专利名称：妊娠特异性β的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种诊断血球、单向免疫扩散板，具体地说是涉及妊娠特异性β1糖蛋白的诊断血球、单向免疫扩散板的制备方法和应用。
妊娠特异性β1糖蛋白(SP1)是由胎盘合体滋养层细胞分泌的，测定孕妇血中SP1的含量，能反映胎盘体积和功能的变化，目前多采用放射免疫法，虽测值可信，但由于放射性衰变和需要贵重的医疗设备，不易普及基层医院。
本发明的目的是提供一种在孕晚期、足月或过期妊娠情况下，测定SP1值的诊断血球、单向免疫扩散板的制备方法和应用。
本发明中妊娠特异性β1糖蛋白(SP1)诊断血球、单向免疫扩散板的制备方法采用如下步骤1SP1的提纯1.1饱和硫酸铵盐析正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，离心3000-6000r/min20分钟，去沉淀，上清用50％饱和硫酸铵盐析，4000-10000r/min20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+。
1.2 sephadex G200柱层析取sephadex G20010克，按常规处理装柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl缓冲液(PH8.0)平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10ml分别收集洗脱液，应用SP1血球试剂检查各管浓度，收集SP1高浓度管合并，用50％饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+。
1.3SP1偶联sepharose4B亲和层析取瑞典pharmacia公司生产的sepharose4B10-40ml，经0.5mol/LNaCl和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH调PH值，使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的SP1抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸盐缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率为78.2％。将合并的高浓度样品5ml加入SP1抗体亲和层析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH6-8)洗脱，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集SP1高浓度区，用50％饱和硫酸铵浓缩除盐。
1.4抗人全血抗体偶联sepharose4B亲和层析柱制备与SP1抗体偶联sepharose4B相同，其偶联率为7.28％。将浓缩除盐SP1样品5ml加入抗人全血抗体亲和层析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗脱，洗速为30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为SP1纯品。
2 SP1抗血清的制备选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg,5-20天后向淋巴结周围多点注射，SP1抗原加福氏完全佐剂0.5-4ml,(每千克体重50-400μgSP1抗原)。以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时(双向琼脂扩散法)，颈动脉放血分离血清。
3人“O”型红细胞的醛化取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％醛化血球悬液。
4SP1抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成1-10％血球，将SP1IgG稀释成1-20μg/ml浓度与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴下反应0.5-3小时，经含有0.1-3％兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合IgG，配成1％血球悬液，生产出SP1冻干诊断血球。
5将SP1抗血清1ml用0.05molNaCl、0.05％NaN3稀释成100、200、400倍，于56℃灭活30分钟，分别加入等体积的2.4％琼脂液中，琼脂液需煮沸10-40分钟后，冷却至40-70℃时方可混合均匀铺板。琼脂厚度3.0mm，打孔直径2.5mm，孔距1.2cm。
本发明制备的SP1的鉴定1．非特异性检查应用非孕妇女血清6份，男性血清6份，分别加入SP1单向免疫板琼脂孔内各5μl，放置37℃恒温24小时判定结果，均无沉淀环出现，说明SP1单向免疫板无非特异性反应。
2．稳定性检查将SP1单向免疫板存放4℃不同月份进行比较，每批均加入相同样品各5μl，放置37℃恒温24小时进行观察，发现放置6个月以内的免疫板，其沉淀环大小和清晰度无差别，而放置7个月的免疫板，沉淀环清晰度略差，8个月放置的免疫板，沉淀环不清楚。由于免疫板放置时间过长，导致SP1抗血清失活。经观察比较，免疫板使用期限应在6个月以内为宜，每批使用前，均用SP1标准进行质量检查。通过对211例28-41孕周正常妊娠妇女血清测定，结果表明正常孕妇血清SP1值随孕周增加，41孕周达到高峰并维持到分娩。本方法以各孕周平均值正负两个标准差为各孕周正常范围的下限值(警界值)。确定36-41孕周血清SP1≤100μg/ml为警界值，＞100μg/ml为正常值，以此对高危妊娠妇女进行观察。
下面结合实施例详细叙述本发明。
1 SP1的提纯1.1饱和硫酸铵盐析正常足月分娩产妇胎盘10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌30分钟，离心4000r/min20分钟，去沉淀，上清用50％饱和硫酸铵盐析，5000r/min20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+。
1.2sephadex G200柱层析取sephadex G20010克，按常规处理装柱(2.5×100cm)用0.2mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl缓冲液(PH8.0)平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速60ml/h以每管5ml分别收集洗脱液，应用SP1血球试剂检查各管浓度，收集SP1高浓度管合并，用50％饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+。
1.3SP1偶联sepharose4B亲和层析取瑞典pharmacia公司生产的sepharose 4B30ml，经0.5mol/LNaCl和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH调PH值，使之维持在11左右，反应10分钟，用布氏漏斗抽干，加入经0.1mol/LNaHCO3(PH9.0)透析的SP1抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸盐缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率为78.2％。将合并的高浓度样品5ml加入SP1抗体亲和层析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.4)洗脱，流速30ml/h洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液(PH2.4)解吸附，流速60ml/h，收集SP1高浓度区，用50％饱和硫酸铵浓缩除盐。
1.4抗人全血抗体偶联sepharose4B亲和层析柱制备与SP1抗体偶联sepharose4B相同，其偶联率为7.28％。将浓缩除盐SP1样品5ml加入抗人全血抗体亲和层析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗脱，洗速为30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为SP1纯品。
2 SP1抗血清的制备选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗20mg,10天后向淋巴结周围多点注射，SP1抗原加福氏完全佐剂2ml，(每千克体重150μgSP1抗原)。以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时(双向琼脂扩散法)，颈动脉放血分离血清。
3人“O”型红细胞的醛化取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％醛化血球悬液。
4 SP1抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成5％血球，将SP1IgG稀释成10μg/ml浓度与等量醛化血球混合，在45℃恒温振荡水浴下反应1.5小时，经含有1％兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合IgG，配成1％血球悬液，生产出SP1冻干诊断血球。
5将SP1抗血清1ml用0.05molNaCl、0.05％NaN3稀释成100、200、400倍，于56℃灭活30分钟，分别加入等体积的2.4％琼脂液中，琼脂液需煮沸30分钟后，冷却至56℃时方可混合均匀铺板。琼脂厚度3.0mm，打孔直径2.5mm，孔距1.2cm。
本发明应用实施例如下取10μl孕妇血清用1ml盐水稀释成100倍等待检测用，在V型微量血凝板上，从第1孔到第5孔各加样品稀释水25μl，取100倍稀释的血清25μl加到第1孔，用微量加样器从第1孔起依次做2倍稀释到第4孔，第5孔为空白对照，冻干SP1诊断血球用血球稀释水2ml溶解并摇匀，4℃过夜放置后应用，取25μl稀释血球从第1孔到第5孔各加25μl，震匀后放37℃,1小时取出判定结果。
判定标准孕妇血清中SP1能与SP1抗体致敏血球出现凝集反应(阳性)，反之，如血清中不含有或浓度较低，则不出现凝集(阴性)，依据出现血球凝集的血清最大稀释倍数乘以致敏血球的敏感度(0.125μg/ml)，便可确定血清中SP1的浓度。
判定方法血球全部沉入孔底为阴性，根据凝集程度分为1-4各阶段，凝集在2以上可判定为阳性。
计算公式血清中SP1含量(μg/ml)=血球凝集孔的血清稀释倍数×诊断血球的敏感度(μg/ml)。
用毛细玻璃管取孕妇耳垂血0.1ml，分离出血清，用微量加样器吸取5微升加入琼脂孔内(注意不要溢出孔外)，加样完毕后，盖好塑料板，水平放人温盒内，在37℃条件下扩散24小时观察结果，分别记录所测样品的免疫沉淀环直径(mm)，从标准曲线上可查出SP1值，即得该样品的SP1含量。通过对211例28-41孕周正常妊娠妇女血清测定，结果表明正常孕妇血清SP1值随孕周增加，41孕周达到高峰并维持到分娩。本方法以各孕周平均值正负两个标准差为各孕周正常范围的下限值(警界值)。确定36-41孕周血清SP1≤100μg/ml为警界值，＞100μg/ml为正常值，以此对高危妊娠妇女进行观察。其中标准曲线的制备方法是在琼脂板孔内分别加入3个不同浓度的SP1标准液，每孔加样5μl，放入37℃恒温24小时后观察沉淀环直径，发现SP1抗血清200倍稀释后所做的琼脂板，免疫沉淀环直径比较清晰，其扩散环直径分别为8.1mm、6.2mm、5.0mm，以标准含量为横坐标，标准液免疫沉淀环直径为纵坐标，绘制标准工作曲线。(参考德国Benring研究所的SP1标准)
权利要求
1.一种妊娠特异性β1糖蛋白诊断血球、单向免疫扩散板的制备方法，该方法包括以下步骤(1)SP1的提纯(1.1)饱和硫酸铵盐析正常足月分娩产妇胎盘5-10个，应用组织捣碎机匀浆，加2倍体积生理盐水搅拌20-40分钟，离心3000-6000r/min20分钟，去沉淀，上清用50％饱和硫酸铵盐析，4000-10000r/min20分钟，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，以生理盐水透析至无NH+。(1.2)sephadex G200柱层析取sephadex G20010克，按常规处理装柱(2.5×100cm)用0.1-0.3mol/LNaCl和0.05mol/Ltris-HCl缓冲液(PH8.0)平衡，取盐析浓缩样品10ml，流速10-80ml/h以每管2-10m1分别收集洗脱液，应用SP1血球试剂检查各管浓度，收集SP1高浓度管合并，用50％饱和硫酸铵沉淀，透析至无NH+。(1.3)SP1偶联sepharose 4B亲和层析取瑞典pharmacia公司生产的sepharose4B10-40ml，经0.5mol/LNaCl和冷蒸馏水淋洗后冰浴，加入新配制的溴化氰3.0g/10ml，用0.2mol/LNaOH调PH值，使之维持在5-12左右，反应5-20分钟，用布氏漏斗抽干，加入经0.1mol/LNaHCO3(PH7-11)透析的SP1抗体搅拌4℃过夜，次日装柱，用0.01mol/L(0.5mol/LNaCI)磷酸盐缓冲液洗至280nmOD值＜0.01为止，收集全部洗脱液，经紫外分光光度计测定280nmOD值，计算其偶联率为78.2％。将合并的高浓度样品5ml加入SP1抗体亲和层析柱中(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH6-8)洗脱，流速10-60ml/h洗至280nmOD值＜0.02时，改用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液(PH2.4)解吸附，流速10-80ml/h，收集SP1高浓度区，用50％饱和硫酸铵浓缩除盐。(1.4)抗人全血抗体偶联sepharose4B亲和层析柱制备与SP1抗体偶联sepharose4B相同，其偶联率为7.28％。将浓缩除盐SP1样品5ml加人抗人全血抗体亲和层析柱中，(1.5×20cm)0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗脱，洗速为30ml/h，收集第一蛋白吸收峰，合并各管浓缩，冻干为SP1纯品。(2)SP1抗血清的制备选择2kg雄性家兔，于双后足掌注射活卡介苗5-40mg，5-20天后向淋巴结周围多点注射，SP1抗原加福氏完全佐剂0.5-4ml，(每千克体重50-400μgSP1抗原)。以后每间隔一周免疫一次，经5次免疫后，试血效价达到1∶64倍时(双向琼脂扩散法)，颈动脉放血分离血清。(3)人“O”型红细胞的醛化取健康男性“O”型红细胞，经戊二醛、甲醛、丙酮醛处理后，配成10％醛化血球悬液。(4)SP1抗血清致敏醛化血球取10％醛化血球离心后用0.1mol/L醋酸钠配成1-10％血球，将SP1IgG稀释成1-20μg/ml浓度与等量醛化血球混合，在20-60℃恒温振荡水浴下反应0.5-3小时，经含有0.1-3％兔血清的磷酸盐缓冲液洗去未结合IgG，配成1％血球悬液，生产出SP1冻干诊断血球。(5)将SP1抗血清1ml用0.05molNaCl、0.05％NaN3稀释成100、200、400倍，于56℃灭活30分钟，分别加入等体积的2.4％琼脂液中，琼脂液需煮沸10-40分钟后，冷却至40-70℃时方可混合均匀铺板。琼脂厚度3.0mm，打孔直径2.5mm，孔距1.2cm。
2.一种妊娠特异性β1糖蛋白诊断血球、单向免疫扩散板在判定胎盘功能方面的应用。
全文摘要
一种妊娠特异性β
文档编号G01N33/53GK1289925SQ99113259
公开日2001年4月4日 申请日期1999年9月24日 优先权日1999年9月24日
发明者王晓东 申请人:吉林省计划生育科学技术研究所