一种用于富集糖蛋白的凝集素磁性纳米材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及糖基化蛋白的分离纯化，具体涉及一种用于富集糖蛋白的凝集素磁性纳米材料的制备方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质糖基化是一种普遍存在的翻译后修饰，也是蛋白质翻译后最重要的修饰之一。糖基化蛋白参与了蛋白质折叠，细胞分裂，信号传导，免疫应答和细胞识别等许多重要的生命活动过程。其异常表达与众多疾病的发生发展密切相关，目前发现的疾病标志物很多是糖基化蛋白质。糖基化蛋白质研宄对于生物医药和疾病的诊断、治疗有着很重要的意义。然而糖基化蛋白质在动物体内相对丰度较低、动态范围宽，质谱检测时易受高丰度的非糖基化蛋白质干扰。因此，从复杂的混合物中分离富集出低丰度的糖基化蛋白，是目前进行糖基化蛋白质组学研宄中最为关键的步骤。
[0003]凝集素对糖基化蛋白具有专一的特异亲和力，并且不会破坏糖链结构，因此，常被用于糖蛋白的分离和富集。而四氧化三铁磁性纳米材料是一类非常重要的无机功能材料，具有优良的磁响应能力、大的比表面积和易于修饰的表面。将磁性纳米材料与凝集素亲和色谱法结合得到的凝集素磁性纳米材料因兼具两者的优点而受到青睐。但是，常用的凝集素固载方法有化学键和物理吸附法，其中化学键作用力较强，会造成凝集素变性或活性降低；而物理吸附法的作用力较弱，导致凝集素在实验过程中出现泄漏的情况(J.Tang, Y.Liu, P.Yin, G.Yao, G.Yan, C.Deng, X.Zhang, Proteomics 10 (2010)2000-2014.)。螯合作用力较之常用的化学键和物理吸附法，既保证了凝集素的活性又增加了凝集素的固载量。基于螯合作用将凝集素固载于磁性纳米粒子表面的文献或专利目前尚未有报道。
【发明内容】
[0004]磁性纳米粒子具有比表面积大和易于修饰的表面，生物相容性、稳定性以及磁响应性好的优势。而凝集素对糖蛋白具有专一的特异亲和力，将凝集素高含量、高活性地固载于磁性纳米粒子表面，从而制备出高选择性富集糖蛋白的凝集素磁性纳米材料。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
采用共沉淀法，一步合成螯合剂功能化的磁性纳米粒子，以二价铜离子为桥基，通过螯合作用将一种或多种凝集素固载于磁性纳米粒子表面，形成结构稳定的凝集素磁性纳米材料，该方法包括以下步骤:
O制备螯合剂功能化的磁性纳米粒子:在加热条件下，FeCl3.6H20、FeSO4.7H20与螯合剂在碱性环境中，经共沉淀反应制备得到螯合剂功能化的磁性纳米粒子；
2)制备铜离子功能化的磁性纳米粒子:将步骤I)所得产物加入到二价铜离子溶液中，通过螯合作用，形成铜离子功能化的磁性纳米粒子；
3)制备凝集素功能化的磁性纳米材料:将步骤2)所得产物加入到凝集素溶液中，通过螯合作用，形成凝集素功能化的磁性纳米材料。
[0006]本发明制备方法中，步骤I)中所用的螯合剂选择带有氨基或羧基的分子，其分子主链长为5?11个碳或氮原子的柠檬酸，或氮川三乙酸，或N-羟乙基乙二胺三乙酸，或乙二胺四乙酸，或丙二胺四乙酸，或二乙烯三胺五乙酸五钠，或三乙烯四胺分子。
[0007]本发明制备方法中，步骤3)中所用的凝集素选择伴刀豆球蛋白凝集素(Con A)、麦胚凝集素(WGA)、雪花莲凝集素(GNA)、扁豆凝集素(LCH)、朝鲜槐凝集素(MAL)其中的一种或一种以上凝集素。
[0008]有益效果:本发明提出了一种基于螯合作用机理将凝集素固载于磁性纳米粒子表面的方法，较之常用的化学键和物理吸附法，既保证了凝集素的活性，又提高了凝集素的固载量，克服了其它文献报道中凝集素固载量和活性低的问题(B.H.Lai, C.H.Chang, C.C.Yeh, D.H.Chen, Sep.Purif.Technol.108 (2013) 83-88)。另外，此材料的抗干扰能力强，能在600倍非糖蛋白的干扰下，选择性富集糖蛋白，并且具有结合容量高，结合解析速度快的优点，减少传统方法中复杂的分离、纯化过程。和现有技术相比，本发明在保证材料良好的结构稳定性和富集效果的同时，制备方法具有成本低廉、工艺简单和省时的优点，特别适用于对糖基化蛋白质组学的研宄。
【附图说明】
[0009]图1为凝集素磁性纳米材料的表征。(a) A:乙二胺四乙酸修饰的磁性纳米材料(EDTA-MNPs)，B:伴刀豆球蛋白凝集素修饰的磁性纳米材料(Con A-MNPs)的透射电镜图；(b)Con A-MNPs对外加磁场的感应图；(c) A:EDTA_MNPs，B:Cu-MNPs, C:Con A-MNPs 的红外光谱图；(d)A:EDTA-MNPs，B:Cu-MNPs, C:Con A-MNPs 的热重图。
[0010]图2为EDTA-MNPs和Cu-MNPs对OB和Lyz混合蛋白吸附的凝胶电泳图，OB和Lyz的摩尔比为1:300 ；M:蛋白marker; Wl:EDTA_MNPs的洗涤液；E1:EDTA_MNPs的洗脱液；W2:Cu-MNPs的洗涤液；E2:Cu-MNPs的洗脱液。
[0011]图3为Con A-MNPs对标准混合蛋白样品吸附的凝胶电泳图，(a)混合蛋白为OB和Lyz，摩尔比为1:600 ； (b)混合蛋白为Hb和Lyz，摩尔比为1:600 ；M:蛋白marker ；S:上清液；W1:第一次的洗涤液；W2:第二次的洗涤液；E:洗脱液。
[0012]图4为Con A-MNPs对鸡蛋清样品吸附的凝胶电泳图，M:蛋白marker ； X 100:稀释了 100倍的鸡蛋清样品；S1:Con A-MNPs吸附稀释了 100倍鸡蛋清样品后的上清液；E1:洗脱液；X 500:稀释了 500倍的鸡蛋清样品；S2:Con A-MNPs吸附稀释了 500倍鸡蛋清样品后的上清液；E2:洗脱液。
【具体实施方式】
[0013]下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。
[0014]实施例1
将3.05 g FeCl3.6Η20和2.1 g FeSO4.7Η20分别溶于50 mL蒸馏水中，混合于三口瓶中并加热至90°C，加入5 mL质量比为25%的氨水和25 mL浓度为25 mg/mL的乙二胺四乙酸溶液，于90°C搅拌30 min制得乙二胺四乙酸功能化的磁性纳米粒子，磁性分离，并用蒸馏水洗涤至中性；取1.5 mg上述产物，加入到I mL浓度为0.5 M，pH为5.0的二价铜离子溶液中，室温摇动60 min制得螯合有铜离子的磁性纳米粒子，磁性分离，并用pH 5.0的蒸馏水洗涤，除去未反应的铜离子；加入I mL浓度为I mg/mL的伴刀豆球蛋白溶液，室温摇晃60 min制得伴刀豆球蛋白凝集素功能化的磁性纳米材料。材料的透射电镜、磁响应性、红外光谱图和热重分析图见图1:其尺寸约为15 nm，并且伴刀豆球蛋白的含量高达28wt%，在此基础上仍然保持了良好的磁响应性。
[0015]实施例2
将1.5 g FeCl3.6Η20和1.05 g FeSO4.7Η20分别溶于25 mL蒸馏水中，混合于三口瓶中并加热至100°C，加入2.5 mL质量比为25%的氨水和12.5 mL浓度为25 mg/mL的丙二胺四乙酸溶液，于100°C搅拌10 min制得丙二胺四乙酸功能化的磁性纳米粒子，磁性分离，并用蒸馏水洗涤至中性；取0.5 mg上述产物，加入到0.5 mL浓度为0.5 M，pH为4.0 二价铜离子溶液，摇动30 min制得螯合有铜离子的磁性纳米粒子，磁性分离，并用pH 4.0蒸馏水洗涤；加入0.5 mL浓度为I mg/mL的麦胚凝集素溶液，室温摇晃30 min制得麦胚凝集素功能化的磁性纳米材料。
[0016]实施例3
将6.1 g FeCl3.6H20和4.2 g FeSO4.7H20分别溶于100 mL蒸馏水中，混合于三口瓶中并加热至80°C，加入10 mL质量比为25%的氨水和50 mL浓度为25 mg/mL的柠檬酸溶液，于80°C搅拌120 min制得柠檬酸功能化的磁性纳米粒子，磁性分离，并用蒸馏水洗涤至中性；取5 mg上述产物，加入到3 mL浓度为0.5 M，pH为7.0 二价铜离子溶液中，摇动120min制得螯合了铜离子的磁性纳米粒子，磁性分离，并用pH 7.0的蒸馏水洗涤；加入5 mL浓度为I mg/mL的雪花莲凝集素溶液，室温摇晃120 min制得雪花莲凝集素功能化的磁性纳米材料。
[0017]实施例4
将3.05 g FeCl3.6Η20和2.1 g FeSO4.7Η20分别溶于50 mL蒸馏水中，混合于三口瓶中并加热至90°C，加入5 mL质量比为25%的氨水和25 mL浓度为25 mg/mL的氮川三乙酸溶液，于90°C搅拌30 min制得氮川三乙酸功能化的磁性纳米粒子，磁性分离，并用蒸馏水洗涤至中性；取1.5 mg上述产物，加入到I mL浓度为0.5 M，pH为5.0 二价铜离子溶液中，摇动60 min制得螯合了铜离子的磁性纳米粒子，磁性分离，并用pH 5.0的蒸馏水洗涤；加入I mL浓度为I mg/mL的伴刀豆球蛋白凝集素和麦胚凝集素混合溶液，室温摇晃60 min,得到的产物即两种凝集素功能化的磁性纳米材料。
[0018]实施例5
将3.05 g FeCl3.6Η20和2.1 g FeSO4.7Η20分别溶于50 mL蒸馏水中，混合于三口瓶中并加热至90°C，加入5 mL质量比为25%的氨水和25 mL浓度为25 mg/mL的N-羟乙基乙二胺三乙酸溶液，于90°C搅拌30 min,将产物磁性分离，并用蒸馏水洗涤至中性；取1.5 mg上述产物，加入到I mL浓度为0.5 M，pH为5.0 二价铜离子溶液中，摇动60 min制得螯合了铜离子的磁性纳米粒子，磁性分离，并用PH 5.0的蒸馏水洗涤；在上述产物中加入I mL浓度为I mg/mL的雪