一种托桂型菊花花器性状关联分子标记筛选方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，提供一种托桂型菊花花器特性QTL分子标记筛选方法，该种方法可用于托桂型菊花花器性状优良基因的定位和克隆及托桂型菊花新品种的培育。包括：1.试验材料及其表型数据的获得；2.菊花连锁图谱构建；3.结合表型数据和分子遗传图谱，进行托桂型菊花花器性状的QTL分析；4.托桂型菊花花器性状关联分子标记的确定。本发明以托桂型秋菊品种“QX-053”为母本和非托桂型秋菊品种“南农惊艳”为父本杂交获得的160株F1分离群体为试材，获得了多个与托桂型菊花花器性状显著关联的分子标记。托桂型菊花花器性状关联分子标记的获得，可用于托桂型菊花花器性状的优良基因的精细定位和克隆，大大提高选择效率，从而加快托桂型菊花育种进程。
【专利说明】一种托桂型菊花花器性状关联分子标记筛选方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种托桂型菊花花器特性QTL分子标记筛选方 法，该种方法可用于托桂型菊花花器性状优良基因的定位和克隆及托桂型菊花新品种的培 育。
【背景技术】
[0002] 菊花（Chrysanthemum morifolium)原产我国，是我国十大传统名花和世界四大切 花之一。菊花花型、花色、株型等极其丰富，是盆栽、切花和园林地被应用的重要花卉种类， 具有很高的观赏和应用价值，在花卉生产中占有十分重要的地位。菊花根据花序直径可分 为小菊和大菊，小菊按花型又分为单瓣、复瓣、蜂窝和托桂型。托桂型小菊舌状花中平瓣、匙 瓣、管瓣皆有，中央盘状花发达，所有管状小花全部伸长，顶端花冠筒开裂犹如托起的桂花， 因此托桂花型菊花的管状花又被称为桂瓣，其像舌状花一样有着丰富多彩的颜色。
[0003] 花器是菊花观赏性状中最直观的外在表现。之前国内关于菊花花器性状的遗传研 究主要集中在对杂交后代群体数据平均值的经验性总结。而国外的菊花相关报道也主要是 围绕花器性状在不同资源之间的遗传变异进行遗传研究。这些研究在一定程度上推动了菊 花遗传育种的进程。然而由于菊花育种目标多为数量性状，所以需要借助QTL定位来明确 表现型与基因型的对应关系，这将对提高目标数量性状的遗传能力具有极为重要的意义。
[0004] 近年来，数量性状基因定位（QTL)基于PCR的分子标记方法正在不断增加，其中 SRAP(sequence_related amplified polymorphism,基于序列扩增多态性）和 SSR(simple sequence repeat,微卫星又称简单重复序列）标记，由于多态性高、成本较低、操作简单、 结果稳定、分布均匀、共显性等优点，目前已经成为非常适用的分子标记，在辅助育种、构建 连锁遗传图谱、基因定位、基因克隆等研究中广泛使用。迄今为止，已有关于SRAP和SSR在 观赏植物中的研究报道，其中SRAP最早是在芸苔属植物中被开发利用，现在已广泛应用于 各种观赏植物中。而SSR标记，目前主要应用在粮食作物（水稻、玉米、小麦）、果树（苹果、 李）等植物中，而在观赏植物中应用较少。
[0005] 随着分子标记技术的发展，连锁遗传图谱构建与数量性状基因定位 (quantitative trait loci, QTL)研究已经在月季、杜胃$、百合、康乃馨等许多观赏植物中 陆续展开。而菊花作为世界著名观赏植物之一。目前，因其基因组构成复杂以及高度杂 合性、高度自交不亲和性与近交衰退现象，致使其性状的遗传改良进展比较缓慢。目前， "双-假测交"作图策略不仅在很多观赏植物中有相关报道，而且还在很多高度杂合的林木、 果树和草坪中广泛应用。因此，对于具有高度杂合性的菊花来说，"双-假测交"作图策略应 用前景广阔。目前，关于菊花观赏性状相关的分子标记位点也有相关报道，然而国内外尚无 关于托桂型菊花花器性状基因定位的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对目前托桂型菊花花器性状优异基因定位和克隆的研究在国 内外研究薄弱这一现状，提供了一种托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法。筛选 出一个或多个与托桂型菊花花器性状基因紧密关联的分子标记，建立托桂型菊花花器性状 分子标记辅助选择体系，为托桂型菊花新品种选育奠定基础。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0008] 1.本发明提供一种托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，该方法包括如 下步骤：
[0009] 2)试验材料及其表型数据的获得：
[0010] 试验材料为保存于南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"的菊花品种；第一 年选择花器表型差异明显的托桂型和非托桂型秋菊品种进行人工杂交，获得F 1杂交种子， 次年3月初经穴盘点播，连同亲本扦插苗于4月中下旬各株系标号后定植于菊花圃地，常规 管理同大田；分别于第二年和第三年秋季生殖生长初期调查双亲与F 1代植株的花器相关性 状，每个株系5个单株重复，每个单株调查1个花序，并计算两年性状调查的平均值；利用 Microsoft Excel 2007软件和SPSS 18. 0软件对两个年份的花器相关性状的表型数据分 别进行基本描述性数统计分析；
[0011] 2)菊花连锁图谱构建：
[0012] ①提取亲本及其F1杂交后代基因组DNA ;
[0013] ②利用亲本和8 -10个杂交F1代单株对SRAP和SSR引物组合进行多态性筛选， 将筛选出的多态性引物组合用于F 1代作图群体的多态性扩增并统计扩增后的多态性条带 数据；
[0014] ③采用Joinmap 3. 0软件的'CP作图模型'，设置LOD彡3. 0,分别对双亲的分离位 点进行连锁分析，将重组率转换成遗传距离，获得双亲的分子标记连锁群，根据连锁分析结 果制作连锁遗传图谱；
[0015] 3)托桂型菊花花器性状的QTL定位：
[0016] 结合表型数据和连锁遗传图谱，运用复合区间作图法进行托桂型菊花花器性状的 QTL分析，绘制QTL分布图，并估算各QTL的加性效应及其对表型变异的贡献率；
[0017] 4)菊花花器性状关联分子标记的确定：
[0018] 根据步骤3)所得的主效QTL所在的标记区间即可确定与托桂型菊花花器性状紧 密关联的分子标记。
[0019] 2.上述1提供的一种托桂型菊花花器性状关联分子标记的获得方法，其中，步骤 1)中所述的所选择的杂交亲本间的花器表型性状要存在足够大的差异，主要表现在：杂交 亲本一个是托桂花型，一个是非托桂花型，这样QTL位点才有可能在分离群体中被检测到， 这种选择不仅局限在表型上的差异，更重要的是遗传上的差异。
[0020] 3.上述1提供的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其中，步骤2)中 所述的所采用的分子标记是显性标记SRAP和共显性标记SSR相结合。
[0021] 4.上述1提供的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其中，步骤3)中 所述的主效QTL是至少2年重复出现并且对表型变异的贡献率大于10%的QTL。
[0022] 5.上述1提供的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其中，步骤2)扩 增后的多态性条带数据统计方法：按照"有"记为" 1"，"无"记为"〇"的原则对清晰易辨的 多态性SSR和SRAP扩增位点进行统计；
[0023] 分子标记的命名方式：以引物名称作为多态性位点的名称，如果同一个引物扩增 出多个多态性位点，则在引物或引物组合名称加上该条标记的分子量大小，分子量大小由 软件Quantity one估算；根据"双-假测交"作图策略，将多态性标记位点按照其分离类型 分为两大类，即出现在杂交母本和父本中的多态性标记位点分别为"Q+QN"和"N+QN"两种 类型。
[0024] 6.上述1提供的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其中，连锁遗传 图谱的绘制方法：对该两种类型的分子标记数据："Q+QN"和"N+QN"采用Joinmap v3. 0软 件，选用'CP作图模型'，设置LOD彡3. 0,采用Kosambi法将重组率转换成遗传距离，以cM 表示距离，分别进行连锁分析，根据连锁分析结果采用MapChart v2. 2软件制作遗传图谱。
[0025] 7.上述1提供的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其中，QTL定位方 法：以菊花连锁遗传图谱为基础，运用WinQTL5. 0软件及复合区间作图法对菊花花器性状 的观测数据进行QTL检测，利用MapChart v2. 2软件绘制QTL分布图，并估算各QTL的加性 效应及其对表型变异的贡献率等遗传参数；相关运行参数如下：Walk speed = 2cM;Window size = 10. 00 ;Model = 6,取LOD阈值为2. 5,当LOD峰值大于2. 5时即可确定该处存在一 个显著QTL位点，置信区间根据LOD值的峰值两侧各下降1个LOD值来确定；
[0026] QTL命名：首字母大写的性状英文缩写名称+以E1，E2代表不同环境+连锁群的序 号或者首字母大写的性状英文缩写名称+以El，E2代表不同环境+连锁群的序号+QTL的 序号。
[0027] 8.权利要求1所述的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其特征在 于：根据步骤4)获得的托桂型菊花花器性状关联分子标记，两年间共计检测到4对受环 境影响较小贡献率较大的主效QTL，分别为控制心花直径的CfdElQl-I (CfdE2Ql)，关联分 子标记为SSR34-255 ;控制心花直径的另一个QTL: Cf dEIQ2 (Cf dE2Q2)，关联分子标记为 M20E17-88 ;控制管状花长的TflElQl (TflE2Ql)，关联分子标记为SSR35-77 ;以及控制管 状花宽的TfVElQl-I (TfVE2Ql)，关联分子标记为SSR34-255,其对表型变异的贡献率均在 10%以上，是较稳定的主效基因。此外，还检测到27个受环境影响的贡献率均在10%以上 QTLs和1个受环境影响较大的微效多基因
[0028] 9.本发明还提供上述2-8任一项提供的筛选方法在托桂型菊花新品种培育上的 应用。
[0029] 10.本发明还提供2-8任一项所述的筛选方法获得的托桂型菊花花器性状关联分 子标记在托桂型菊花新品种培育上的应用。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 本发明以托桂型菊花品种'QX-053'和非托桂型菊花品种'南农惊艳'及其160个 F1代单株作为作图群体，同时利用SRAP和SSR标记构建连锁遗传图谱，对10个花器性状进 行QTL分析，获得与托桂型菊花花器性状相关的QTL及与其紧密关联的分子标记。与目前 技术相比，其优点是：
[0032] (I) SSR标记为共显性标记，多态性好，重复性高，覆盖整个基因组，具有多等位基 因的特性，是构建遗传连锁图谱较理想的分子标记。SRAP标记的正反引物分别针对基因组 的内含子和外显子区域设计，与SSR标记的扩增区域互补，可以作为SSR标记补充标记，有 效地增加图谱的密度和基因组覆盖率，其多态性和效价比（产生多态性的效率/成本）都 很1?。
[0033] (2)分子标记辅助育种，克服托桂型菊花花器性状优良基因型鉴定时期晚的问题。 选择范围更广，强度更大。菊花的常规选育方法周期长，费时又费力。通过本发明构建了托 桂型菊花的遗传连锁图谱，实现了托桂型菊花花器性状的QTL定位。
[0034] 花器是菊花观赏性状中最直观的外在表现，也是菊花育种的主要目标之一。进一 步理解托桂型菊花花器性状的遗传基础，检测与托桂型菊花花器性状相关的QTL，为托桂型 菊花花器性状的分子标记辅助育种的深入研究创造条件。本发明将获得的与托桂型菊花花 器性状相关联的分子标记，为托桂型菊花新品种选育、托桂型菊花花器相关基因的精确定 位和克隆奠定理论基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1托桂型菊花'QX-053'和非托桂型菊花'南农惊艳'的花部形态。A : 'QX-053' 的花序形态；B : 'QX-053'的舌状花形态，高度管状化；C : 'QX-053'的管状花形态，桂瓣；D : 'QX-053'的花柱形态；E : '南农惊艳'的花序形态；F : '南农惊艳'的舌状花形态；G : '南农 惊艳'的管状花形态；H : '南农惊艳'的花柱形态。标尺：A和E :20mm ;B、C和F :5mm ;D、G和 H ： 1mmη
[0036] 图2基于SRAP和SSR测交标记位点的菊花品种' QX-053 '的连锁遗传图谱。 Q1-Q43 :母本'QX-053'的第1个至第43个连锁群。
[0037] 图3基于SRAP和SSR测交标记位点的菊花品种'南农惊艳'的连锁遗传图谱。 N1-N50 :父本'南农惊艳'的第1个至第50个连锁群。
[0038] 图4与托桂型菊花主要花器性状显著相关联的QTL。Q1-Q3:母本'QX-053'的第 1至第3个连锁群；Nl-Nll :父本"南农惊艳"的第1至11个连锁群。连锁群所标记的实心 方框代表2012年（El)表型数据在连锁群上检测到的关于各个花器表型性状的QTL ;虚心 方框代表2013年（E2)表型数据在连锁群上检测到的关于各个花器表型性状的QTL。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段。
[0040] 实施例1
[0041] (一）试验材料及其表型数据的获得
[0042] 试验材料为保存于南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"的托桂型秋菊品 种'QX-053'（作母本）和非托桂型秋菊品种'南农惊艳'（作父本），如果其他同行需要， 南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"可向国内单位提供这些种质资源。经多年无 性繁殖栽培鉴定，性状表现稳定，且两品种的花器表型差异明显。2011年秋进行杂交试验， 选取母本'QX-053'发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，用硫酸纸袋套袋，同时将父本 '南农惊艳'的花序套袋。待母本柱头伸出并开叉呈'Y'状和分泌黏液时，收集已套袋父本 的新鲜花粉，用毛笔对母本进行授粉、套袋，次日重复授粉。当花梗变黄枯萎时采集授粉花 序，脱粒，获得160粒F 1杂交种子，次年3月初经穴盘点播，连同亲本扦插苗分别于2012和 2013年4月中下旬各株系标号定植于菊花圃地，常规管理同大田。
[0043] 于2012和2013年秋季生殖生长初期调查双亲与F1代植株的花器相关性状，包括 花径、心花直径、舌状花数、舌状花长、舌状花宽、管状花数、管状花长、管状花宽、最深齿裂 长和花柱长10个性状，每个株系5个单株重复，每个单株调查1个花序，并计算两年性状 调查的平均值。具体测量方法参照李鸿渐（《中国菊花》，1993)的方法。利用Microsoft Excel 2007软件和SPSS 18. 0软件对两个年份的托桂型菊花花器性状的表型数据分别进 行基本描述性统计分析（见表1)。
[0044] 表1菊花品种'QX-053'，'南农惊艳'及其F1群体花器性状在2012、2013年度描 述性数据
[0045]
【权利要求】
1. 一种托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其特征在于：该方法包括如下 步骤： 1) 试验材料及其表型数据的获得： 试验材料为保存于南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"的菊花品种；第一年 选择花器表型差异明显的托桂型和非托桂型秋菊品种进行人工杂交，获得F1杂交种子，次 年3月初经穴盘点播，连同亲本扦插苗于4月中下旬各株系标号后定植于菊花圃地，常规 管理同大田；分别于第二年和第三年秋季生殖生长初期调查双亲与F 1代植株的花器相关性 状，每个株系5个单株重复，每个单株调查1个花序，并计算两年性状调查的平均值；利用 Microsoft Excel 2007软件和SPSS 18. O软件对两个年份的花器相关性状的表型数据分 别进行基本描述性数统计分析； 2) 菊花连锁图谱构建： ① 提取亲本及其F1杂交后代基因组DNA ; ② 利用亲本和8 -10个杂交F1代单株对SRAP和SSR引物组合进行多态性筛选，将筛选 出的多态性引物组合用于F 1代作图群体的多态性扩增并统计扩增后的多态性条带数据； ③ 采用Joinmap 3. 0软件的'CP作图模型'，设置LOD彡3. 0,分别对双亲的分离位点进 行连锁分析，将重组率转换成遗传距离，获得双亲的分子标记连锁群，根据连锁分析结果制 作连锁遗传图谱； 3) 托桂型菊花花器性状的QTL定位： 结合表型数据和连锁遗传图谱，运用复合区间作图法进行托桂型菊花花器性状的QTL 分析，绘制QTL分布图，并估算各QTL的加性效应及其对表型变异的贡献率； 4) 菊花花器性状关联分子标记的确定： 根据步骤3)所得的主效QTL所在的标记区间即可确定与托桂型菊花花器性状紧密关 联的分子标记。
2. 根据权利要求1所述的一种托桂型菊花花器性状关联分子标记的获得方法，其特征 在于步骤1)中所述的所选择的杂交亲本间的花器表型性状要存在足够大的差异，主要表 现在：杂交亲本一个是托桂花型，一个是非托桂花型，这样QTL位点才有可能在分离群体中 被检测到，这种选择不仅局限在表型上的差异，更重要的是遗传上的差异。
3. 根据权利要求1所述的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其特征在于 步骤2)中所述的所采用的分子标记是显性标记SRAP和共显性标记SSR相结合。
4. 根据权利要求1所述的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其特征在 于：步骤3)中所述的主效QTL是至少2年重复出现并且对表型变异的贡献率大于10%的 QTL。
5. 权利要求1所述的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其特征在于：步 骤2)扩增后的多态性条带数据统计方法：按照"有"记为" 1"，"无"记为"0"的原则对清晰 易辨的多态性SSR和SRAP扩增位点进行统计； 分子标记的命名方式：以引物名称作为多态性位点的名称，如果同一个引物扩增出多 个多态性位点，则在引物或引物组合名称加上该条标记的分子量大小，分子量大小由软件 Quantity one估算；根据"双-假测交"作图策略，将多态性标记位点按照其分离类型分为 两大类，即出现在杂交母本和父本中的多态性标记位点分别为"Q+QN"和"N+QN"两种类型。
6. 权利要求1所述的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其特征在于：连 锁遗传图谱的绘制方法：对该两种类型的分子标记数据："Q+QN"和"N+QN"采用Joinmap v3. 0软件，选用'CP作图模型'，设置LOD > 3. 0,采用Kosambi法将重组率转换成遗传距离， 以cM表示距离，分别进行连锁分析，根据连锁分析结果采用MapChart v2. 2软件制作遗传 图谱。
7. 权利要求1所述的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其特征在于：QTL 定位方法：以菊花连锁遗传图谱为基础，运用WinQTL5. 0软件及复合区间作图法对菊花花 器性状的观测数据进行QTL检测，利用MapChart v2. 2软件绘制QTL分布图，并估算各QTL 的加性效应及其对表型变异的贡献率等遗传参数；相关运行参数如下：Walk speed = 2cM ; Window size = 10. 00 ;Model = 6,取LOD阈值为2. 5,当LOD峰值大于2. 5时即可确定该 处存在一个显著QTL位点，置信区间根据LOD值的峰值两侧各下降1个LOD值来确定； QTL命名：首字母大写的性状英文缩写名称+以El，E2代表不同环境+连锁群的序号 或者首字母大写的性状英文缩写名称+以El，E2代表不同环境+连锁群的序号+QTL的序 号。
8. 权利要求1所述的托桂型菊花花器性状关联分子标记的筛选方法，其特征在于：根 据步骤4)获得的托桂型菊花花器性状关联分子标记，两年间共计检测到4对受环境影响较 小贡献率较大的主效QTL，分别为控制心花直径的CfdElQl-I (CfdE2Ql)，关联分子标记为 SSR34-255 ;控制心花直径的另一个QTL:CfdElQ2 (CfdE2Q2)，关联分子标记为M20E17-88 ; 控制管状花长的TflElQl(TflE2Ql)，关联分子标记为SSR35-77 ;以及控制管状花宽的 TfVElQl-I (TfwE2Ql)，关联分子标记为SSR34-255,其对表型变异的贡献率均在10 %以上， 是较稳定的主效基因。此外，还检测到27个受环境影响的贡献率均在10%以上QTLs和1 个受环境影响较大的微效多基因。
9. 权利要求2-8任一项所述的筛选方法在托桂型菊花新品种培育上的应用。
10. 由权利要求2-8任一项所述的筛选方法获得的托桂型菊花花器性状关联分子标记 在托桂型菊花新品种培育上的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104313155SQ201410581350
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】陈素梅, 唐海强, 种昕冉, 张飞, 陈发棣, 王海滨, 房伟民, 蒋甲福 申请人:南京农业大学