐为钠盐； 优选地，加入各物质后培养时间为1-3天。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述胆酸类化合物在体系中的浓度为：
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述检测ALT/AST/LDH含量 为在检测前进行培养基更换，检测被取出的培养基中的ALT/AST/LDH含量； 优选地，使用全自动生化分析仪检测ALT/AST/LDH含量； 优选地，所述检测尿素含量包括：在检测前进行培养基更换，检测被取出的培养基中的 尿素含量，或者所述步骤2)的培养后加入空白培养基培养1小时后检测培养基中的尿素含 量； 优选地，使用二乙酰一肟法检测尿素含量。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述比较为将加入待测药物 的组、加入待测药物和胆酸类化合物混合物的组同阴性对照组的ALT/AST/LDH含量和尿素 生成量进行比较。
9. 根据权利要求1-8所述的方法在检测药物肝毒性中的应用。
【文档编号】C12Q1/32GK104388536SQ201410581692
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】龙娜, 张飞鹏, 张素行, 吕雪琴, 陈涛, 张科之, 喻红 申请人:广东中西达一新药开发有限公司