APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用引物、试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用引物、试剂盒及检测方法。本方法根据GenBank中上述4种病原体的基因保守序列，设计了4对PCR特异性引物，利用优化的多重PCR体系同时检测APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV4种猪病病原中的一种或多种，对其他常见病原的基因组无特异性扩增，检测病原基因组最低浓度可达到pg级。该试剂盒包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水。该发明能在3h内完成对待检样品中的APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV四种病原的单一或混合感染的检测，且操作简便、快捷、结果准确，灵敏度高。
【专利说明】APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用引物、试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV多重PCR检测用检测用引物、试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002]猪呼吸道疾病综合征(PRDC)就是由病毒、细菌、支原体、寄生虫、环境因素、断奶转群应激和猪体免疫力低下等多种因素引起的猪呼吸道疾病的总称。临床表现为发热、咳嗽、气喘、呼吸困难、腹式呼吸、眼鼻分泌物增多、厌食、迅速消瘦、被毛粗乱，可发生突然死亡。该病发病率可达60%，病死率为20%-90%。在仔猪断奶后，特别是18-20周龄的育成猪，临床症状尤为明显，对猪群危害十分严重。该病已成为影响全球养猪业的重大疾病之一，近几年在我国部分地区的猪场也迅速蔓延开来，严重制约着我国养猪业的健康发展。其中，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒等均为常见的PRDC原发性病原体，临床症状极为相似难以区分，而且往往表现为混合感染。目前，现有的检测APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV的方法主要依靠病理解剖、病原菌分离、血清学方法等传统的方法，其操作繁杂、费时费力、敏感性低，难以直接分辨出APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV四种病菌。因此，急需建立一种快速、敏感、方便的特异性检测方法应对日趋复杂的猪混合病原体感染的检测。多重PCR是一种利用多条特异性引物在同一PCR反应体系中同时扩增出多个核酸片段的方法，具有操作简单、快速、特异性和敏感性高等优点，并在动物病原检测中被广泛应用。
【发明内容】
[0003]为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一套猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒四重PCR检测的引物以及试剂盒。第二个目的是提供使用该引物用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒的四重PCR检测的方法。
[0004]为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案:根据GenBank发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒的保守基因核苷酸序列，用软件Primer Primer 5.0软件设计引物并进行BLAST序列比对初步验证引物特异性，其引物如下:
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR特异性上游引物，其DNA序列为APP SEQ N0.1 ；
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR特异性下游引物，其DNA序列为APP SEQ N0.2 ；
猪肺炎支原体的PCR特异性上游引物，其DNA序列为M.hyo SEQ N0.3 ；
猪肺炎支原体的PCR特异性下游引物，其DNA序列为M.hyo SEQ N0.4 ；
猪圆环病毒2型的PCR特异性上游引物，其DNA序列为PCV-2 SEQ N0.5 ； 猪圆环病毒2型的PCR特异性下游引物，其DNA序列为PCV-2 SEQ N0.6 ；
猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR特异性上游引物，其DNA序列为PRRSV SEQ N0.7 ； 猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR特异性下游引物，其DNA序列为PRRSV SEQ N0.8。
[0005]本发明提供的PCR检测用试剂盒包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成:
DNA 序列为 APP SEQ N0.1 的 20 μ mol/L 的 APP 上游引物 0.25 μ L ;
DNA 序列为 APP SEQ N0.2 的 20 μ mol/L 的 APP 下游引物 0.25 μ L ;
DNA 序列为 M.hyo SEQ N0.3 的 20 μ mol/L 的 M.hyo 上游引物 0.25 μ L ；
DNA 序列为 M.hyo SEQ N0.4 的 20 μ mol/L 的 M.hyo 下游引物 0.25 μ L ；
DNA 序列为 PCV-2 SEQ N0.5 的 20 μ mol/L 的 PCV-2 上游引物 0.25 μ L ；
DNA 序列为 PCV-2 SEQ N0.6 的 20 μ mol/L 的 PCV-2 下游引物 0.25 μ L ；
DNA 序列为 PRRSV SEQ N0.7 的 20 μ mol/L 的 PRRSV 上游引物 0.25 μ L ;
DNA 序列为 PRRSV SEQ N0.8 的 20 μ mol/L 的 PRRSV 下游引物 0.25 μ L ;
2XPremix Ex Taq 缓冲液 12.5μ?;
灭菌去尚子水9.5 μ L ;
合计24 μ L,为单次反应的用量；
所述阳性对照管，管内为阳性猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、阳性猪肺炎支原体、阳性猪圆环病毒2型及阳性猪繁殖与呼吸综合征病毒的重组质粒DNA，体积为20 μ L ;
所述阴性对照管，管内为无猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪组织基因组DNA，体积为20 μ L ;
所述灭菌去离子水管lmL?2mL。
[0006]为了实现上述第二目的本发明采用如下技术方案，本发明提供的检测方法包括如下步骤:
1)制备待检模板DNA:选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA，获得待检模板DNA ；
2)扩增反应体系为:24μ L扩增反应液；1 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为25 μ L;
3)多重PCR扩增:将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件:预变性94.0°C 5 min ；94.0 °C 变性30 s，58.0°C?61.0°C 退火 30 s,72.0 °C 延伸 30 s，35个循环；72.0 V延伸7min ；4.0 °C保存；
4)结果判定:2%琼脂糖凝胶结果判定，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性分别在107bp、176bp、337bp及225bp处出现特异性扩增条带。
[0007]本发明的原理是:针对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的基因组的保守序列，设计特异性强、退火温度相似、彼此无互补序列的引物。在同一 PCR反应体系中同时扩增出上述4个目标基因。因这四种扩增片段大小不同，直接通过琼脂糖凝胶电泳中就可以加以区分。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。
[0008]多重PCR是一种利用多条特异性引物在同一 PCR反应体系中同时扩增出多个核酸片段的方法，具有操作简单、快速、特异性和敏感性高等优点，并在动物病原诊断中被广泛应用。避免了传统方法(病理解剖、病原菌分离、血清学方法等)操作繁杂、费时费力、敏感性低的问题。
[0009]本发明的优点是(1)、不需要特殊试剂与设备；(2)、高特异性:利用病原菌基因组的保守序列，设计特异性引物，可根据扩增与否判断靶标物质的存在与否；(3)、快速、高效:检测时间3 h左右；(4)、灵敏度闻:最低检测极限达到320 pg /uL;(5)、成本低:主要花费就是基因组的提取；(6)、用途:可用于畜产品及其相关产品的快速检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为单重及四重PCR扩增结果图；
图2为四重PCR退火温度优化结果图；
图3为四重PCR特异性试验结果图；
图4为四重PCR灵敏度试验结果图；
图5为四重PCR重复性试验结果图；
图3中:分别采用猪瘟病毒CSFV、副猪嗜血杆菌HPS、猪呼吸道冠状病毒PRCV、猪流感病毒SIV、猪细环病毒TTV及猪细小病毒PPV等其他常见猪病病原体的基因组为阴性对照。
【具体实施方式】
[0011 ] 实施例1，试剂盒的组成部分
1、引物的设计及筛选
根据GenBank发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的保守基因核苷酸序列，用软件PrimerPrimer 5.0软件设计引物并进行BLAST序列比对初步验证引物特异性。引物均由上海生工生物工程有限公司有限公司合成。
[0012]APP SEQ N0.1 代表的序列为:5’ -TAGTGCTTACCGCATGTAGTGG-3’
APP SEQ N0.2 代表的序列为:5’ -TGGCTGCTCCGCTTTTGG-3’
M.hyo SEQ N0.3 代表的序列为:5’ -GCCGAACAAGCAATCACCAA-3’
M.hyo SEQ Ν0.4 代表的序列为:5’ -ACCCGAAGAACTTCAACAGCA-3’
PCV-2 SEQ N0.5 代表的序列为:5’ -CGTTACCGCTGGAGAAGG-3’
PCV-2 SEQ N0.6 代表的序列为:5’ -GGGAGGAGTAGITTACATAGGG-3’
PRRSV SEQ N0.7代表的序列为:
5，-AGGTGACACTATAGAATACCGACTGCTAGGGCTTCT-3，
PRRSV SEQ N0.8代表的序列为:
5’ -GTACGACTCACTATAGGGAACGGCATCTGGAGGTGAT-3’。
[0013]2、阳性对照品的制备
用核苷酸序列分别以如下引物组APP SEQ N0.1和APP SEQ N0.2，M.hyo SEQ N0.3和M.hyo SEQ N0.4, PCV-2 SEQ 勵.5和卩(^-2 SEQ N0.6, PRRSV SEQ N0.7和PRRSV SEQ N0.8,按常规方法进行PCR扩增，分别将PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA，将所得的四种阳性重组质粒按1:1:1:1混合，获得阳性对照品。
[0014]3、阴性对照品的制备
用试剂盒提取无猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪组织基因组DNA，进行PCR及电泳鉴定。
[0015]在此基础上，本发明做了如下实验，1)进行单重PCR:验证引物的特异性；2)进行四重PCR:优化四重PCR反应条件；3)进行特异性试验:检验该方法的特异性强弱；4)进行灵敏性试验:检验该方法的特异性高低；5)进行重复性试验:检验该方法的重复性高低。
[0016]实施例2，单重PCR反应条件
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的单重PCR反应体系均为:上、下游引物各0.25 μ L(20 ymol/L),Premix Taq 12.5 μ L,病毒基因组模板或反转录后的cDNA模板1 yL,加ddH20至25UL体系。PCR反应条件为:94.0 V 预变性5 min ；94.0 V变性30 s,58.0 V退火30 s,72.0 V 延伸 30 s，35 个循环；72.0 V 延伸 7min ;4.0 V 保存。
[0017]参考图1的结果显示:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的基因组DNA或cDNA在同一 PCR反应体系中得到了特异性扩增，结果与各自单重PCR完全相符并且特异性良好。(图1中Μ泳道为DL 2000 DNA Marker ；1泳道为阴性对照；2泳道模板为PCV DNA ；3泳道模板为PRRSVcDNA ；4泳道模板为M.hyo DNA ；5泳道模板为APP cDNA ；6泳道模板为PCV、PRRSV、M.hyo、APP混合模板)。
[0018]实施例3，多重PCR反应条件
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的四重PCR反应体系为:混合的上、下游引物各0.25 μ L (20μ mol/L), Premix Taq 12.5 μ L,病毒基因组模板或反转录后的cDNA四种混合模板1 μ L,加ddH20至25 yL体系。PCR反应条件为:94.0 V 预变性5 min ；94.0 V变性30 s,56.0°C "61.0°C 退火 30 s,72.0 V 延伸 30 s，35 个循环；72.0 V 延伸 7min ;4.0 V保存。
[0019]参考图2的结果显示:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ΑΡΡ、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的基因组DNA或cDNA混合体系通过梯度PCR扩增，Μ泳道为DL 2000 DNA Marker ;从左到右退火温度从1_7号分别为58°C、56°C、57°C、58°C、59°C、60°C、6rC，其中退火温度为58°C时能同时扩出各个目的条带并且最清晰。由此可摸索出该四重PCR反应体系的最佳退火温度为58°C。
[0020]实施例4，特异性试验
利用建立并优化的4种猪病病原体多重PCR检测方法对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、猪瘟病毒CSFV、副猪嗜血杆菌HPS、猪呼吸道冠状病毒PRCV、猪流感病毒SIV、猪细环病毒TTV及猪细小病毒PPV等细菌及病毒株的基因组DNA或cDNA为模板进行特异性评价。
[0021]参考图3的结果显示:该方法所建立的四重PCR体系只对PCV、PRRSV、M.hyo、APP模板有特异性扩增，而对猪瘟病毒CSFV、副猪嗜血杆菌HPS、猪呼吸道冠状病毒PRCV、猪流感病毒SIV、猪细环病毒TTV及猪细小病毒PPV等细菌及病毒株的基因组DNA或cDNA等其他常见猪病病原体的基因组无特异性扩增。(图中Μ泳道为DL 2000 DNA Marker ;1泳道为阴性对照；2泳道模板泳道模板为PCV、PRRSV、M.hyo、APP的cDNA/DNA混合模板；3?8泳道模板依次为 CSFV、HPS、PRCV、SIV、TTV、PPV 的基因组 DNA 或 cDNA)。
[0022]实施例5，敏感性试验
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的基因组DNA或cDNA为模板进行倍比(10倍)的稀释，并用紫外分光光度仪检测其模板浓度，然后用实施例3优化建立的多重PCR反应体系进行检测，分析多重PCR检测的最低浓度。
[0023]参考图4的结果显示:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的基因组DNA或cDNA最低浓度均低于 320 pg/μ L0 (图中 Μ 泳道为 DL 2000 DNA Marker ; 1 ?7 为泳道为 PCV、PRRSV、M.hyo、APP的 cDNA/DNA混合模板，拷贝数依次为 108 copies/ μ L, 107 copies/ μ L, 106 copies/ μ L, 105copies/μ L,104 copies/μ L,103 copies/μ L,102 copies/μ L)。
[0024]实施例6，重复性试验
利用优化后的四重PCR体系，对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、猪圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV，进行7次重复性扩增，并分析该方法的重复性。
[0025]参考图5的结果显示:经过7次重复实验扩增结果一致，重复性很好。(图中Μ泳道为 DL 2000 DNA Marker ;1 泳道为阴性对照；2?7 泳道为 PCV、PRRSV、M.hyo、APP 的 cDNA/DNA 混合模板，编号依次为 2301、2473、2143、6430、7203、3524、1243)。
【权利要求】
1.APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用引物，其特征在于:包括 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR特异性上游引物，其DNA序列为APP SEQ N0.1 ； 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR特异性下游引物，其DNA序列为APP SEQ N0.2 ； 猪肺炎支原体的PCR特异性上游引物，其DNA序列为M.hyo SEQ N0.3 ； 猪肺炎支原体的PCR特异性下游引物，其DNA序列为M.hyo SEQ N0.4 ； 猪圆环病毒2型的PCR特异性上游引物，其DNA序列为PCV-2 SEQ N0.5 ； 猪圆环病毒2型的PCR特异性下游引物，其DNA序列为PCV-2 SEQ N0.6 ； 猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR特异性上游引物，其DNA序列为PRRSV SEQ N0.7 ； 猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR特异性下游引物，其DNA序列为PRRSV SEQ N0.8。
2.APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用试剂盒，其特征在于:包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成:
DNA 序列为 APP SEQ N0.1 的 20 μ mo I/L 的 APP 上游引物 0.25 μ L ;
DNA 序列为 APP SEQ N0.2 的 20 μ mo I/L 的 APP 下游引物 0.25 μ L ;
DNA 序列为 Μ.hyo SEQ N0.3 的 20 μ mol/L 的 M.hyo 上游引物 0.25 μ L ；
DNA 序列为 Μ.hyo SEQ N0.4 的 20 μ mol/L 的 M.hyo 下游引物 0.25 μ L ；
DNA 序列为 PCV-2 SEQ N0.5 的 20 μ mol/L 的 PCV-2 上游引物 0.25 μ L ；
DNA 序列为 PCV-2 SEQ N0.6 的 20 μ mol/L 的 PCV-2 下游引物 0.25 μ L ；
DNA 序列为 PRRSV SEQ N0.7 的 20 μ mol/L 的 PRRSV 上游引物 0.25 μ L ;
DNA 序列为 PRRSV SEQ N0.8 的 20 μ mol/L 的 PRRSV 下游引物 0.25 μ L ; 2XPremix Ex Taq 缓冲液 12.5μ?; 灭菌去尚子水9.5 μ L ; 合计24 μ L,为单次反应的用量； 所述阳性对照管，管内为阳性猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、阳性猪肺炎支原体、阳性猪圆环病毒2型及阳性猪繁殖与呼吸综合征病毒的重组质粒DNA，体积为20 μ L ; 所述阴性对照管，管内为无猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪组织基因组DNA，体积为20 μ L ; 所述灭菌去离子水管ImL?2mL。
3.根据权利要求书2所述APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用试剂盒，其特征在于:所述阳性对照管内的重组质粒DNA由如下反应获得:分别以如下引物组APP SEQN0.1 和 APP SEQ N0.2，M.hyo SEQ N0.3 和 M.hyo SEQ N0.4，PCV_2 SEQ N0.5 和 PCV-2 SEQN0.6, PRRSV SEQ N0.7和PRRSV SEQ N0.8，按常规方法进行PCR扩增，分别将PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA。
4.利用权利要求2或3所述试剂盒进行猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重PCR非疾病检测目的的检测方法:包括如下步骤: 1)制备待检模板DNA:选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA，获得待检模板DNA ； 2)扩增反应体系为:24μ L扩增反应液；I μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为25 μ L; 3)多重PCR扩增:将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件:预变性94.00C 5 min ；94.0 °C 变性 30 S，58.(TC?61.(TC 退火 30 S，72.0 °C 延伸 30 S，35个循环；72.0 V延伸7min ；4.0 °C保存； 4)结果判定:2%琼脂糖凝胶结果判定，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性分别在107bp、176bp、337bp及225bp处出现特异性扩增条带。
【文档编号】C12Q1/70GK104313184SQ201410580775
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】李应国, 聂福平, 杨俊 , 王昱, 陈玉燕, 王国民 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心