在糖蛋白产品中包含n-乙酰己糖胺的n-聚醣的制作方法

在糖蛋白产品中包含n-乙酰己糖胺的n-聚醣的制作方法
【专利摘要】本发明提供了针对一种N-乙酰己糖胺聚糖例如一种N-乙酰葡糖胺聚糖的不存在、存在或量来评估一种糖蛋白制品的方法。
【专利说明】在糖蛋白产品中包含N-乙酰己糖胺的N-聚醣
[0001]本申请要求2011年3月12日提交的美国申请序列号61/452，092的优先权。该在先申请的披露内容被视为本申请的披露内容的部分(并且通过引用结合在此)。
发明领域
[0002]本发明涉及用于检测糖蛋白中的特定聚糖结构的方法和材料。
[0003]发明背景
[0004]抗体表示在药物市场中和在针对多种适应症的开发中日渐发展的一类生物治疗药物。与小分子不同，生物制剂实际上是亚型的混合物，所有的这些亚型包含相同的肽主链但在修饰上不同，并且它们可以具有一系列的药代动力学、药效动力学或安全性曲线。因此重要的是例行地监测产品质量。抗体是包含至少一个可变地被占的N-糖基化位点的糖蛋白。认为在抗体治疗剂中的N-糖基化影响该分子的药代动力学和结构整体性(Krapp (克拉普)，Mimura (米姆拉)等人2003)。
[0005]发明概沭
[0006]本发明在部分上是基于可以存在于糖蛋白(例如，糖基化抗体)上的N-乙酰己糖胺聚糖结构的发现。在一些实施例中，N-乙酰己糖胺的存在或量与一种或多种具体生产参数相关联。可以将此聚糖结构的不存在、存在和/或量用于(除其他之外)评估或加工一种糖蛋白制品，从而例如确定是否接受或拒绝一批糖蛋白(例如，糖基化抗体)、或者指导或控制用于产生糖蛋白(例如，糖基化抗体)的一种或多种生产参数。在一些实施例中，可以将在糖蛋白组合物中此结构的不存在、存在或量与例如一个参比标准进行比较，从而例如作出关于该糖蛋白制品的决定，例如分类、选择、接受或丢弃、释放或留存、加工成一种药物产品、装运、移动到一个不同的位置、配制、贴标签、包装、准予进入贸易、或销售或许诺销售该糖蛋白(例如糖基化抗体)的决定。在其他实施例中，该决定可以接受、改变或拒绝一种或多种用于制造糖蛋白(例如，糖基化抗体)的生产参数。
[0007]因此，在第一方面，本披露的特征为用于评估一种糖蛋白制品的方法。在一些实施例中，该方法包括:
[0008]提供糖蛋白的一种或多种制品，例如糖基化抗体制品；并且
[0009]例如使用分离方法，对与糖蛋白相关联的N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在和/或量进行确定。
[0010]该确定步骤可以包括以下各项的一个或多个:(a)对由一种细胞产生的糖蛋白进行分离，并且确定N-乙酰己糖胺聚糖是否存在于该糖蛋白上，(b)对由一种细胞产生的糖蛋白制品进行分离，并且对在该制品的糖蛋白上N-乙酰己糖胺的存在或量进行确定，(c)将聚糖从由一种细胞产生的糖蛋白分离，并且确定该糖蛋白的聚糖是否包含N-乙酰己糖胺聚糖，并且(d)提供来自由细胞产生的糖蛋白的至少一种肽，并且对在该至少一种肽上的包含N-乙酰己糖胺的聚糖的存在进行确定。用于测量N-乙酰己糖胺的技术可以包括以下方法中的一种或多种以及任意这些方法的组合:色谱法、质谱(MS)法、电泳法(例如，毛细管电泳)、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收、酶法、使用一种检测分子(例如抗体或凝集素)。
[0011]聚糖的来源可以选择下组，该组由以下各项组成:细胞群，例如CHO细胞；分离的糖蛋白，例如分离的糖基化抗体；从糖蛋白(例如糖基化抗体)的切割衍生的肽；或从糖蛋白衍生的聚糖。在一些实施例中，该方法包括用一种或多种酶(例如，PNGase)处理聚糖或糖肽的来源，随后为聚糖群体的分析。在一些实施例中，此方法包括用一种化学品处理糖肽以释放聚糖(例如，酸水解)、随后为所释放的聚糖或单糖的分析和/或连接至单一氨基酸上的聚糖的分析。
[0012]在一些实施例中，所使用的方法提供了 N-乙酰己糖胺聚糖的定量测量。在一些实施例中，所使用的方法提供了定性测量。
[0013]在一些实施例中，该方法还包括制备一种糖蛋白制品，将一种或多种聚糖从糖蛋白制品切割(例如，用一种或多种酶，如PNGase)，并且对N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在或量进行确定。
[0014]在某些实施例中，该方法是在治疗性糖蛋白的生产运行期间通过以下方式进行:从生产线的细胞培养物获得一个样品，从而例如对在生产期间的聚糖结构进行监测。在某些实施例中，该确定步骤随着时间的推移而重复至少一次，例如，该确定步骤在细胞的培养时期期间重复至少一次、两次、三次或更多次。在一些实施例中，该方法是在糖蛋白的储存期间通过以下方式进行:从糖蛋白组合物获得一个样品，从而例如对在储存期间的聚糖结构稳定性进行监测。在某些实施例中，该确定步骤随着时间的推移而重复至少一次，例如，该确定步骤在糖蛋白组合物的储存期间重复至少一次、两次、三次或更多次。在其他实施例中，该方法是对糖蛋白组合物而进行，例如作为该糖蛋白组合物的质量测试或释放测试的部分。
[0015]在一些实施例中，该确定步骤包括:将在一个在第一糖蛋白制品(从一个第一细胞群产生，该第一细胞群例如在一种或多种第一生产参数下产生)中的包含N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白的水平与在一个在第二糖蛋白制品(在不同的一种或多种生产参数下，从一个第二细胞群和/或相同的细胞产生)中的包含N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白的水平进行比较。在一些这样的实施例中，对糖蛋白制品的N-乙酰己糖胺聚糖的存在或量进行确定，并且将其与在不同的一种或多种生产参数下生产的糖蛋白的N-乙酰己糖胺聚糖的存在或量进行比较。
[0016]在一些实施例中，该方法包括将N-乙酰己糖胺聚糖的水平与参比标准(例如，对照水平，或在产品说明中的一个范围或值)进行比较的步骤。
[0017]在该方法的某些实施例中，该确定步骤包括一种检测分子的使用，该检测分子能够检测N-乙酰己糖胺聚糖的存在或不存在。在某些实施例中，该检测分子包括能够结合至N-乙酰己糖胺的抗体。在一些实施例中，该检测分子可以包含荧光部分、或放射性同位素部分。在一些实施例中，这包含与N-乙酰己糖胺形成共价键的另一种糖。在一些实施例中，该检测分子可以包含荧光部分、或放射性同位素部分。在一些实施例中，这包含与N-乙酰己糖胺形成共价键的另一种糖。在一些实施例中，该检测分子可以包含荧光部分、或放射性同位素部分。
[0018]在一些实施例中，糖蛋白，例如糖基化抗体，是由克隆细胞群(例如克隆CHO细胞群)产生。细胞群可以是培养物，例如或来自用于制造糖蛋白(例如，糖基化抗体)的生物反应器中的细胞培养物的样品。在某些实施例中，细胞群将是已经用至少一种载体进行了转化，该载体对糖蛋白进行编码。治疗性糖蛋白可以是人源的、非人源的或合成来源的。在一些实施例中，糖蛋白可以用于人或兽医学适应症的治疗。
[0019]在一些实施例中，该方法进一步包括对由细胞产生的糖蛋白的生物活性进行评估的步骤，例如，如在体外或体内如在动物模型中对糖蛋白的潜在免疫潜在性的存在或水平进行评估。
[0020]在一个第二方面，本发明包括针对在糖蛋白上产生N-乙酰己糖胺聚糖的能力而筛选一种或多种细胞的方法，该方法包括:
[0021]提供多个细胞群，例如，多个CHO细胞群；
[0022]在适合于一种糖蛋白的表达的条件下，将该多个细胞的每一个进行培养；
[0023]对由该多个细胞的每一个所产生的N-乙酰己糖胺聚糖(例如，N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺)进行测量，并且
[0024]基于由所选择的细胞制品所产生的一个目标水平的N-乙酰己糖胺聚糖的存在而选择该多个细胞制品中的一种或多种。
[0025]在一些实施例中，该细胞群是CHO细胞群。
[0026]可以从由细胞制品所广生的糖蛋白、从细胞制品的分尚的糖蛋白、从获得自细胞制品所产生的糖蛋白的肽、或者从获得自细胞制品的或获得自其糖蛋白产物的聚糖制品获得并测量N-乙酰己糖胺聚糖。在某些实施例中，筛选方法进一步包括将糖蛋白表达产物从细胞培养物分离、并且针对在由步骤(c)中的细胞所产生的糖蛋白上的N-乙酰己糖胺聚糖的存在或量进行测量的步骤。在某些实施例中，细胞筛选方法包括对存在于糖蛋白制品上的N-乙酰己糖胺聚糖的量进行定量。在某些实施例中，细胞筛选方法的步骤(b)是在一个生物反应器中发生。
[0027]该多个细胞群的每一个可以包括不同的品系群、不同的克隆细胞群、或来自用于制造糖蛋白的细胞培养物的不同的样品(例如，随着时间的推移而取的样品)。在某些实施例中，细胞群是用至少一种载体进行转化，该载体对糖蛋白(例如，糖基化抗体，如人或人源化的糖基化抗体)进行编码。在细胞筛选方法的某些实施例中，该糖蛋白是从这些细胞表达的分泌型糖蛋白。
[0028]筛选方法的测量步骤可以包括在此披露的用于对糖蛋白上的N-乙酰己糖胺聚糖进行鉴定和/或定量的任何技术。
[0029]在一个第三方面，本发明包括一种用于评估糖蛋白制品的方法。该方法包括对在糖蛋白制品(例如，糖基化抗体制品)中的N-乙酰己糖胺聚糖(例如，N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺聚糖)的量进行测量。
[0030]在一些实施例中，糖蛋白制品是在宿主细胞(例如，原核或真核宿主细胞)中产生。真核细胞可以是例如酵母、昆虫、真菌、植物或动物细胞(例如，哺乳动物细胞)。在此描述了示例性的宿主细胞。
[0031 ] 在一些实施例中，该方法包括在一种印刷的或计算机可读取的介质中，将在糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在或量进行记录。
[0032]在一些实施例中，该方法还包括将所测量的存在于糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的水平与一个参比标准(例如一个对照或参比说明)进行比较。该参比标准可以是一种含有该糖蛋白制品的药物制剂的一种说明(例如，一种FDA标签或医嘱(Physician’ sInsert))或质量标准。
[0033]在一些实施例中，可以将存在于糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的水平测量为相对于样品(例如糖蛋白制品)中的聚糖总量的N-乙酰己糖胺聚糖的水平。
[0034]在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括色谱法。
[0035]在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括质谱(MS)法。
[0036]在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括电泳法(例如毛细管电泳)。
[0037]在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括核磁共振(NMR)法。
[0038]在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括单糖分析。
[0039]在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括荧光法。
[0040]在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括UV-VIS吸收。
[0041]在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括酶法。
[0042]在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括使用一种检测分子(例如一种抗体)。
[0043]在另一方面，本发明包括一种重组糖蛋白，与具有相同或高度相似的氨基酸序列的参比糖蛋白相比，该重组糖蛋白具有不同水平的N-乙酰己糖胺聚糖。如在此使用的高度相似的氨基酸序列是至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99% —致的。
[0044]在一些实施例中，参比糖蛋白是可商购的治疗性糖蛋白，例如在表2中所披露的治疗性糖蛋白。与参比糖蛋白相比，该重组糖蛋白可以具有更高或更低水平的N-乙酰己糖胺聚糖，例如，该重组糖蛋白可以具有高或低至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%的水平的N-乙酰己糖胺聚糖，例如由总聚糖的百分比所测量的，或如相对于GOF、GIF、G2F和糖基化糖肽的总量而测量的。在一个实施例中，重组糖蛋白是IgGl制品，并且重组糖蛋白具有如相对于G0F、G1F、G2F和糖基化糖肽的总量所测量的大于或小于3%、5%、10%、或15%的N-乙酰己糖胺聚糖的水平。在另一个实施例中，重组糖蛋白是IgGl制品，并且重组糖蛋白具有如相对于G0F、G1F、G2F和糖基化糖肽的总量所测量的大于或小于40%、50%或55%的N-乙酰己糖胺聚糖的水平。在又另一个实施例中，重组糖蛋白是IgG2制品，并且重组糖蛋白具有如相对于G0F、G1F、G2F和糖基化糖肽的总量所测量的大于或小于5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、15%、20%、或25%的N-乙酰己糖胺聚糖的水平。
[0045]在另一方面，本披露的特征为用于调节抗体制品的效应子功能的方法。在一些实施例中，该方法包括:
[0046]提供一种抗体制品；并且
[0047]调节(例如增加或减少)该抗体制品的N-乙酰己糖胺聚糖含量。
[0048]在一些实施例中，该方法包括增加抗体制品的N-乙酰己糖胺聚糖含量，例如由此降低抗体制品的效应子功能。在一些实施例中，该方法包括去除与效应子功能相关联的一种或多种聚糖结构(例如唾液酸化聚糖)以及例如添加N-乙酰己糖胺聚糖。在其他实施例中，该方法包括对聚糖结构进行酶修饰或化学修饰以形成N-乙酰己糖胺聚糖，例如用在此所述的酶或化学品。[0049]在其他实施例中，该方法包括减少抗体制品的N-乙酰己糖胺聚糖含量，例如由此增强抗体制品的效应子功能。在一些实施例中，该方法包括去除一种或多种N-乙酰己糖胺聚糖，以及例如添加与效应子功能相关联的聚糖结构(例如唾液酸化聚糖)。在其他实施例中，该方法包括对聚糖结构进行酶修饰或化学修饰以形成与增强的效应子功能相关联的聚糖结构。
[0050]在另一方面，本披露的特征为用于评估抗体制品的效应子功能的方法。在一些实施例中，该方法包括:
[0051]提供一种抗体制品；并且
[0052]对在该制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在或量进行确定。
[0053]附图简要说明
[0054]图1是N-乙酰己糖胺聚糖结构的表示。
[0055]图2描绘了 IgG Fe糖肽的MS/MS碎片，该IgG Fe糖肽包含单一的N连接的N-乙酰己糖胺聚糖。碎片图式将修饰定位在了序列中间的残基297— Asp残基中。
[0056]图3是描绘了存在于可商购的IgG糖蛋白中的截短的N-连接的N-乙酰己糖胺聚糖的百分比的图。基于G0F、G1F、G2F和未糖基化的糖肽的丰度，对包含N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白的相对丰度进行计算。对于每一个所测试的可商购的IgG，这些种类包含大于85%的聚糖组合物。
[0057]
[0058]除非在此下文另外定义，在此使用的所有术语是以它们的原始含义而使用，如将由本领域中普通技术人员所理解的。
[0059]大致，大约，约略(Ca.):如在此使用的，术语“大致”、“大约”或“约略”当应用至一个或多个感兴趣的值时，是指与一个所指出的参考值相似的一个值。在某些实施例中，术语“大致”、“大约”或“约略”是指落在所指出的参考值的5%、4%、3%、2%、1%、或更小比例之内的数值的范围。
[0060]检测(Detection,Detecting):如在此使用的，术语“检测” (“detecting”,“detection”)和“检测手段”可互换地使用以指代特定的化学部分(例如，N-乙酰己糖胺，如N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺)是否存在或不存在于化合物、制品、组合物、细胞或细胞群之中或之上的确定。检测手段可以涉及选择性标记、或可鉴定的特征(例如，荧光或放射性部分)，并且可以涉及试剂、化合物、细胞或细胞群的标记。检测还可以指使用此类技术(如质谱或相关方法、电泳法、核磁共振、色谱法、或以上项的组合)对化合物、制品、组合物、细胞或细胞群的分析，从而确定一种化学部分在化合物、制品、组合物、细胞或细胞群之中或之上的存在或不存在。检测还可以涉及对正被检测的化学部分的绝对或相对水平的定量。
[0061]聚糖:如本领域中已知的并且在此所使用的，“聚糖”是糖类。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，并且可以是直链的或分支的。聚糖可以包括天然的糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、等)和/或修饰的糖(例如，2’ -氟代核糖、2’ -脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺酸基N-乙酰葡糖胺、等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还包括糖蛋白(例如，糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等)的聚糖组分。该术语还包括游离的聚糖，包括从糖蛋白中切割的或另外地由其释放的聚糖。
[0062]聚糖制品:如在此所使用的，术语“聚糖制品”是指根据一个具体的产生方法而获得的一组聚糖。在一些实施例中，聚糖制品是指从一种糖蛋白制品(见以下糖蛋白制品的定义)中获得的一组聚糖。在一些实施例中，聚糖制品包括糖蛋白。在一些实施例中，聚糖制品包括释放的聚糖。
[0063]糖蛋白:如在此所使用的，术语“糖蛋白”是指一种“蛋白质”(如在此定义的)，该蛋白质包含了共价连接至一个或多个糖部分(即，聚糖)上的一个肽主链。如本领域的普通技术人员所理解，这种肽主链典型地包括具有多种氨基酸残基的一个直链。这个或这些糖部分(moiety)可以是处于单糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。这个或这些糖部分可以包括糖残基的一个单一的无分支的链或者可以包括一个或多个分支的链。在某些实施例中，糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基团。可替代地或另外地，糖部分可以包括乙酰基、羟乙酰基、丙基或其他烷基修饰。在某些实施例中，糖蛋白包含O-连接的糖部分；在某些实施例中，糖蛋白包含N-连接的糖部分。
[0064]糖蛋白制品:如在此所使用的，术语“糖蛋白制品”是指一组单独的蛋白质分子，该组中的每一个包含一种特定的氨基酸序列(该氨基酸序列包含至少一个糖基化位点)，并且多种蛋白质具有共价地附连至该至少一个糖基化位点上的至少一种聚糖。在糖蛋白制品中的一种特定糖蛋白的单独的分子典型地具有相同的氨基酸序列，但是可以在该至少一个糖基化位点的占用方面有所不同和/或在被连接至该至少一个糖基化位点上的聚糖的同一性方面所有不同。即，一种糖蛋白制品可以仅包含一种特定的糖蛋白的一种单一的糖形，但是更典型地包含多种糖形。相同的糖蛋白的不同制品可以在所存在的糖形的同一性方面(例如，在一种制品中存在的糖形可能是另一种制品所缺少的)和/或在不同糖形的相对量方面有所不同。
[0065]糖蛋白组合物:如在此使用的，“糖蛋白组合物”是指处于药品或药物产品的形式的糖蛋白制品。
[0066]糖苷酶:如在此所使用的，术语“糖苷酶”是指一种试剂，该试剂切割位于聚糖中顺序的糖之间或糖与主链部分之间(例如，在糖蛋白的糖与肽主链之间)的一个共价键。在一些实施例中，糖苷酶是一种酶。在某些实施例中，糖苷酶是包含一个或多个多肽链的一种蛋白(例如，一种蛋白质酶)。在某些实施例中，糖苷酶是一种化学切割试剂，例如肼。
[0067]N-聚糖:如在此所使用的，术语“N-聚糖”是指糖的一种聚合物，该聚合物已从一种糖蛋白释放，但之前通过一个氮连接(参见以下N-连接的聚糖的定义)被连接至糖蛋白。
[0068]N-连接的聚糖:N-连接的聚糖是通过一个氮连接而连接至一种糖蛋白的聚糖。存在着不同分类的N-连接的聚糖，但是它们典型地基于共同的核心戊糖(Man)3(GlcNAc)(GlcNAc)。
[0069]O-聚糖:如在此所使用的，术语“O-聚糖”是指糖的一种聚合物，该聚合物从一种结合糖中释放出来，但是之前通过一个氧连接(参见以下O-连接的聚糖的定义)被连接至该
结合糖。
[0070]O-连接的聚糖:0_连接的聚糖是通过一个氧连接而连接至一种结合糖的聚糖。O-连接的聚糖典型地通过N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)而被附连至糖蛋白或者通过N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)而被附连至L-丝氨酸(Ser)或L-苏氨酸(Thr)的轻基基团。一些O-连接的聚糖还具有多种修饰，如乙酰化和硫酸化。
[0071]调节:如在此所使用的，术语“调节”是指作用者在规定的限度之内控制一种参数的值(例如，存在于糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的水平)的能力。因此，在一些实施例中，可以将N-乙酰己糖胺聚糖的水平进行调节从而使它维持在规定的限度之内。在一些实施例中，可以将N-乙酰己糖胺聚糖的水平进行调节，从而使得它不会以大于参比标准的
10.0%、5.0%、1.0%、0.5% 或 0.1% 而变化。
[0072]蛋白酶:如在此所使用的，术语“蛋白酶”是指一种试剂，该试剂切割位于多肽链中的顺序的氨基酸之间的肽键。在一些实施例中，蛋白酶是一种酶(即，一种蛋白水解酶)。在某些实施例中，蛋白酶是一种蛋白质(例如，一种蛋白质酶)，该蛋白质包含一个或多个多肽链。在某些实施例中，蛋白酶是一种化学切割剂。
[0073]提供:如在此使用的，术语“提供”是指作用者从任何来源获得一种主题物件(例如细胞制品或糖蛋白制品)，包括但不限于通过作用者的自己的制造而获得或者通过作用者从另一个团体接受该物件。例如，如果细胞制品由任何机器、人、或实体来制造或接受的话，则该细胞制品得以提供。在一些实施例中，细胞制品可以被机器所接受，然后它可进行糖蛋白制品的一种或多种测试、处理、或精制。在一些实施例中，细胞制品可以被人接受。在一些实施例中，CHO细胞制品可以从一个外界的实体被接受。在一些实施例中，细胞制品可以被一个人或业务单位(为第二个人或业务单位进行表征服务)所接受。
[0074]N-乙酰己糖胺聚糖:如在此使用的术语“N-乙酰己糖胺”描述了在图1中所展示的聚糖结构。
[0075]某些实施方案的详细i兑明
[0076]虽然用于合成重组糖蛋白的宿主细胞具有产生复杂的糖基化的胞内机器，但这些细胞不总是具有与天然地表达糖蛋白的细胞相同的酶组分。在制造条件下的细胞系和变体的克隆选择还可以产生在培养的细胞中所表达的糖蛋白方面的异质性。在糖蛋白活性中糖基化的功能作用使得对在细胞系中所产生的治疗产品的仔细表征成为必需。
[0077]本披露至少部分地是基于出人意料的发现:许多糖蛋白制品(例如，糖基化抗体制品)包含非常规的N-连接的N-乙酰己糖胺聚糖结构。例如，已经发现可以在糖基化抗体制品中的抗体的Fe区的糖基化位点Asn297处找到N-连接的N-乙酰己糖胺聚糖。许多糖基化抗体制品包含此结构，并且因此在生产糖基化抗体制品时重要的是鉴定、监测并控制聚糖结构的这个方面。
[0078]本披露提供了分析糖蛋白上的聚糖的组成的方法。根据本披露，可以将来自糖蛋白制品的聚糖进行分析以确定它们是否包含N-乙酰己糖胺聚糖。本披露提供了检测与糖蛋白制品(例如，糖基化抗体制品，如在此所述的糖基化抗体制品)相关联的N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在或量的方法，以及产生包含了一定量的聚糖结构或缺乏这种聚糖结构的糖蛋白的方法。
[0079]聚糖制品
[0080]本披露提供了对在聚糖制品中的单独的聚糖的结构和/或组成进行分析的方法，例如针对N-乙酰己糖胺聚糖(N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺)的不存在、存在或量进行评估。聚糖制品可以从由本领域内的任何可供使用的方法所制得的一种细胞制品或一种糖蛋白而获得。总体而言，获得一种聚糖制品包括以下步骤:(I)获得一种细胞或糖蛋白制品；并且(2)可任选地使聚糖从该细胞或糖蛋白制品释放。在一些实施例中，获得一种聚糖制品可任选地包括用一种可检测的标记物对该聚糖制品进行标记。
[0081]糖蛋白制品
[0082]已经描述了用于重组生产糖蛋白的方法。由所培养的细胞分泌的糖蛋白可以通过任何可获得的手段来分离和纯化，例如，阴离子交换色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、免疫亲和层析、及其组合。
[0083]N-连接的聚糖制品
[0084]在一些实施例中，N-聚糖制品是通过提供一种糖蛋白群体并且从该群体中的糖蛋白中移出N-连接的聚糖而获得。
[0085]在一些实施例中，N-连接的聚糖是通过消化而从糖蛋白(例如糖蛋白)移出。总体而言，根据本披露有待使用的聚糖酶在核心的GlcNAc-Asn、GlcNAc-GlcNAc、或Man-GlcNAc残基之间进行切割。可用于从糖蛋白移出N-连接的聚糖的示例性酶类包括但不限于，N-聚糖酶F和/或N-聚糖酶-A、O-聚糖酶和/或Endo H。
[0086]在一些实施例中，N-连接的聚糖是通过化学切割而从糖蛋白移出。仅给出一些实例，肼、硼氢化钠、和/或三氟甲磺酸(TFMS)可以用于将聚糖从糖蛋白移出。
[0087]O-连接的聚糖制品
[0088]在一些实施例中，O-连接的聚糖制品是通过提供一种糖蛋白(例如，糖蛋白)群体并且从该群体中的糖蛋白中移出O-连接的聚糖而获得。
[0089]在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过β消除而从糖蛋白(例如糖蛋白)移出。在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过还原性β消除而从糖蛋白(例如糖蛋白)移出。在一些实施例中，O-聚糖是通过非还原性β消除而从糖蛋白(例如糖蛋白)移出。
[0090]在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过将制品孵育在包含碱性四氢硼酸盐的溶液中而从糖蛋白(例如，糖蛋白)制品移出。在一些实施例中，使用了砸兒化盐，从而例如将兒标记并入以协助O-连接的聚糖的检测。在不同的示例性方法中，在42°C -45°c下，将糖蛋白制品孵育在包含0.8M-1.0M NaBH4和0.05M-0.1M NaOH的溶液中持续2-24小时。移出O-连接的聚糖的反应可以通过添加酸(例如，1.0M HCl)而终止。
[0091]在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过将制品孵育在包含NaOH的溶液中而从糖蛋白制品移出。在不同的示例性方法中，在27°C_45°C下，将糖蛋白孵育在包含50mM-200mMNaOH的溶液中持续2-48小时。反应可以通过添加酸而终止。
[0092]在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过将制品孵育在包含NH4OH的溶液中而从糖蛋白制品移出。在不同的示例性方法中，在45°C -60°C下，将糖蛋白孵育在包含25%-28%NH4OH的溶液中持续2-40小时。该反应可以通过在真空下去除NH4OH而终止。在一些实施例中，该溶液包含(例如，在饱和浓度下的)碳酸铵。在一些实施例中，将经NH4OH处理的制品用酸(例如硼酸)进行处理。
[0093]在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过将制品孵育在包含乙胺(例如，大约70%的乙胺)或甲胺(例如，大约40%的甲胺)的水溶液中持续大约4-24小时而从糖蛋白制品移出。
[0094]在一些实施例中，O-连接的聚糖制品是从N-连接的聚糖已经被移出的糖蛋白群体获得。
[0095]标记聚糖[0096]在一些实施例中，可以在聚糖从糖蛋白释放之前或之后将标记物与聚糖相关联。可以将N-连接的聚糖或O-连接的聚糖(例如，已经从一种糖蛋白群体移出的N-聚糖)与一种或多种可检测的标记物相关联。典型地将可检测的标记物与聚糖的还原端相关联。在一些实施例中，可检测的标记物是荧光部分。根据本披露可以使用的示例性的荧光团包括但不限于2-氨基苯甲酸(2AA)、2-氨基苯甲酰胺(2AB)、和/或2-氨基嘌呤(2AP)。总体而言，根据本披露而使用的荧光团的特征在于在不损害和/或破坏聚糖的条件下具有与寡糖和/或单糖的还原端的反应性。在一些实施例中，荧光部分被直接地附接至还原端。例如，直接附接可以通过还原胺化作用的直接结合而完成。在一些实施例中，荧光部分被间接地附接至还原端。例如，间接附接可以通过一个反应性的连接臂而完成。
[0097]在一些实施例中，可检测的标记物包括放射性部分或经同位素标记的分子。根据本披露可以使用的示例性的放射性部分包括但不限于氚(3H)、氘(2H)、和/或35s。典型地，此类部分被直接地附接至荧光团或者以其他方式与荧光团相关联。仅给出一个放射性荧光团的实例，可以对2AP进行修饰以使得所有的氢都被氘化。
[0098]聚糖的释放
[0099]本披露提供了确定糖蛋白的糖基化模式的改进的方法。此类方法可以涉及使一种聚糖群体经受一种或多种外切糖苷酶处理并且对这些消化产物的结构和/或组成进行分析。在一些实施例中，根据本披露所使用的外切糖苷酶仅识别并且切割一种特定类型的糖苷连接。在一些实施例中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割多于一种特定类型的糖苷连接。在这些外切糖苷酶中，对于本发明而言可以有用的是α-半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶；己糖胺酶、甘露糖苷酶；及其组合。
[0100]外切糖苷酶
[0101]外切糖苷酶是从聚糖的非还原端对末端的糖苷键进行切割的酶类。它们对于特定的单糖连接以及异头性(α /β )是典型地高度特异性的。在一些实施例中，相邻的分枝模式可以影响外切糖苷酶的特异性。外切糖苷酶处理通常导致标准的触角连接的聚糖被切割成包含3个甘露糖以及2个GIcNAc残基的戊糖核心(Μ3Ν2)。然而，非常规的修饰的种类(例如，触角或核心岩藻糖化的种类、高甘露糖以及杂合聚糖、乳糖胺扩展的聚糖、硫酸化的聚糖、磷酸化的聚糖，等等)对外切糖苷酶处理具有耐受性，并且可以将它们用色谱方式分辨出并且相对于Μ3Ν2戊糖进行定量。
[0102]根据本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶包括但不限于:唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。外切糖苷酶可以从任何来源(包括商业来源)获得或者通过从一种细胞来源(例如细菌、酵母、植物、等等)的分离和/或纯化而获得。
[0103]在一些实施例中，外切糖苷酶(例如，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶)可以被分成多个类别或“亚组”。在一些实施例中，不同的亚组显示出对于切割不同类型的连接的不同能力。表I提出了一些示例性的外切糖苷酶，它们的连接特异性、以及从中衍生出每一项的生物体。本领域的普通技术人员应当理解这是一个示例性的，而非全面的外切糖苷酶的列表，并且可以根据本披露使用具有任何连接特异性的任何外切糖苷酶。
[0104]表1.外切糖苷酶
[0105]
【权利要求】
1.一种用于评估糖蛋白制品的方法，该方法包括: 提供一种糖蛋白制品； 对在该制品中的N-乙酰己糖胺的不存在、存在或量进行确定；并且可任选地，基于在该制品中该N-乙酰己糖胺的不存在、存在或量，作出一个关于该糖蛋白制品的决定。
2.如权利要求1所述的方法，其中该测量步骤包括以下任一项: 对糖蛋白进行分离并且对N-乙酰己糖胺聚糖进行测量 从一种糖蛋白制品获得一种聚糖制品，并且对在该聚糖制品中的N-乙酰己糖胺聚糖进行测量， 对存在于一种糖蛋白上的聚糖进行切割，并且对N-乙酰己糖胺聚糖进行检测，并且提供来自一种糖蛋白制品的至少一种肽，并且对在该至少一种肽上的N-乙酰己糖胺聚糖进行测量。
3.如权利要求1所述的方法，进一步包括将所确定的水平与一个参比水平或说明进行比较的一个步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其中测量包括一种用于对N-乙酰己糖胺聚糖进行鉴定或定量的方法的使用，该方法选自下组，该组由以下各项组成:色谱法、质谱(MS)法、电泳法、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收、酶法、使用一种检测分子、及其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其中该糖蛋白制品是来自在一种用于制造糖蛋白的生物反应器中的一种细胞培养物的一`个样品。
6.如权利要求1所述的方法，其中这些提供和测量步骤是随着时间的推移而重复至少一次。
7.如权利要求1所述的方法，进一步包括在一种印刷的或计算机可读取的介质中，将该测量步骤的结果进行记录的一个步骤。
8.如权利要求1所述的方法，其中该测量步骤包括进行一种色谱法。
9.如权利要求1所述的方法，其中该测量步骤包括进行一种质谱(MS)法。
10.如权利要求1所述的方法，其中该测量步骤包括进行一种电泳法。
11.如权利要求1所述的方法，其中该测量步骤包括进行一种核磁共振(NMR)法。
12.一种用于针对于产生含有N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白的能力而筛选细胞的方法: 提供对一种糖蛋白进行表达的多个细胞群； 在适合于一种糖蛋白制品的表达的条件下，将该多个细胞群的每一个进行培养； 对由该多个细胞的一个或多个所产生的N-乙酰己糖胺聚糖进行测量，并且基于由该细胞制品所产生的一个目标水平的N-乙酰己糖胺聚糖的存在而选择该多个细胞制品中的一个或多个。
13.如权利要求12所述的方法，其中用一种分离的糖蛋白对这些N-乙酰己糖胺聚糖进行测量。
14.如权利要求12所述的方法，其中用从一种糖蛋白制品获得的肽对这些N-乙酰己糖胺聚糖进行测量。
15.如权利要求12所述的方法，其中用从一种糖蛋白制品获得的聚糖制品对这些N-乙酰己糖胺聚糖进行测量。
16.如权利要求12所述的方法，其中该测量步骤包括以下:(i)将一种糖蛋白制品从该多个细胞群的每一个进行分离，并且(ii)对来自该糖蛋白制品的N-乙酰己糖胺聚糖进行测量。
17.如权利要求12所述的方法，其中该细胞培养物是在一种生物反应器中。
18.如权利要求12所述的方法，其中测量包括用于对N-乙酰己糖胺聚糖进行鉴定或定量的一种技术的使用，该技术选自下组，该组由以下各项组成:色谱法、质谱(MS)法、电泳法、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收、酶法、使用一种检测分子、及其组八口 ο
19.如权利要求12所述的方法，其中该多个细胞群的至少一个已经用一种载体进行了转化，该载体对一种人糖蛋白进行编码。
20.如权利要求12所述的方法，其中该多个细胞群包括选自下组的至少一种特征，该组由以下各项组成:至少两种不同的品系、至少两种不同的克隆细胞群、以及来自一个针对该糖蛋白的制造工艺的至少两种不同的样品。
21.如权利要求12所述的方法，进一步包括将所选择的细胞制品进行培养以产生该糖蛋白制品的步骤。
22.—种用于评估糖蛋白制品的方法,包括:对存在于一种糖蛋白制品中的一种N-乙酰己糖胺聚糖的量进行测量，例如一种N-乙酰葡糖胺聚糖， 由此而评估该糖蛋白制品。`
23.如权利要求22所述的方法，进一步包括在一种印刷的或计算机可读取的介质中，将存在于该糖蛋白组合物中的N-乙酰己糖胺聚糖的水平进行记录。
24.如权利要求22所述的方法，进一步包括将所测量的存在于该糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的水平与一个参比水平进行比较。
25.如权利要求24所述的方法，其中该参比水平是针对一种包含该糖蛋白的药物制品的一个说明或质量标准。
26.如权利要求22所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的量进行测量包括进行一种色谱法。
27.如权利要求22所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的量进行测量包括进行一种质谱(MS)法。
28.如权利要求22所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的量进行测量包括进行一种核磁共振(NMR)法。
29.如权利要求22所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的量进行测量包括进行单糖分析。
30.如权利要求22所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的量进行测量包括进行一种荧光法。
31.如权利要求22所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的量进行测量包括进行一种UV-VIS吸收法。
32.如权利要求22所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的量进行测量包括进行一种酶法。
33.一种用于调节抗体制品的效应子功能的方法，包括:提供一种抗体制品；并且 调节该抗体制品的N-乙酰己糖胺聚糖含量，由此调节该抗体制品的效应子功能。
34.一种用于制造糖蛋白制品的方法，该方法包括: 培养细胞以产生一种重组糖蛋白制品； 对在所产生的制品中的N-乙酰己糖胺的不存在、存在或量进行确定；并且 基于该确定，将该糖蛋白制品加工为一种药物产品。
35.如权利要求34所述的方法，进一步包括将所确定的N-乙酰己糖胺的不存在、存在或量与用于该糖蛋白制品的针对N-乙酰己糖胺的不存在、存在或量而言的一个参比值进行比较。`
【文档编号】G01N33/48GK103782168SQ201280012595
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年3月12日 优先权日:2011年3月12日
【发明者】N·沃什伯恩, E·阿雷瓦洛, K·米莉, C·J·博斯克斯, J·杜夫纳, B·E·柯林斯 申请人:动量制药公司