花莲凝集素、扁豆凝集素和朝鲜槐凝集素混合溶液，室温摇晃60 min,得到的产物即三种凝集素功能化的磁性纳米材料。
[0019]实施例6
将3.05 g FeCl3.6Η20和2.1 g FeSO4.7Η20分别溶于50 mL蒸馏水中，混合于三口瓶中并加热至90°C，加入5 mL质量比为25%的氨水和25 mL浓度为25 mg/mL的二乙烯三胺五乙酸五钠溶液，于90°C搅拌30 min,将产物磁性分离，并用蒸馏水洗涤至中性；取1.5 mg上述产物，加入到I mL浓度为0.5 M，pH为5.0 二价铜离子溶液中，摇动60 min制得螯合了铜离子的磁性纳米粒子，磁性分离，并用PH 5.0的蒸馏水洗涤；在上述产物中加入I mL浓度为I mg/mL的麦胚凝集素、雪花莲凝集素、扁豆凝集素及朝鲜槐凝集素混合溶液，室温摇晃60 min，得到的产物即四种凝集素功能化的磁性纳米材料。
[0020]实施例7
将6.1 g FeCl3.6Η20和4.2 g FeSO4.7Η20分别溶于100 mL蒸馏水，混合于三口瓶中并加热至100°C。加入10 mL质量比为25%的氨水和50 mL浓度为25 mg/mL的三乙烯四胺溶液，于100°C搅拌120 min ;将产物磁性分离，并用蒸馏水洗涤至中性；取5 mg上述产物，加入到3 mL浓度为0.5 M，pH 7.0的二价铜离子溶液中，摇动120 min制得螯合了铜离子的磁性纳米粒子，磁性分离，并用pH 7.0的蒸馏水洗涤；在上述产物中加入5 mL浓度为Img/mL的伴刀豆球蛋白凝集素、麦胚凝集素、雪花莲凝集素、扁豆凝集素及朝鲜槐凝集素混合溶液，室温摇晃120 min，得到的产物即五种凝集素功能化的磁性纳米材料。
[0021]应用例I
本实例以采用上述制备方法制得的凝集素磁性纳米材料对标准糖基化蛋白进行富集，对富集效果进行评价，其具体步骤如下:
1、样品溶液的制备
I)两种标准糖蛋白样品溶液:将卵清蛋白(0B)，结合珠蛋白(Hb)分别溶于缓冲液(20mM Tris, 0.15 M NaCl, I mM MnCl2, I mM CaCl2, pH 7.4)中，形成终浓度为 I mg/mL 的蛋白溶液。
[0022]2)非糖蛋白样品溶液:将溶菌酶(Lyz)溶于缓冲液中，形成终浓度为5 mg/mL的蛋白溶液。
[0023]2、样品的吸附
对糖蛋白OB的动力学吸附:2 mg材料经缓冲液洗涤后分散于2 mL I mg/mL的OB溶液中，于室温下轻微震荡吸附，考察不同吸附时间对OB吸附的影响。吸附停止后，磁分离，取上清液用于紫外检测。
[0024]对糖蛋白OB的等温吸附:2 mg材料经缓冲液洗涤后分散于2 mL不同浓度的OB溶液中，于室温下轻微震荡吸附，考察不同浓度对OB吸附的影响。吸附停止后，磁分离，取上清液用于紫外检测。
[0025]对糖蛋白的选择性吸附:2 mg材料经缓冲液洗涤后，加入糖蛋白和非糖蛋白的混合溶液，其中考察了糖与非糖蛋白的摩尔比分别为1:30，1: 150，1:300，1:600时对糖蛋白吸附的影响。吸附停止后，磁分离，并用500 μ?缓冲液洗涤5次。向吸附后的材料中加入500 uL浓度为IM的氨水溶液，室温震荡洗脱10 min，磁分离，取出洗脱液。收集上清液，洗涤液和洗脱液，真空离心干燥后用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
[0026]3、样品的检测
SDS-PAGE步骤:干燥后的样品复溶于一定体积的缓冲液中，加入样品缓冲溶液，振荡均匀后，在95°C煮3 min，离心除去不溶物质。制备好的样品，在12%的SDS_PAGE(B1-Rad，Hercules, USA)胶片上进行分析。电泳时采用恒电流模式，电流为28 mA。电泳结束后，用考马斯亮蓝(R-250)染色法染色。
[0027]检测结果参见图2和图3。图2是乙二胺四乙酸和铜离子分别修饰的磁性纳米材料对标准混合蛋白吸附的凝胶电泳图。在糖:非糖蛋白摩尔比为1:300的条件下，发现在其洗脱液中有明显的非糖蛋白Lyz的条带。说明这两种材料对糖蛋白的吸附没有选择性。而图3是凝集素功能化的磁性纳米材料对标准混合蛋白吸附的凝胶电泳图。(a)是OB和Lyz的蛋白混合溶液，(b)是Hb和Lyz的蛋白混合溶液。在糖:非糖蛋白摩尔比为1:600的条件下，非糖蛋白Lyz出现在上清液和洗涤液中，糖蛋白OB明显只出现在洗脱液中。对糖蛋白表现出优良的选择吸附性。这是由于凝集素完全包覆了磁性纳米材料，降低了材料的非特异性吸附，使材料对糖蛋白具有良好的专一亲和力。
[0028]应用例2
本实例以采用上述制备方法制得的凝集素磁性纳米材料对新鲜鸡蛋清中的糖蛋白进行分离富集，其具体步骤如下:
1、样品溶液的制备
取一定量的鸡蛋清，并用缓冲液分别稀释至100倍和500倍，放于冰箱中保鲜备用。
[0029]2、样品吸附与洗涤
取4 mg材料，用缓冲液润洗两次，加入300 PL稀释好的蛋清溶液。室温下轻微震荡吸附30 min后，磁分离，用缓冲液洗涤三次，收集上清液和洗涤液。
[0030]3、样品的洗脱与检测
向吸附后的材料中加入洗脱液，室温震荡洗脱10 min后磁分离，取出洗脱液。将吸附前的样品溶液，吸附后的上清液和洗脱液干燥后复溶于150 μ?缓冲溶液中，加入150 μ?样品缓冲液，震动均匀后，95°c煮蛋白3 min，离心去除不溶物，用于SDS-PAGE分析。
[0031]检测结果参见图4:鸡蛋清中的糖基化蛋白卵铁传递蛋白(76.7 kDa)，卵抑制剂(49 kDa)和卵清蛋白(45 kDa)，以及非糖基化蛋白溶菌酶(14.4 kDa)，在吸附前的样品溶液中都可以检测到。经过制备的凝集素磁性纳米材料吸附后，只有前三个糖基化蛋白出现在洗脱液中，而Lyz保留在吸附后的上清液中，在洗脱液中没有检测到。结果表明制备的凝集素磁性纳米材料选择吸附性良好，对复杂生物样品中糖蛋白的富集具有较大的潜力。
【主权项】
1.一种用于富集糖蛋白的凝集素磁性纳米材料，其特征在于，采用共沉淀法，一步合成螯合剂功能化的磁性纳米粒子，以二价铜离子为桥基，通过螯合作用将凝集素固载于磁性纳米粒子表面。
2.—种用于富集糖蛋白的凝集素磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: O制备螯合剂功能化的磁性纳米粒子:在加热条件下，FeCl3.6H20、FeSO4.7H20与螯合剂在碱性环境中，经共沉淀反应制备得到螯合剂功能化的磁性纳米粒子； 2)制备铜离子功能化的磁性纳米粒子:将步骤I)所得产物加入到二价铜离子溶液中，通过螯合作用，形成铜离子功能化的磁性纳米粒子； 3)制备凝集素功能化的磁性纳米材料:将步骤2)所得产物加入到凝集素溶液中，通过螯合作用，形成凝集素功能化的磁性纳米材料。
3.根据权利要求2所述凝集素磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤I)具体为:将 1.5 ?6.1 g FeCl3.6H20 和 1.05 ?4.2 g FeSO4.7H20 分别溶于 25 ?100 mL蒸馏水，混合于三口瓶中并加热至80?100°C ;加入2.5?10 mL质量比为25%的氨水和12.5?50 mL浓度为25 mg/mL的螯合剂水溶液，于80?100°C条件下揽拌10?120 min制得螯合剂功能化的磁性纳米粒子；磁性分离，并用蒸馏水洗涤至中性备用。
4.根据权利要求2所述凝集素磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤I)中，所述螯合剂选择带有氨基或羧基的分子，其分子主链长为5?11个碳或氮原子的柠檬酸，或氮川三乙酸，或N-羟乙基乙二胺三乙酸，或乙二胺四乙酸，或丙二胺四乙酸，或二乙烯三胺五乙酸五钠，或三乙烯四胺分子。
5.根据权利要求2所述凝集素磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体为:取0.5?5 mg步骤I)所制得的螯合剂功能化磁性纳米粒子，加入到0.5?3 mL浓度为0.5 M，pH为4.0?7.0的二价铜离子溶液中，室温下摇动30?120 min制得螯合有铜离子的磁性纳米粒子；磁性分离，用PH 4.0?7.0的蒸馏水洗涤，除去未反应的铜离子。
6.根据权利要求2所述凝集素磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为:在步骤2 )得到的产物中，加入0.5?5 mL浓度为I mg/mL凝集素溶液，室温下摇动30?120 min制得凝集素功能化的磁性纳米材料。
7.根据权利要求2所述凝集素磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述凝集素选择伴刀豆球蛋白凝集素(Con A)、麦胚凝集素(WGA)、雪花莲凝集素(GNA)、扁豆凝集素(LCH)、朝鲜槐凝集素(MAL)其中的一种或一种以上凝集素。
【专利摘要】本发明涉及一种用于富集糖蛋白的凝集素磁性纳米材料及其制备方法，属于纳米材料和生物分离领域。所述的凝集素磁性纳米材料是采用共沉淀法一步合成螯合剂功能化的磁性纳米粒子，以二价铜离子为桥基，通过螯合作用将凝集素固载于功能化的磁性纳米粒子表面，形成稳定的三明治结构体：螯合剂-二价铜离子-凝集素。较之常用的化学键和物理吸附等固载方法，固载条件温和，不破坏凝集素结构，可有效保证了凝集素的生物活性，同时材料具有良好的磁响应性。本发明提供了一种成本低廉、工艺简单、节省时间制备凝集素磁性纳米材料的新方法，采用该方法制备的材料特别适用于复杂体系中糖蛋白的快速富集。
【IPC分类】B01J20-30, B01J20-24, C07K1-22
【公开号】CN104772124
【申请号】CN201510203831
【发明人】封顺, 董丽萍, 徐世美
【申请人】新疆大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月27日