专利名称：免疫缀合物的制备方法及其应用的制作方法
免疫缀合物的制备方法及其应用描述本发明描述了合成分子种类(molecular species)的方法即合成缀合物的方法， 和优化所述缀合物的反应性的方法，以及其在有关肿瘤诊断方法中的用途。目前肿瘤是继心血管疾病之后导致死亡的第二大因素，且其在世界范围内的发病率逐年增加。尽管在世界不同地区每种特定类型的癌症的分布和发病率非常不同，但是所述发病率在工业化国家显示出非常相似的趋势。在这些国家中，肺和前列腺的肿瘤性疾病在男性群体中报道的癌症病例中占很大部分。在女性群体中，大部分报道的癌症病例是乳腺癌，而肺癌的发病率也在增加中。除了这些性别特异性肿瘤之外，肠道癌和胰腺癌的发病率也在持续增加中，事实上其在过去的50年里已翻番。这些考虑因素显然滋生了对能够发出高器官特异性致瘤性转化信号的特异性标志的寻求的重要性。肿瘤的存在通常会产生特定的分子标志，这是由于经过致瘤性转化的那些细胞中代谢的变化。已知为肿瘤生物标志或者肿瘤相关抗原的这些物质的存在可以应用组织学方法来检测，或者从临床来看更便利地通过对生物体液如血清或者血浆进行分析来检测。然而，在一些情况中，正常生物标志谱的变更也许不是肿瘤性疾病存在的有效指标。这是由于这些变更也许是生活方式、非肿瘤性疾病的结果或者是医原性的(Gion,M. in “ Guida alFutilizzo dei biomarcatori in oncologia" Biomedia Source Books edition, Milan 2002，ITALY)。从诊断角度看，这是健康个体群体内假阳性结果的来源。本申请人拥有关于癌症诊断的高特异性方法的专利申请，其中生物标志的鉴别在健康对象中不更给出病理状况的指征。更详细地来说本申请人设计出能在生物标志的存在与对象病理状况之间达到更好的相关性的测试。这些测试从实验证据中开发出来，即在患有肿瘤性疾病的患者血清中，除了存在游离的生物标志(即未与其它辅因子缀合的生物标志)之外，还可以检测到含有其它生物标志的种类。所述种类是所述生物标志与免疫球蛋白即M类免疫球蛋白或者IgM的复合物。因此，已经构思出基于对循环免疫复合物的鉴别的方法，所述循环免疫复合物通过肿瘤标志与特异于其的自身抗体结合而形成，后文称作特异性CIC。这种方法在癌症诊断中极其有用，因为其使得可以将健康对象与患有癌症患者群区别开，且相对于基于游离肿瘤抗原检测的测试而言具有更高的选择性。自身抗体是由免疫系统天然产生的抗体并针对识别为非自身的抗原，即使其是由该生物体正常表达的分子之一。这些自身种类的免疫原性的通常解释涉及到与正常组织相比其在经肿瘤性转化的组织中的异常的高表达(超表达)(Sahin U. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995，92， 11810-13)。由于上述原因，对游离肿瘤抗原的分析可具有很差的诊断价值，特别是在需要高特异性时。然而，这些考虑因素不适用于免疫复合物分析，其使得可以以增强的特异性区别健康对象与癌症患者。IC形成对于确定血清或者血浆中游离肿瘤相关抗原的作用是双重的(i)当所述抗原涉及到CIC中时，其可被掩蔽并因此用正常免疫测定(immimometric) 法检测不到，这种状况可以解释假阴性结果的产生。另一方面，从正常细胞中释放的低水平的抗原不能形成稳定且持续的IC。在后者的情况中，游离抗原可被检测而导致假阳性结果。 假实验结果的这两个来源均可以被消除，显示出特异性CIC，如下文本发明的一个实施方案中所述。本发明人设计的诊断方法使得可以通过特异性试剂简便地确定肿瘤相关生物标志。对于已知其抗原性生物标志的大量肿瘤性疾病进行的研究工作使得可以检测由所述抗原性生物标志与特异于其的自身抗体形成的免疫复合物。所述特异性复合物的检测可用于指定肿瘤的诊断。所述癌症诊断方法是基于在生物液体中对特异性CIC的检测，这是通过将得自对象的样品与针对肿瘤相关抗原的特异性试剂(SR)接触并温育而进行。所述方法包括检测SR-CIC复合物，其中所述复合物的存在表示癌症的存在。经考虑的SR包含多克隆和/或单克隆抗体或者其片段，以用于通过免疫测定方法来揭示出涉及特异性CIC 形成并存在于肿瘤性疾病患者血液中的肿瘤标志的存在。用于评价生物液体中CIC含量的所述免疫测定方法的非限制性实例包括直接、间接或者“夹心”ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射计量测定(RIA)或者“夹心”放射计量测定(IRMA)，或者采用不同技术如“快速近红外光谱”的同类免疫测定法。在生物液体中检测特异性CIC的免疫酶方法的典型实例包括1]将针对游离或者缀合形式的肿瘤标志的特异性试剂(SR)固定在塑料微滴定平板上用于ELISA测定，或者固定在用于诊断目的的颗粒上；2]将得自患者的生物液体与固定的化合物一起温育；3]洗涤由固定的化合物与IC形成的复合物；4]将所述复合物与针对人源的抗体的多克隆或单克隆抗体一起温育，所述抗体与可追踪的标志如酶、生色化合物、荧光化合物、放射性化合物、化学发光化合物、辅酶、或者酶抑制剂缀合；5]通过合适的洗涤步骤除去过量的抗体；6]通过合适的试剂检测吸附的抗体。如本文所用，生物液体是指通过常规方法以足以进行测定的量得自患者的血清、 血浆、淋巴液、腹水、胸膜渗液体(pleuric exudates)、脊髓液等。这些技术在文献中有描述且为本领域技术人员所熟知。迄今为止已知一些免疫测定方法在性质上相关联。这些方法不能绝对地确定感兴趣分析物的浓度，但是可以将与所述浓度成比例的信号与通过使用已知浓度的一或多种样品作为校准物(calibrator)获得的相似信号进行对比。定量分析的免疫测定方法不能没有校准方法。在临床实践及在诊断过程中，感兴趣的分析物是这样的化合物，其浓度或者其变化与病理状况的发生或者进展相关。在这些化合物中，存在与肿瘤性疾病的发展相关的种类，称作肿瘤标志或者肿瘤相关抗原。所述化合物的标准制备需要将其从天然来源以及其中从得自肿瘤性疾病患者的生物材料中分离；或者，这些种类可以采用重组DNA技术获得。在第一种情况中，所述校准物的制备需要操作和处理人源材料，其在有效的工业方法的实施中具有严重的供应限制和安全性问题。在第二种情况中，重组产物的可利用性解决了任何供应和安全性的问题，然而，重组蛋白质的表达仅对于经充分确定成分和已知序列的分子种类是可行的。然而，与肿瘤性疾病诊断相关的分析物如前述生物标志-自身抗体免疫复合物在本质上是异质的(heterogeneous)，对于其而言作为重组产物表达是不可行的。 在现阶段，用于这些化合物定量分析的校准物的产生只可能通过从人源样品提取。引入合成的或者半合成方法获得分子种类以代替通过人源样品提取获得的所述校准物将简化生产过程，增加其安全性标准，同时降低成本并保证更好的批次与批次间的再现性。本发明第一个目的是合成分子种类的方法，所述分子种类在后文称作缀合物，展示出生物标志-IgM 免疫复合物的反应性。本发明的方法克服了为获得在癌症检测诊断试剂盒中用作校准物的生物标志-IgM免疫复合物的所有问题。在表1中，我们报道了所述新方法中感兴趣的生物标志和瘤形成的非限制性实例。表 1
肿瘤标志癌症参考文献Ki-67星形细胞瘤Br J Cancer 89(1): 128-34，2003纤连蛋白膀胱癌Clin Chem Lab Med 41(8): 1069-74， 2003肝细胞瘤正调节蛋白(HURP)膀胱癌Anticancer Res 23(3B):2729-33, (HURP) 2003粘蛋白7(MUC7)膀胱癌Urology 62(1): 182-86, 2003NMP22膀胱癌J Chin Med Assoc 66(5):294- 98， 2003NMP22膀胱癌AnticancerRes 23(2A):805-12, 2003前列腺干细胞抗原(PSCA)膀胱癌JUrol 169(6):2094-100, 2003 (PSCA)端粒酶膀胱癌Urology 62(2):362-67,2003组织多肽抗原(TPA)膀胱癌Urology 62(2):243-48, 2003 (TPA)CA 15-3、CA 27.29、AFP、CEA乳腺癌Biomed Sci Instrum 39:408-14，2003CA 15-3、血浆铜蓝蛋白、TPA乳腺癌East Afr Med J 77(6):291-94,2000CEA、细胞角蛋白19 (CKl 9) 乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(Maspin)乳腺癌Anticancer Res 23(2C): 1883-90, Maspin 2003c-Met乳腺癌Breast Cancer Res 5(3):71-76,2003细胞色素P450 3A4乳腺癌Biomed Sci Instrum 39:24-29, 2003上皮糖蛋白2(EGPP、细胞角蛋白 19 (CKl 9)乳腺癌Int J Cancer 106(4):611-18,2003MUCl乳腺癌Int J Biol Marker 15(4): 343-56, 2000Her2/Neu乳腺癌Clin Chem 49(10): 1579-98,2003MMP-9乳腺癌Int J Cancer 106(5):745-51, 2003人激肽释放酶(hK5)乳腺癌和卵巢癌Cancer Res 63(14):3958-65, 2003NMP179宫颈鳞状上皮癌Anticancer Res 23(2A):805-12, 2003CEA、细胞角蛋白19(CK19)、 细胞角蛋白20(CK20)结肠直肠癌J Cancer Res Clin Oncol 129(3): 192-98, 2003细胞角蛋白结肠直肠癌Colorectal Dis 5(2): 164-68，2003细胞角蛋白20(CK20)、CEA、鸟苷酸环化酶C (GCC)结肠直肠癌Eur J Cancer 39(9): 1234-41, 2003Her2/Neu结肠直肠癌Int J Cancer 105(6):796-802, 2003MUC6、MUC5AC结肠直肠癌Glycocong J 18(11-12):907-14, 200权利要求
1.一种合成分子种类或者缀合物的方法，所述分子种类或者缀合物被赋予这样的能力，即使得可以明确或者隐含地确定至少两种经方便地官能化的不同分子或者生物分子、其片段或者序列之间的，或者非附属成分之间的浓度比或者质量比；在存在或者不存在作为交联剂、支架或者附属成分的第三分子或者生物分子的情况下被包括到通式 AaBbCc. . . . . Zz的单分散性或者多分散性分子对象或者缀合物之中，所述方法被赋予如下性质(i)据其获得的产物以可再现的方式展示其非附属或者附属成分的部分或者全部免疫反应性；(ii)当联合测试所述反应性时，所述方法使得可再现地优化任何有序的η-重非附属成分的所述反应性，而不依赖于该成分的固有反应性。
2.权利要求1的方法，特征在于将所述浓度或质量比明确或者隐含地定义为一组参数。
3.权利要求1、2的方法，特征在于，至少一种被考虑的非附属成分属于人免疫球蛋白类别，如IgG、IgA、IgE、IgM、IgD，优选IgM，及其片段或者序列。
4.权利要求1、2的方法，特征在于，至少一种被考虑的非附属成分属于与用于病理状况的发生或者进展的选择性或者特异性标志相关的生物分子类别。
5.权利要求4的方法，特征在于所述生物分子是肿瘤标志。
6.权利要求4或5的方法，特征在于，所述生物分子不包含在周转(turnover)条件下能与蛋白质或者非蛋白质属性试剂反应的那些蛋白质，所述试剂自身释放或者通过与其它种类相互作用而释放生色物质、荧光物质、化学发光物质，而所述生物分子可包含肿瘤标志相关的酶或者含有所述酶的复合物。
7.权利要求1、3、4、5的方法，特征在于至少一种附属成分被赋予呈现天然存在或者人工引入的化学反应性的性质，其与由于在称作非附属成分的分子中天然存在的或者人工引入的基团的那种反应性互补。
8.与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于其使用通过一或多项上述权利要求的方法所获得的缀合物。
9.权利要求8的免疫测定方法，特征在于其是免疫酶学方法。
10.权利要求9所述的与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于所述免疫酶学方法是ELISA测定。
11.权利要求10的与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于所述ELISA测定被用于确定与肿瘤性疾病的诊断相关的种类的浓度或者与之相关的其它性质。
12.权利要求11的与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于所述种类是免疫复合物生物标志-自身抗体。
13.权利要求12的免疫测定方法，特征在于所述自身抗体是IgM。
14.权利要求13的与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于其结合一或多种如下的用于各自肿瘤性疾病的标志-用于星形细胞瘤的Ki-67;-用于膀胱癌的纤连蛋白、肝细胞瘤正调节蛋白(HURP)、粘蛋白7 (MUC7)、NMP22、 NMP22、前列腺干细胞抗原(PSCA)、端粒酶、组织多肽抗原(TPA)；-用于乳腺癌的CA 15-3、CA 27. 29、AFP、CEA、CA 15_3、血浆铜蓝蛋白、TPA、CEA、细胞角蛋白19 (CK19)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(Maspin)、c-Met细胞色素P450 3A4、上皮糖蛋白 2(EGP2)、细胞角蛋白 19 (Ck 19)、ErbB_2 Her2/Neu MMP-9 ； -用于乳腺癌和卵巢癌的人激肽释放酶5 (hK5)； -用于子宫颈鳞状上皮癌的NMP 179 ；-用于结肠直肠癌的CEA、细胞角蛋白19 (CKl 9)、细胞角蛋白20 (CK20)、细胞角蛋白、 细胞角蛋白 20 (CK20)、CEA、鸟苷酸环化酶 C(GCC)、Her2/Neu、MUC6、MUC5AC、ReΙΑ、NF-kb ； -用于B细胞淋巴瘤的Bcl-6、⑶10; -用于子宫内膜癌的CEA;-用于胃癌的半胱氨酸富集成纤维细胞生长因子受体I(CFR-I)m p27、MIB-I ； -用于胃肠道癌的嗜铬粒蛋白A(CgA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、突触囊泡蛋白 (synaptophysin)、Leu-7、β III-微管蛋白；-用于头颈癌的细胞角蛋白、上皮膜抗原(EMA)、透明质酸酶(HYAL1)、潜伏膜蛋白 1(LMP-I)；-用于肝细胞癌的α-胎蛋白(AFP)、脱-Y-羧基凝血酶原(DCP)； -用于肝细胞癌的细胞视黄醇结合蛋白1 (CRBPl)、GlypCan-3、端粒酶； -用于白血病和多发性骨髓瘤的黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)； -用于肺癌的CEA、嗜铬粒蛋白A、NSE、血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞因子(SCF)、 肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)；-用于肺癌的表皮生长因子受体(EGFR)、M2-PK、CYFRA 21_1、NSE、SCC ； -用于黑色素瘤的神经元特异性烯醇酶(NSE)、S-100B、酪氨酸酶、LDH ； -用于胃肠道癌的细胞角蛋白20 (CK20)、前列腺干细胞抗原(PSCA)； -用于胃癌的Medkine (MK)； -用于卵巢癌的CA 125、CASA、CA 125 ； -用于胰腺癌的CA 19-9 ； -用于胰腺癌的存活素(Survivin)、p53、Bcl-2 ；-用于的嗜铬细胞瘤的分泌粒蛋白II (Secretogranin II)-衍生的肽EM66; -用于前列腺癌的GLUT1、GLUT12、胰岛素样生长因子结合蛋白2 (IGBFB2)； -用于成横纹肌细胞瘤的肌形成蛋白(myogenin)、MyoDl ； -用于甲状腺癌(乳头状癌)的二肽基肽酶IV(DPP IV/⑶26)； -用于甲状腺癌(乳头状癌)的过氧化物酶体增殖激活受体 (PPARy)0
全文摘要
本发明涉及制备分子缀合物的方法，所述分子缀合物包含肿瘤性疾病中出现的免疫球蛋白和生物标志，特征在于高水平的可再现性(reproducibility)。
文档编号G01N33/543GK102216779SQ200880131987
公开日2011年10月12日 申请日期2008年10月13日 优先权日2008年10月13日
发明者G·法西纳, L·贝内杜切, P·彭戈 申请人:泽普塔根股份公司