化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用的制作方法

专利名称：：化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用的制作方法
技术领域：
：本发明化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及的是化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV2病毒gD糖蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒的gD糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。
背景技术：
：单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)是最早发现的人类疱疹病毒，容易导致复发性感染和潜伏感染，对人体危害严重，分为HSV-1及HSV-2两个血清型。1型单纯疱疹病毒主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等；而2型主要引起生殖器感染，并且和女性宫颈癌的发生密切相关。近年HSV2的感染显著增多，约占该病的10%40%。目前药物治疗HSV感染时常出现相应耐药性，所以研制疫苗是切实可行的有效方法，它能使机体在抗HSV感染免疫中，发挥体液免疫和细胞免疫功能来消除HSV感染。至今已研制了多种HSV疫苗，已有两种HSV糖蛋白疫苗进入III期临床试验，即Chiron公司研制的重组gD2/gB2糖蛋白与MF59佐剂配伍而成的疫苗以及GlaxoSmithKline(GSK)公司开发的重组gD2糖蛋白与另一佐剂(3-de-0-酰化单磷酸类脂A和明矾)配伍而成的疫苗，这两种疫苗均有一定的保护作用，但临床效果有限。国内目前对HSV疫苗的研究，主要集中在DNA核酸疫苗的探索研究方面。目前认为HSV基因组有34个基因，编码70多种蛋白质，其中胞膜糖蛋白正式命名的有12种，它们以独特或复合体的形式在HSV复制循环及病毒的感染致病中发挥不同的作用。其中gD由HSV的US6基因编码，是病毒胞膜的主要成分，对于病毒与细胞稳定结合具有重要意义，促进病毒胞膜和细胞间的溶解，介导病毒的胞间扩散、释放。同时gD蛋白在病毒的复制和剌激中和抗体的产生中起重要作用，也是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要耙标之一，因此HSV2gD糖蛋白是构建HSV基因疫苗理想的目的基因。HSV2病毒gD糖蛋白基因全长1185bp，编码312个氨基酸序列的胞外区、54个氨基酸序列的跨膜区、28氨基酸序列的胞内区。研究表明，为增强编码抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性编码序列，特别在完整抗原蛋白对宿主具有毒性或免疫抑制作用的情况下，对抗原蛋白进行截短表达就尤其重要。而截短后的gD基因构建的疫苗，与用完整gD基因构建的疫苗对HSV2病毒攻击具有相同的保护作用。
发明内容本发明目的针对上述不足之处提供一种化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用，是化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基3因工程技术，制备重组HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸到第286个氨基酸，共286个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV2病毒单抗和多抗等。化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实施的1.HSV2病毒gD糖蛋白胞外区抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV2病毒gD糖蛋白的氨基酸序列，发现gD糖蛋白的N端(第l氨基酸到第286氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了HindIII酶切位点(下画线部分)，转录调控序列(GCCGCCACC)，起始密码子(ATG)，人IgGk轻链信号肽(波浪线部分)，8XHis标签及TEV蛋白酶酶切位点(gaaaacctgtacttccagggt)，在3'端增加了终止密码子(TAA)和BamHI酶切位点(下画线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒pCEP4内的HindIII和BamHI酶切位点内，并且使gD蛋白更易于表达和纯化。筛选的HSV2病毒gD糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第l个氨基酸到第286个氨基酸):LysTyrAlaLeuAlaAspProSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAsnLeuProValLeuAspGinLeuThrAspProProGlyValLysArgValTyrHislieGinProSerLeuGluAspProPheGinProProSerlieProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuHisAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerAspGluAlaArgLysHisThrTyrAsnLeuThrlieAlaTrpTyrArgMetGlyAspAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysProTyrAsnLysSerLeuGlyValCysProlieArgThrGinProArgTrpSerTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaArgAlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProAlaAlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGlnGlyValThrValAspSerlieGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslieAlaGlyTrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerAspThrThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProAlaGlyThrVal化学合成的含HSV2病毒gD糖蛋白胞外区抗原表位基因的DNA序列(987bp)AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAMCCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGMCCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCT4AGCGACGMGCCAGGAAGCACACCTACAACCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACMGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGGCC綠GCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTTCCMGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTACCGTGTAAGGATCC2.表达HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建提取质粒pCEP4，用HindIII和BamHI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用HindIII和BamHI双酶切化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4DNA连接酶连接，使HSV2病毒gD糖蛋白基因片段插入到真核质粒pCEP4内的HindIII和BamHI位点之间，构成重组真核表达载体pCEP4-gD2。3.重组质粒的筛选与鉴定将重组质粒转化大肠杆菌DH5a，涂布含氨苄青霉素(100ug/ml)LB平板，置37°C过夜。次日随机挑取转化菌落和1个对照菌(质粒pCEP4转化菌)，分别提取质粒，以提取的质粒为模板，PCR扩增HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段，含HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约987bp的基因片段。将含有外源基因的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段，序列完全lH确AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGMAACCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTMCCGCTTCAGAGGTAAGAACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGACGMGCCAGGAAGCACACCTACMCCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACAAGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTCTGACCTCCAAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTMGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGCTGGTACCGTGTAAGGATCC构建的重组质粒表达HSV2的病毒gD糖蛋白胞外区片段(286个氨基酸)，在其N端添加了8XHis标签(8个氨基酸)及TEV蛋白酶酶切位点(7个氨基酸)，全长301个氨基酸，其氨基酸序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4.重组质粒的真核转染与细胞表达上清的蛋白检测提取阳性重组质粒pCEP4-gD2，用脂质体转染法对HEK293细胞进行转染，37t:，5%C02温箱培养48小时后，收集细胞上清进行SDS-PAGE电泳检测，同时以1:10000稀释的anti-His抗体对带有His标签的蛋白的表达情况进行WesternBlot检测，转染细胞表达相对分子量约为46kDa的HSV2病毒gD重组糖蛋白，而阴性对照质粒pCEP4无此蛋白带。5.表达的HSV2病毒gD糖蛋白的纯化将Ni-S印harose6FastFlow亲和层析柱连接至常压层析系统，先用平衡液冲洗平衡，细胞上清液加Ni-S印harose6FastFlow凝胶室温结合，上柱后收集穿透液。用平衡缓冲液洗涤柱子，接着用含500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，SDS-PAGE电泳及WesternBlot检测目的蛋白。6.ELISA检测纯化的HSV2病毒gD糖蛋白的抗原性将纯化的重组蛋白用PBS倍比稀释，并将阴性对照以同样浓度稀释后包被酶联板，羊抗HSV2+HSV2多抗作为一抗，兔抗山羊IgG-HRP作为二抗，间接酶联免疫法检测纯化蛋白gD2的抗原性和特异性。结果显示(表1)表达的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。7.ELISA检测纯化的HSV2病毒gD糖蛋白的免疫原性1)HSV2病毒gD糖蛋白抗血清的制备将纯化的重组蛋白与福氏佐剂混合后分别于第1，3周腹腔注射免疫小鼠(阴性对照组注射PBS)，并于第3，5周眼眶采血。血液37。C放置lh后4。C过夜，2000rpm离心20分钟，取上清，4°C，12000rpm离心20分钟，取上清即得HSV2病毒gD糖蛋白的抗血清。2)HSV2病毒gD糖蛋白抗血清效价检测将纯化的重组蛋白用PBS按1:IOO稀释后包被酶联板，抗血清梯度稀释后作为一抗，二抗用羊抗小鼠IgG-HRP，间接酶联免疫法测抗血清效价，阳性血清能与HSV2病毒gD糖蛋白反应，阴性血清则不能。间接ELISA结果显示(表2)表达的重组蛋白具有较好的免疫原性。8.将表达的HSV2病毒gD糖蛋白片段，用于疫苗、HSV2病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV2病毒单抗和多抗等。9.将合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段与其他基因片段连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。上述方法制备的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段在制备HSV2病毒亚单位疫苗及检测试剂中的应用。化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区的基因片段，可利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。本发明与现有技术相比具有的优点1.本发明表达的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段用作抗原，制备HSV2病毒抗体的酶联免疫检测试剂盒，具有生产较安全、成本低、与其他病毒交叉反应少等优点。2.HSV2病毒的gD糖蛋白是病毒胞膜的主要成分，在病毒的复制和剌激中和抗体的产生中起重要作用，也是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶标之一，因此HSV2病毒gD糖蛋白是构建HSV疫苗理想的目的基因。本发明选择了其强抗原表位，利用基因工程技术表达制备，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗安全、成本低。3.本研究采用真核细胞表达系统，表达的蛋白产物能正确地完成折叠、磷酸化、糖基化、二硫键形成、酰基化、蛋白酶加工等蛋白质翻译后加工过程，得到的重组蛋白有较高的生物学活性。4.本发明根据筛选出的HSV2病毒的gD糖蛋白胞外区片段氨基酸序列，选用真核及原核细胞均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在N端添加人IgGk轻链信号肽，适宜在哺乳动物细胞中高表达。5.本发明构建的表达的HSV2病毒的gD糖蛋白的工程细胞，蛋白表达量高，可溶性好，易于纯化，并且具有较好的抗原性和免疫原性。以下将结合附图对本发明作进一步说明图1是表达HSV2病毒的gD糖蛋白的重组质粒构建流程图。图2是1%的Agarose凝胶检测4个重组子的PCR扩增产物。Lane1:以化学合成含HSV2病毒gD糖蛋白胞外区抗原表位基因的DNA序列为模板PCR扩增产物，阳性对照；Lane2:以空质粒pCEP4为模板PCR扩增产物，阴性对照；Lane3-6:1-4号转化子PCR扩增产物，其中1，2，3，4号转化子均扩增出987bp的目的基因片段，即图内箭头标示的位置；LaneM:DL2000Marker(TaKaRa)。图3是1%的Agarose凝胶检测阳性重组子的PCR扩增产物和酶切鉴定产物。Lane7M:250bpMarker(TaKaRa)Lane1:3号阳性重组子质粒电泳;Lane2:3号阳性重组子酶切鉴定产物；。图4是表达重组HSV2病毒gD糖蛋白的细胞上清WesternBlot检测。LaneM:标准分子量蛋白Marker;Lane1:Multiple-tag，阳性对照；Lane2:空质粒pCEP4转染的细胞上清，阴性对照；Lane3:转染重组质粒pCEP4-gD2的细胞上清。图5是纯化的重组HSV2病毒gD糖蛋白WesternBlot检测。LaneM:标准分子量蛋白Marker;Lane1:纯化后的重组HSV2病毒gD糖蛋白；Lane2:空质粒pCEP4转染的细胞上清，阴性对照。具体实施例方式本发明实施方式的详细说明HSV2病毒的gD糖蛋白抗原表位的分析、基因合成及载体构建通过计算机分析HSV2病毒的gD糖蛋白的全部氨基酸序列，筛选出HSV2病毒gD糖蛋白内的强抗原表位，选用原核及真核均偏爱的密码子，化学合成HSV2病毒的gD糖蛋白含强抗原表位的全新基因片段。将基因片段克隆至质粒pCEP4内的HindIII/BamHI位点，构建重组真核表达载体pCEP4-gD2。材料与方法1.菌种与质粒大肠杆菌DH5a及真核表达载体pCEP4由本实验室保存。2.试剂和仪器PrimerSTARHSDNAPolymerase,dNTP，HindIII，BamHI，T4DNA连接酶，质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为TaKaRa公司产品。TAE电泳缓冲液、SDS-PAGE蛋白电泳试剂等由本室配制(配方参考《精编分子生物学实验指南》)。PCR扩增仪；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；琼脂糖凝胶电泳装置；蛋白电泳装置(Bio-Rad公司)；脱色摇床(江苏兴化市分析仪器厂)。3.基因片段的合成由公司帮助合成。4.表达HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段重组质粒的构建提取质粒pCEP4，用HindIII和BamHI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内。同样用HindIII和BamHI双酶切化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内。取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4DNA连接酶连接，使HSV2病毒gD糖蛋白基因片段插入到真核质粒pCEP4内的HindIII和BamHI位点之间，构成重组真核表达载体pCEP4-gD2。5.重组质粒的筛选与鉴定将上步连接的重组质粒转化到大肠杆菌DH5a，将转化产物涂布含氨苄青霉素(100ug/ml)的固体LB培养基上，置37t:培养过夜。次日随机挑选4个转化子菌落(分别标记为1-4号)和1个对照菌(质粒pCEP4转化菌)，分别接种到含3ml液体LB培养基(含氨苄青霉素100ug/ml)的试管内，置37t:振荡培养5小时，取菌液lml，离心收菌。分别用50ul去离子水悬浮菌体，沸水煮5分钟，4t:，12000rpm离心5分钟，取上清8(内有质粒)2ul用作PCR模板，PCR扩增插入载体内的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段，PCR反应浓度为质粒模板2ul、HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段的正链引物PI(GCAAGCTTGCCGCCACCATGGAA)和负链引物P2(GCGGATCCTTACACGGTACCAGCAGGGTC)各lul、10Xpyrobestbuffer2.0ul、2.5mmol/LdNTP2.Oul、PrimerSTARHSDNA聚合酶0.5ul(1.25U)、去离子水11.5ul，总体积20ul。扩增条件为98。C预变性1分钟，98。C10秒、55t:10秒、72t:l分钟，30个循环，最后72t:延伸7分钟。取PCR扩增产物5ul，用1.0%的Agarose凝胶检测，阳性转化子应能扩增出9S7bp的目的片段，而空质粒转化菌无此带。用HindIII和BamHI酶双酶切，重组质粒酶切产物应切处981bp的基因条带。6.DNA序列分析用QIAGEN公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。结果1.HSV2病毒的gD糖蛋白抗原表位筛选及基因片段的合成利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV2病毒的gD糖蛋白的全部氨基酸序列(GeneBank，登录号NP_044536)，筛选出HSV2病毒的gD糖蛋白内的强抗原表位，即从第1个氨基酸到第286个氨基酸，其氨基酸序列如下LysTyrAlaLeuAlaAspProSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAsnLeuProValLeuAspGinLeuThrAspProProGlyValLysArgValTyrHislieGinProSerLeuGluAspProPheGinProProSerlieProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuHisAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerAspGluAlaArgLysHisThrTyrAsnLeuThrlieAlaTrpTyrArgMetGlyAspAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysProTyrAsnLysSerLeuGlyValCysProlieArgThrGinProArgTrpSerTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaArgAlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProAlaAlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGlnGlyValThrValAspSerlieGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslieAlaGlyTrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerAspThrThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProAlaGlyThrVal根据筛选的HSV2病毒gD糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5'端增加了HindIII酶切位点(下画线部分)，转录调控序列(GCCGCCACC)，起始密码子(ATG)，人IgGk轻链信号肽(波浪线部分)，8XHis标签及TEV蛋白酶酶切位点(gaaaacctgtacttccagggt)，在3，端增加了终止密码子(TAA)和BamHI酶切位点(下画线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒pCEP4内的HindIII和BamHI酶切位点内，并且使gD蛋白更易于表达和纯化。化学合成的含HSV2病毒gD糖蛋白抗原表位基因的DNA序列(987bp)如下AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAMCCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGMCCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGMGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTAC'GCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGACGMGCCAGGAAGCACACCTACAACCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACMGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTCTGACCTCCAAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACQVGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGCTGGTACCGTGTAAGGATCC2.表达HSV2病毒gD糖蛋白胞外区截短形式片段重组质粒的构建将目的基因克隆到pCEP4载体的HindIII和BamHI酶切位点之间，构成重组真核表达载体pCEP4-gD2。(构建流程见图1)。3.重组质粒的筛选与鉴定第1、2、3、4号4个转化子扩增出987bp的目的基因片段，而含质粒pCEP4的对照菌没有扩增出该基因片段(见图2)。提取3号重组子的质粒，用HindIII和BamHI酶双酶切，酶切产物出现981bp的目的基因条带，与预期大小相符(见图3)。提取3号重组子的质粒，测定质粒内的HSV2病毒gD糖蛋白基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有合成的HSV2病毒gD糖蛋白基因片段，序列完全正确:AAGCTTGCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACATCATCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAGGGTAAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGMCCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGACGAAGCCAGGAAGCACACCTACAACCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACAAGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTCTGACCTCCMGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGMGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGCTGGTACCGTGTAA构建的重组质粒表达HSV2的病毒gD糖蛋白片段(286个氨基酸)，在其N端添加了8XHis标签(8个氨基酸)及TEV蛋白酶酶切位点(7个氨基酸)，全长301个氨基酸，其氨基酸序列如下HisHisHisHisHisHisHisHisGluAsnLeuTyrPheGinGlyLysTyrAlaLeuAlaAspProSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAsnLeuProValLeuAspGlnLeuThrAspProProGlyValLysArgValTyrHislieGinProSerLeuGluAspProPheGlnProProSerlieProlieThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuHisAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerAspGluAlaArgLysHisThrTyrAsnLeuThrlieAlaTrpTyrArgMetGlyAspAsnCysAlalieProlieThrValMetGluTyrThrGluCysProTyrAsnLysSerLeuGlyValCysProlieArgThrGlnProArgTrpSerTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPhelieLeuGluHisArgAlaArgAlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProAlaAlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlleGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslleAlaGlyTrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerAspThrThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProAlaGlyThrVal重组质粒的真核转染、细胞表达上清的蛋白检测与纯化提取阳性重组质粒pCEP4-gD2，用脂质体转染法对HEK293细胞进行转染。收集细胞上清，根据表达HSV2病毒gD糖蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。我们所表达的HSV2病毒gD糖蛋白在N端添加了8XHis标签，可很方便用镍琼脂糖凝胶分离，因此我们决定采用亲和层析法，用NiS印harose6FastFlow凝胶进行纯化。具体步骤如下材料和方法1.主要试剂Lipofectamine2000为invitrogen公司产品，NiS印harose6FastFlow凝胶为GEHeathcare公司产品，小鼠抗His单抗、羊抗小鼠IgG-HRP为金斯特公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。2.重组质粒pCEP4-gD2真核转染转染前一天以0.5-2X107孔的密度接种HEK293细胞至24孔板，37°C，5%C02温箱培养过夜，使其达到孔底面积90-95%时进行转染。取重组质粒pCEP4-gD25ul(200ng/ul)稀释于50ul无血清DMEM培养基中(设对照空质粒pCEP4)，温和混匀。取Lipofectamine20002ul稀释于50ul无血清DMEM培养基中，温和混匀，室温静置5分钟。将稀释的重组质粒和脂质体温和混匀，室温静置20分钟后加入到含有HEK293细胞的24孔板中，100ul/孑L温和混匀，37°C，5%C02温箱培养48小时后，收集细胞上清进行检测。3.WesternBlot检测表达重组HSV2病毒gD糖蛋白的细胞上清收集转染细胞上清进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜湿转，100V，1小时，4。C封闭过夜(5%milk-PBST)。PBST洗膜3次，每次10分钟，小鼠抗His单抗(lmg/ml)l:10000稀释11于封闭液中，室温孵育2小时，洗膜3X10分钟，羊抗小鼠IgG-HRP1:10000稀释于封闭液中，室温孵育1小时，洗膜3X10分钟，加发光底物反应3分钟，暗室中压片曝光。4.重组HSV2病毒gD糖蛋白的纯化上清溶液加已经平衡的NiS印harose6FastFlow凝胶3ml，混匀后4°C结合过夜，上样，收集穿透液。用十倍柱床体积的平衡液(IXPBS，O.5mol/LNaCl+，20mmo1/Limidazole,pH7.4)洗涤柱子，接着将lml洗脱液(1XPBS，0.5mol/LNaCl，500mmol/Limidazole,pH7.4)加入胶体中，静置20分钟后洗脱目的蛋白，即为纯化的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段。5.WesternBlot检测纯化的重组HSV2病毒gD糖蛋白对纯化的重组HSV2病毒gD糖蛋白进行12%SDS-PAGE胶电泳，19mA，80分钟。PVDF膜湿转，IOOV，1小时，4t:封闭过夜(5%milk-PBST)。PBST洗膜3次，每次10分钟，小鼠抗His单抗(lmg/ml)1:10000稀释于封闭液中，室温孵育2小时，洗膜3X10分钟，羊抗小鼠IgG-HRPl:10000稀释于封闭液中，室温孵育1小时，洗膜3X10分钟，加发光底物反应3分钟，暗室中压片曝光。结果1.WesternBlot检测表达重组HSV2病毒gD糖蛋白的细胞上清经重组质粒转染的HEK293细胞明显表达出重组HSV2病毒gD糖蛋白，表达产物以可溶性形式存在于细胞上清中，分子量约46kDa，与预期大小相符。结果表明，重组HSV2病毒gD糖蛋白表达成功(见图4)。2.WesternBlot检测纯化的重组HSV2病毒gD糖蛋白将从NiS印harose6FastFlow凝胶柱上洗脱的蛋白进行WesternBlot分析，蛋白带分子量约46kDa，与预期大小相符。结果表明，重组HSV2病毒gD糖蛋白纯化成功(见图5)。纯化HSV2病毒的gD糖蛋白的鉴定及应用将纯化的重组HSV2病毒gD糖蛋白抗原，通过间接ELISA试验方法检测，以鉴定表达的HSV2病毒gD糖蛋白的抗原性和特异性。再用纯化的重组HSV2病毒gD糖蛋白抗原免疫小鼠，通过间接ELISA试验方法检测小鼠血清中抗体浓度，以鉴定表达的HSV2病毒gD糖蛋白的免疫原性。材料和方法1.主要试剂及材料山羊抗HSV1+HSV2多抗为Abcam公司产品，兔抗山羊IgG-HRP为博士德公司产品，完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂为SIGMA公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。实验动物4周龄雄性昆明小鼠，SPF级，购自北京军事医学科学研究院实验动物中心。2.重组HSV2病毒gD糖蛋白的鉴定采用间接ELISA检测重组HSV2病毒gD糖蛋白的抗原性。基本步骤为用1XPBS(pH7.4)按1:25-1:400倍比稀释纯化的重组HSV2病毒gD糖蛋白，包被酶联板(阴性对照取正常HEK293细胞上清)，每孔100ul，4t:过夜。次日用封闭液(1XPBS，1%小牛血清)封闭，每孔130ul，室温2小时。将山羊抗HSV1+HSV2多抗，用样本稀释液(1XPBS，o.1%小牛血清)1:500稀释后，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔iooui，37t:反应i小时，用PBST液(IXPBS，O.5%吐温-20)洗5遍后，加1:40000稀释的兔抗山羊IgG-HRP，每孔100ul，37。C反应30分钟，PBST洗5遍，加底物TMB溶液，每孔100ul，37。C避光显色10分钟，每孔加50ul1N盐酸终止反应，用酶联仪测定A450值。3.HSV2病毒gD糖蛋白抗血清的制备将纯化的重组HSV2病毒gD糖蛋白与福氏佐剂等体积混合后分别于第1，3周(第1周用完全福氏佐剂，第3周用不完全福氏佐剂)腹腔注射免疫小鼠，1.25ug/只/次(阴性对照组注射等体积PBS)，并于第3，5周眼眶采血。血液37t:放置1小时后fC过夜，2000rpm离心20分钟，取上清，4°C，12000rpm离心20分钟，取上清即得HSV2病毒gD糖蛋白的抗血清。4.HSV2病毒gD糖蛋白抗血清效价检测采用间接ELISA检测重组HSV2病毒gD糖蛋白的免疫原性。基本步骤为用1XPBS按l:100稀释纯化的重组HSV2病毒gD糖蛋白，包被酶联板，每孔100ul，4t:过夜。次日用封闭液封闭酶联板，每孔130ul，室温2小时。将抗血清用样本稀释液按l:50，1:500，1:5000稀释后，分别加至封闭后的酶联板孔内，每孔100ul，37t:反应l小时，用PBST洗5遍后，力口l:IOOOO稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100ul，37。C反应30分钟，PBST洗5遍，加底物TMB溶液每孔100ul，37t:避光显色10分钟，加50ul1N盐酸终止反应，用酶联仪测定A450值。阳性血清应能与HSV2病毒gD糖蛋白反应，阴性血清则不能。结果1.重组HSV2病毒gD糖蛋白抗原性鉴定用间接ELISA法检测纯化的重组蛋白的抗原性，结果显示(表l)蛋白浓度与其OD值之间有良好的线性关系，说明表达的重组HSV2病毒gD糖蛋白有较好的抗原性和特异性。2.重组HSV2病毒gD糖蛋白免疫原性鉴定用间接ELISA法检测纯化的重组蛋白的免疫原性，结果显示(表2)第一次免疫后抗体水平较低，第二次免疫后抗体水平明显上升，第三次免疫后抗体水平与第二次持平，说明表达的重组HSV2病毒gD糖蛋白有良好的免疫原性，为的研制奠定了基础。表1表达蛋白抗原性检测的ELISA实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段序列表〈110〉李越希〈120〉化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用〈160>2〈210>1〈211>858〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>CDS〈222〉(1).(858)〈223〉人工合成的全新基因片段，编码含强抗原表位的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区286个氨基酸片段。〈400〉1MGTAGGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAG60MCCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATT120CAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCC180GTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATC240GTGAGAGGTGCTAGCGACGAAGCCAGGAAGCACACCTACMCCTGACCATCGCCTGGTAC300AGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTAC360MCMGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGC420TTCAGCGCTGTGAGCGAGGACMCCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACC■GCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATC540CTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCC600GCTTGTCTGACCTCCMGGCCTACCAGCMGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTG660CCTCGCTTCATCCCTGAGMCCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGMGATCGCTGGC720TGGCACGGTCCTAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACC780ACCMCGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAG840GACCCTGCTGGTACCGTG0136]〈210〉2:0137]<211>2860138]〈212>PRT:0139]〈213〉HSV2病毒gD蛋白胞外区片段:0140]〈220〉:0141]〈223〉含强抗原表位的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸_第286个氨基酸，共286个氨基酸。:0142]0143]GlyLys0144]200145]Hislie0146]40:0147]TyrAla:0148]60:0149]Ginlie:0150]800151]TrpTyr0152]000153]ProTyr0154]20:0155]AspSer:0156]400157]GluThr〈400>2LysTyrAlaLeu1AsnLeuProVal21GinProSerLeu41ValLeuGluArg61ValArgGlyAla81ArgMetGlyAsp101AsnLysSerLeu121Phe141SerAlaValAlaAspProSerLeuLysMetAlaAsp510LeuAspGinLeuThrAspProProGly2530GluAspProPheGinProProSerlie4550AlaCysArgSerValLeuLeuHisAla6570SerAspGluAlaArgLysHisThrTyr8590AsnCysAlalieProlieThrValMet105110GlyValCysProlieArgThrGinPro125130SerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMet145150ProAsnArgPheArg15ValLysArgValTyr35ProlieThrValTyr55ProSerGluAlaPro75AsnLeuThrlieAla95GluTyrThrGluCys115ArgTrpSerTyrTyr135HisAlaProAlaPhe155160Phelie180ProAla200MetLeu220AlaGly240AspThr260LeuGlu280AlaGlyThrTyrLeuArg161165LeuGluHisArgAlaArg181185LeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGin170175AlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArgliePro190195AlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlieGly201205210215ProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslie221225230235TrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSer241245250255ThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeu261265AspProAlaGlyThrVal28127027权利要求一种化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的HSV2病毒的gD糖蛋白胞外区片段，即第1个氨基酸至第286个氨基酸，共286个氨基酸，化学合成的基因序列全长858bp，序列如下AAGTACGCTCTGGCCGATCCTAGCCTGAAGATGGCTGATCCTAACCGCTTCAGAGGTAAGAACCTGCCTGTGCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCTGGCGTGAAGAGAGTGTACCACATTCAGCCTAGCCTGGAGGACCCTTTCCAGCCTCCTAGCATTCCTATCACCGTGTACTACGCCGTGCTGGAGAGAGCCTGTCGCAGCGTGCTGCTGCACGCTCCTAGCGAGGCTCCTCAGATCGTGAGAGGTGCTAGCGACGAAGCCAGGAAGCACACCTACAACCTGACCATCGCCTGGTACAGGATGGGTGACAACTGTGCTATCCCTATCACCGTGATGGAGTACACCGAGTGTCCCTACAACAAGAGCCTGGGCGTGTGTCCTATCCGCACCCAGCCTAGGTGGAGCTACTACGACAGCTTCAGCGCTGTGAGCGAGGACAACCTGGGCTTCCTGATGCACGCTCCTGCCTTCGAGACCGCTGGCACCTACCTGAGGCTGGTGAAGATCAACGACTGGACCGAGATCACCCAGTTCATCCTGGAGCACAGAGCCAGAGCCAGCTGTAAGTACGCTCTGCCTCTGAGAATCCCTCCTGCCGCTTGTCTGACCTCCAAGGCCTACCAGCAAGGCGTGACCGTGGACAGCATCGGTATGCTGCCTCGCTTCATCCCTGAGAACCAGAGGACCGTGGCTCTGTACAGCCTGAAGATCGCTGGCTGGCACGGTCCTAAGCCTCCTTACACCAGCACTCTGCTGCCTCCTGAGCTGAGCGACACCACCAACGCCACTCAGCCTGAGCTGGTGCCTGAGGACCCTGAGGACAGCGCTCTGCTGGAGGACCCTGCTGGTACCGTG。2.权利要求1所述的化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达，制备HSV2病毒的gD糖蛋白胞外区286个氨基酸蛋白片段，序列如下LysTyrAlaLeuAlaAspProSerLeuLysMetAlaAspProAsnArgPheArgGlyLysAsnLeuProValLeuAspGinLeuThrAspProProGlyValLysArgValTyrHislieGinProSerLeuGluAspProPheGinProProSerlieProlleThrValTyrTyrAlaValLeuGluArgAlaCysArgSerValLeuLeuHisAlaProSerGluAlaProGinlieValArgGlyAlaSerAspGluAlaArgLysHisThrTyrAsnLeuThrlieAlaTrpTyrArgMetGlyAspAsnCysAlaIleProlieThrValMetGluTyrThrGluCysProTyrAsnLysSerLeuGlyValCysProlieArgThrGinProArgTrpSerTyrTyrAspSerPheSerAlaValSerGluAspAsnLeuGlyPheLeuMetHisAlaProAlaPheGluThrAlaGlyThrTyrLeuArgLeuValLyslieAsnAspTrpThrGlulieThrGinPheIleLeuGluHisArgAlaArgAlaSerCysLysTyrAlaLeuProLeuArglieProProAlaAlaCysLeuThrSerLysAlaTyrGinGinGlyValThrValAspSerlleGlyMetLeuProArgPhelieProGluAsnGinArgThrValAlaLeuTyrSerLeuLyslieAlaGlyTrpHisGlyProLysProProTyrThrSerThrLeuLeuProProGluLeuSerAspThrThrAsnAlaThrGinProGluLeuValProGluAspProGluAspSerAlaLeuLeuGluAspProAlaGlyThrVal。3.权利要求2所述方法制备的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段在制备HSV2病毒疫苗及检测试剂中的应用。全文摘要本发明化学合成的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒gD糖蛋白胞外区片段，第1个氨基酸至第286个氨基酸，共286个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术表达该基因片段、制备HSV2病毒gD糖蛋白的强抗原表位片段及HSV2病毒gD糖蛋白的抗血清。表达的HSV2病毒gD糖蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV2病毒单抗和多抗等。文档编号G01N33/53GK101787371SQ20091003467公开日2010年7月28日申请日期2009年9月7日优先权日2009年9月7日发明者李琳,李素芹,李越希,潘明洁,潘英,王忠灿,王正茂,管文燕申请人:李越希